汉逊酵母表达乙肝表面抗原的结构研究

目的 解析汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原(HBsAg)的空间结构,给出其颗粒大小、结构对称性方面的信息.方法 整合adr 亚型 HBsAg的基因到汉逊酵母染色体上,建立重组汉逊酵母菌.经过发酵扩菌、诱导表达、精制纯化等步骤得到纯化的HBsAg.滴加5μl浓度为80 μg/mlHBsAg溶液到亲水处理的纯碳膜铜网上,用2%醋酸铀染色,放置24 h后,通过透射电镜得到汉逊酵母表达HBsAg颗粒的二维电镜图像.运用EMAN软件包完成图像选择、颗粒框取、颗粒全同性处理、初始模型构建和结构精修等HBsAg重构步骤,获得HBsAg颗粒的三维结构.结果 汉逊酵母表达HBsAg颗粒大小服从高斯分布(P=0.45),均值为(28.4.±2.6)nm;汉逊酵母表达HBsAg是-中空的"鱼笼"状结构,蛋白亚基分布在球状结构的表面;蛋白的表面分布大小为1～2 nm的孔状结构和围绕孔状结构的突起;不具备八面体对称性.结论 汉逊酵母表达的 HBsAg与血源性的 HBsAg 在大小和结构对称性方面都有显著差异.

米非司酮对人羊膜上皮细胞水通道蛋白8表达的影响

目的 观察米非司酮对人羊膜上皮细胞水通道蛋白 8(AQP8)表达的影响,探讨药物调控羊膜上皮细胞AQP8表达的可行性.方法 将体外培养的人羊膜上皮WISH细胞分为不同浓度米非司酮作用48 h组和单一浓度米非司酮作用不同时间组,前者培养基中分别加入终浓度为0.1、1、5、10、15μmol/L的米非司酮,培养48 h;后者培养基中加入终浓度为10 μmol/L的米非司酮,分别培养6、12、24、36、48 h,同时2组均设加入含0.01%二甲基亚砜(DMSO)完全培养液的对照组.采用免疫荧光细胞化学方法检测10 μmol/L米非司酮作用48 h后细胞AQP8蛋白的分布;RT-PCR和蛋白质印迹技术分别检测不同浓度米非司酮作用组和米非司酮作用不同时间组各组细胞AQP8 mRNA和蛋白的表达水平.结果 免疫荧光细胞化学检测显示,米非司酮作用后WISH细胞细胞质内及细胞膜上AQP8蛋白黄绿色荧光信号较对照组均明显减弱.在不同浓度米非司酮作用组中,除O.1 μmol/L 组外,其余各组细胞的 AQP8 mRNA和蛋白表达水平分别与对照组相比均明显减弱(均P

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究

目的 探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体,小鼠热休克蛋白70(6B11ScFv/mHSP70)融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其佳体外复性条件.方法 大肠杆菌表达大量融合蛋白6B11ScFv/mHSP70:①比较不同的裂解液(8 mol/L 尿素和6 mol/L 盐酸胍)对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度 L-精氨酸对蛋白稀释复件的影响;③比较稀释复性和柱上复性对融合蛋白复件效率及活性的影响.采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度.所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法.结果 以包涵体形式表达6B11ScFv/mHSP70蛋白:①经6 mol/L 盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8 mol/L 尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6 mol/L 盐酸胍彻底裂解的包涵体经8 mol/L 尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0.5 mol/L L-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSH)浓度比为1:5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低.结论 本研究建立了6B11ScFv/mHSP70融合蛋白的佳复性条件:包涵体经6 mol/L 盐酸胍彻底裂解后,再经8 mol/L 尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0.5 mol/L L-精氨酸和GSH:GSSH=1:5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.

Survivin-2B在肿瘤细胞凋亡过程中的作用研究

目的 探讨肿瘤细胞凋亡过程中survivin-2B的作用机制.方法 通过流式细胞仪分析survivin-2B对肿瘤细胞周期的影响;利用激光共聚焦显微镜观察通过青色荧光蛋白(CFP)标记的survivin-2B和罗丹明123标记的线粒体在细胞内的定位及在细胞凋亡过程中的变化;采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法分析survivin-2B和survivin-ΔEx3 在细胞内的相互作用.结果 流式细胞仪分析结果表明,Survivin-2B能够明显抑制肿瘤细胞生长,促使细胞凋亡增加:通过激光共聚焦显微镜观察到凋亡早期survivin-2B聚集在细胞发生固缩的部位,且在肿瘤凋亡过程中不存在明显的线粒体定位及与线粒体的相关性;FRET分析显示survivin-2B与survivin-ΔEx3 在细胞质中存在很弱的相互作用.结论 Survivin-2B能够明显促进肿瘤细胞凋亡,且survivin-2B通过与survivin-ΔAEx3 直接结合以阻断其抗凋亡效应的可能性较小.

诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的实验研究

目的 建立一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的技术方法.方法 体外诱导人胚胎胰腺干细胞分化为胰岛细胞,将胰岛细胞制备成浓度分别为1×10~4/ml、3×10~4/ml、1×10~5/ml、3×10~5/ml(1×10~4/ml、3×10~4/ml、1×10~5/ml、3×10~5/ml组)单细胞悬液,在含有细胞外基质(ECM)的培养基中悬浮培养24 h以诱导形成胰岛样结构,在荧光体视显微镜下观察胰岛样结构的形态和大小;采用免疫荧光染色方法检测胰岛样结构中.ECM成分及其细胞组成与定位.将胰岛样结构分别在含5.6和30.0 mmol/L葡萄糖的培养基中体外培养2 h,采用放射免疫法测定上清中胰岛素水平.建立糖尿病人鼠模型,经门静脉将胰岛样结构移植至大鼠肝脏,移植后连续3 d经鼠尾静脉检测血糖水平.结果 90%人胚胎胰腺干细胞分化的胰岛细胞形成了胰岛样结构,其包膜、大小均与天然人胰岛组织结构相似;以形成直径150μm大小胰岛样结构的比例为标准,比较各组细胞浓度与胰岛样结构形成率的关系,结果显示分别与1×104/ml、3×10~4/ml、3×10~5/ml组(25.0%±2.5%、28.0%±3.0%、21.5%±2.5%)相比,1×10~5/ml组胰岛样结构形成率佳(36.5%±4.0%,均P<0.01).胰岛样结构包膜上含有与天然人胰岛组织类似的ECM成分,且其中含有胰岛素、胰高血糖素和 C-肽阳性细胞,其细胞比例与分布均与天然人胰岛组织类似.30.0 mmol/L高糖浓度刺激后胰岛样结构胰岛素释放水平[(110±12)μIU/ml]较5.6 mmol/L基础糖浓度[(59.5±8.0)μIU/ml]明显增加(P<0.01),胰岛样结构移植后糖尿病大鼠血糖水平较移植前均明显降低(P<0.01).结论 本研究建立的技术方法可以将干细胞分化的胰岛细胞在体外大量、快速、高效地诱导形成具有功能的胰岛样结构.

自体CD3AK细胞过继免疫治疗晚期恶性肿瘤的临床观察

目的 观察抗CD3单克隆抗体(anti-CD3 mAb)激活的杀伤细胞(CD3AK)过继免疫治疗晚期恶性肿瘤的疗效.方法 从51例恶性肿瘤患者自体外周血分离单个核细胞,加入anti-CD3 mAb、重组人IL-2(rML-2)体外诱导后扩增培养,制备自体CD3AK 细胞.待细胞培养至第10～12天时取样用于质控检测.收集质控检测合格的CD3AK细胞,调整至终浓度为(4.O～6.0)×10~9/L 静脉回输至患者体内,每例患者治疗3个疗程,每疗程回输5次(每2 d回输1次),每次回输细胞数不低于1×10~9,每疗程回输细胞总数大于5×10~9.应用人T细胞亚群检测试剂盒和流式细胞仪测定治疗前后患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞以及CD16+56+细胞(NK细胞)比例;观察治疗前后患者的相关化验指标、生活质量以及不良反应;评定疗效,计算有效率和临床受益率.结果 分离制备的 CD3AK 细胞符合理想活性细胞质量要求,可用于进一步实验治疗.CD3AK 细胞过继免疫治疗后,患者外周血 CD3+、CD4+、CD8+T细胞以及CDl6+56+细胞(NK细胞)比例分别为(48.88±9.42)%、(35.09±4.11)%、(28.17±4.97)%、(20.31±6.98)%]均显著升高(均P<0.05).51例患者中,45例患者治疗后全身症状改善明显;所有患者治疗后相关化验指标均未出现异常变化,也未出现其他全身毒副反应;其中完全缓解6例、部分缓解14例、微效11例、稳定12例、进展8例,总有效率达60.8%,临床受益率达84.3%.结论 CD3AK 细胞过继免疫治疗恶性肿瘤疗效确切、安全且无副作用,能有效改善和提高患者的机体免疫功能.

高分辨率熔解曲线小扩增子法结合混样法在线粒体13928G>C突变分析中的应用

目的 探讨高分辨率熔解曲线(high rgsolution meltjng,HRM)技术在线粒体13928G>C突变分析中应用的可行性.方法 在PCR前,体系中加入饱和染料、高温寡核苷酸内参(96℃)、低温寡核苷酸内参(60℃)和与待测样本等体积的已知基因型为GG的模板进行混样扩增,运用HRM技术对定量DNA的PCR产物进行基因分型,并从中随机抽取20例进行测序验证.结果 930例样本中野生型GG占728例,突变型CC占202例;DNA定量有助于HRM分析时对分型结果的判断;同时联合运用高、低温内参比只用一种内参分型效果好;随机抽取的20例样本的测序结果与HRM分型结果相一致.结论 运用高分辨率熔解曲线小扩增子法结合混样法可对线粒体基因组13928G>C突变进行准确分型.

透明质酸的制备及作为药用材料方面的应用进展

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种独特的线性大分子黏多糖,由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成.HA广泛存在于动物和人体结缔组织细胞间质中,在眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和关节滑液中含量较高,血清中含量低.

丝素蛋白作为药物缓释载体的研究进展

药物缓释体系有利于提高药物疗效、降低毒副作用,可减轻病人多次用药的痛苦,对于提高临床用药水平具有重大意义[1],是近年来国际范围内研究的热门的领域之一.在药物缓释体系中,除药物本身外,药物载体也扮演着重要角色,合成高分子载体常常生物相容性不好,有时还含有痕量引发剂等毒性杂质,例如在聚乳酸的一般生产方法中使用了有机锡催化剂,会产生细胞毒性[2].

未折叠蛋白反应的信号通路

对于真核细胞来说,内质网(endoplasmic reticulum,ER)承担新生蛋白质的折叠、组装和转运.内质网的蛋白折叠机制对了解疾病的发展过程和治疗提供了新的方向,成为当下研究的热点.

环糊精及其衍生物在纳米粒中的应用

环糊精(cyclodextrin,CD)自1891年发现至今,已经成为药剂学研究中的重要载体材料之一.环糊精为6～12个D-葡萄糖分子以1～4糖苷键连接的环状低聚糖化合物,具有一个环外亲水、环内疏水,并且有一定尺寸的立体于性窄腔,可以包合尺寸合适的客分子~([1]).

液体表面张力对滴丸成形的影响

滴丸是由药物和固体载体(基质)加热熔融成溶液、混悬液或乳浊液后,滴入不相混溶的冷凝液中,在界面张力作用下,使液滴收缩,并冷凝成固态而得到的丸剂.影响滴丸成形的因素,主要有以下几个方面:①载体和药物的性质与比例:②药物与载体混合物的熔融温度;③固化成形的冷凝温度;④不同液相的黏度、密度和表面张力等流体力学参数.其中表面张力、黏度和密度作为液体的主要物性参数,是影响滴丸成形的根本因素.特别是表面张力,作为分子内聚力的表现,是滴丸成形的前提.本文就相关问题进行综述和讨论.

中国医药生物技术协会生物医学信息技术分会在北京成立

中国医药生物技术协会组织生物样本库分会筹备会在上海召开

　中国医药生物技术协会组织生物样本库分会筹备会于2009年8月29日在生物芯片上海国家工程研究中心召开.著名分子肿瘤学家顾健人院士、生物芯片国家工程研究中心主任赵国屏院士、中国医药生物技术协会彭玉理事长、卫生部科技司技术处吴沛新处长、生物芯片国家工程研究中心董事长华裕达先生、上海市科委副巡视员施强华先生、浦东新区科委副主任张爱平教授受邀出席了本次会议.

如何用SAS软件正确分析生物医学科研资料VI.用SAS软件实现随机区组设计定量资料的统计分析

生物统计学是生物学领域科学研究和实际工作中必不可少的工具,在分子生物学迅速发展的今天,生物统计学更显示出了它的重要性.实验设计与数据统计分析是现代生物学的基石,是生物学研究者检验假说、寻找模式,建立生物学理论的有利工具,也是生物学研究者探索微观和宏观生物世界的必备基础知识.对于每天甚至是每时每刻涌现的大量的、以天文数字计量的分子遗传数据,必须借助统计学知识加以分析处理,才能从中获得有意义的信息.

端粒-端粒酶与诺贝尔奖

2009年10月5日,北京时间17时30分,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会在瑞典卡罗林斯卡医学院宣布,将2009年度生理学或医学奖授予美国加利福尼亚旧金山大学的伊丽莎白-布莱克本(Elizabeth Blackburn)、美国巴尔的摩约翰-霍普金斯大学医学院的卡罗尔-格雷德(Carol Greider)和美国哈佛医学院的杰克-绍斯塔克(Jack Szostak),以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理.

胰岛移植的新疗效——防止和逆转糖尿病的血管病变

现今,糖尿病已成为世界上发病率高、对人类健康威胁为严重的疾病之一.糖尿病患者由于产生胰岛素障碍或胰岛素不能完全发挥生理作用而引起糖代谢紊乱,导致一系列血管病变及其并发症,如动脉粥样硬化、肢体缺血坏死、视网膜病变和肾功能衰竭.

对提高我国药物研究、开发及生产的国际竞争力的思考

近十几年来,随着改革开放的深入,我国的医药行业进入一个持续发展的黄金阶段.我国约物生产的年均销售总额从1996年的43亿美元(世界第11位)到2000年的68亿美元(世界第7位)和近年的超过100亿美元~([1]),远远高于国内其他行业的发展速度.