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人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定
目的对原核体系表达的 CaMKKβ蛋白体外活性进行探索，为针对 CaMKKβ、AMPK 药物研发提供科研基础。
方法克隆人 CaMKKβ基因，建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ，将其转化入 E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内，在16℃、0.02 mmol/L IPTG 条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白，Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白，并利用 Glo?Max Assay 方法检测其活性。
结果通过基因测序表明 pET28a-CaMKKβ质粒构建成功；重组人 CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高，Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上，活性检测结果表明，大肠杆菌体系内表达的人 CaMKKβ蛋白在 CaM/Ca2+存在与否情况下，酶活基本一致。
结论成功构建原核表达载体 pET28a-CaMKKβ，实现重组人 CaMKKβ在原核体系内可溶性表达，活性测定表明原核体系内表达的 CaMKKβ自主酶活性较强，受 CaM/Ca2+影响较小。关键词： 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 腺苷酸活化蛋白激酶 色谱法 亲和 CaM/Ca2+ -
血管性痴呆大鼠突触后致密物质变化机制的研究
目的 观察血管性痴呆(VaD)大鼠N-甲基D-天冬氨酸受体(NMDAR)的2B亚基(NR2B)和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)的变化情况,探讨其在VaD发生、发展中的作用.方法 将96只Wistar大鼠随机分为假手术组(32只)、VaD模型组(模型组,32只)和美金刚治疗组(治疗组,32只).采用永久性结扎双侧颈总动脉方法制备VaD大鼠模型.用RT-PCR法检测术后4、8、12、16周大鼠海马NR2B mRNA的表达,用γ-32P掺入法检测大鼠海马CaMKⅡ的活性.结果 与假手术组比较,模型组海马NR2B mRNA水平术后4周时明显增高(P＜0.05),术后8～16周显著降低(P＜0.01),海马总CaMKⅡ活性术后4周时明显增高(P＜0.01),术后12周、16周明显降低(P＜0.01);治疗组术后4周时上述2项结果与假手术组差异无统计学意义,除治疗组8周时,在其他时间点,与假手术组差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);但NR2BmRNA水平于术后8周、12周明显高于模型组(P＜0.01,P＜0.05);总CaMK Ⅱ活性与模型组差异无统计学意义.结论 CaMK Ⅱ活性变化主要是NMDAR介导的,美金刚通过调节NR2B表达改善VaD大鼠认知功能,但对CaMK Ⅱ活性的影响有限.
关键词： 痴呆 血管性 受体 N-甲基D-天冬氨酸 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 美金刚 突触 认知障碍 -
应激对大鼠空间学习记忆的影响及与蛋白激酶活力的关系
目的 探讨不同时段的应激对大鼠海马依赖性空间学习记忆的影响及与海马蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活力的关系.方法 将60只雄性SD大鼠随机分为对照组、应激1次组、应激1周组、应激2周组和应激4周组,每组动物12只,其中应激模型为强迫大鼠游泳.应用Morris水迷宫(MWM)测试大鼠的空间学习记忆情况,采用同位素法检测蛋白激酶的活力.结果 (1)MWM实验,应激1周组在第7和第8个实验中逃避潜伏期(EL)分别为(9.8±2.8)s和(9.8±4.6)s,少于其他4组(P＜0.01);其他10个实验各组的EL相互比较,差异无统计学意义(P＞0.05);记忆保留实验中,应激4周组的EL长于对照组(P＜0.05);应激1周组大鼠60 s内穿越原平台位置的次数[(3.2±1.2)次]多于对照组[(1.8±0.5)次;P＜0.05].(2)应激1周组大鼠PKA和PKC活力[分别为(6.42±0.27)×10-2和(4.71±0.37)×10-2]高于对照组[分别为(5.53±0.49)×10-2和(1.48±0.27)×10-2;P＜0.01];应激2周组和应激4周组PKA[分别为(4.88±0.23)×10-2和(3.92±0.22)×10-2]和PKC[分别为(0.57±0.03)×10-2和(0.69±0.02)×10-2]活力则低于对照组(P＜0.01).各应激组海马CaMKⅡ的活力均明显低于对照组(P＜0.01).结论 慢性应激损害大鼠海马依赖性空间长时记忆,抑制大鼠海马PKA、PKC和CaMKⅡ的活力;短时间的重复应激选择性提高大鼠海马依赖性空间短时记忆,提高PKA和PKC活力.应激导致记忆改变可能与蛋白激酶活力变化有关.
关键词： 应激 记忆 蛋白激酶类 环AMP依赖性蛋白激酶类 蛋白激酶C 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 -
吗啡预处理对小鼠海马脑片氧-糖缺失/恢复时CaMKⅡ和NMDA受体的影响
目的 评价吗啡预处理对小鼠海马脑片氧-糖缺失/恢复时钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)膜转位及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体磷酸化的影响.方法 成年BALB/C小鼠,体重18～22 g,雌雄不拘.每次将5只小鼠同批断头取脑,制备海马脑片,随机分为5组:正常对照组(Ⅰ组)、氧-糖缺失/恢复组(Ⅱ组)、吗啡预处理组(Ⅲ组)、纳络酮+吗啡预处理组(Ⅳ组)及纳络酮预处理组(Ⅴ组).Ⅰ组脑片正常体外培养,假操作换液.Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组小鼠海马脑片分别作相应预处理30min,间隔30 min.Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组建立小鼠海马脑片体外缺血再灌注损伤模型,分别氧-糖缺失20min,氧-糖恢复2 h.各组于氧-糖缺失前即刻(T0)、氧-糖缺失20 min(T1)、氧-糖恢复1 h(T2)和2 h(T3)取若干脑片匀浆、超声粉碎、离心,分离胞浆蛋白和膜相关蛋白;部分脑片分离总蛋白,Western blot检测CaMKⅡα蛋白表达量以及NMDA受体NR1亚单位的磷酸化.结果 海马脑片在T1、T2、T3时,CaMKⅡα膜相关蛋白含量增多,同时胞浆蛋白含量减少(P＜0.05);T2、T3时,NMDA受体NR1亚单位磷酸化水平增高(P＜0.05);而吗啡预处理明显地抑制上述CaMKⅡα膜转位及NMDA受体NR1亚单位磷酸化(P＜0.05).纳络酮完全阻断吗啡预处理对CaMKⅡα膜转位及NR1磷酸化的抑制作用(P＜0.05).CaMKⅡα总蛋白表达水平未见明显变化.结论 CaMKⅡ膜转位的抑制及NMDA受体磷酸化的抑制在吗啡预处理对小鼠海马脑片缺血再灌注的脑保护作用机制中起重要作用.
关键词： 吗啡 海马 再灌注损伤 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 受体 N-甲基-D-天冬氨酸 -
脊髓钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在小鼠慢性炎性痛中的作用
目的 探讨脊髓钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在小鼠慢性炎性痛中的作用.方法 雄性ICR小鼠40只,体重20～25 g,随机分为5组(n=8),正常对照组(A组)、慢性炎性痛组(B组)、KN92组(C组)、KN93 30 nmol组(D组)和KN93 45 nmol组(E组).B组～E组均采用小鼠左足背皮下注射完全Freund佐剂(CFA)20 μl的方法 制备慢性炎性痛模型.A组皮下注射生理盐水20μl.于CFA注射后1 d和3 d时D组、E组和C组分别鞘内注射CaMKⅡ特异性抑制剂KN93 30 nmol、45 nmol 和KN92(KN93无药理活性结构类似物)45 nmol,容量均为5μl.于CFA注射前30 min(基础状态)、注射后1 d且鞘内给药前(T1)及给药后30 min(T2)、注射后3 d且鞘内给药后30 min(T3)时测定痛阈.于后1次痛阈测定结束后处死小鼠,取腰段脊髓组织采用Western blot法测定脊髓p-CaMKⅡα的表达水平.结果 与基础值和A组比较,B组、C组和D组T1～3时机械痛阈和热痛阈降低,脊髓p-CaMKⅡα表达上调;E组T1时机械痛阈和热痛阈降低,T2,3时机械痛阈、热痛阈和脊髓p-CaMKⅡα表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).与B组比较,E组T2,3时机械痛阈、热痛阈升高,脊髓p-CaMKⅡα表达下调(P＜0.05).结论 脊髓CaMKⅡ参与了小鼠慢性炎性痛的形成.
关键词： 脊髓 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 疼痛 -
大鼠血管平滑肌细胞迁移与西洛他唑的干预效应
目的:探讨西洛他唑对原代培养大鼠血管平滑肌细胞迁移能力的影响及其可能的调控作用.方法:实验于2003-03/12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.使用胶原酶消化法处理健康雄性SD大鼠,获得原代培养的鼠血管平滑肌细胞,加入终浓度为0.5 μmol/L西洛他唑培养72 h为西洛他唑组,对照组为加入等量的Dulbecco改良的Eagle培养液培养的血管平滑肌细胞.应用细胞刮伤实验和基质金属蛋白酶活性测定分析西洛他唑对原代培养血管平滑肌细胞迁移能力的影响.应用蛋白质印记杂交方法分析给药前后血管平滑肌细胞内基质金属蛋白酶2,9和细胞外信号调节激酶蛋白的表达情况.结果:①细胞刮伤实验显示,与对照组比较,西洛他唑组血管平滑肌细胞迁移能力明显受抑,迁移距离明显缩短.明胶酶活性分析发现,西洛他唑组细胞基质金属蛋白酶活性明显低于对照组.②蛋白质印迹杂交分析发现,西洛他唑可引起原代培养血管平滑肌细胞迁移能力下降.西洛他唑组细胞内基质金属蛋白酶2,9蛋白表达明显低于对照组(14.34±0.70,12.65±0.98;93.67±1.90,83.67±1.05,t=67.86,85.65,P＜0.05).③蛋白质印迹杂交分析检测显示,西洛他唑组与对照组血管平滑肌细胞内信号调节激酶1,2蛋白表达无明显差异(P＞0.05);细胞内磷酸化信号调节激酶蛋白表达明显低于对照组(20.44±0.76,83.67±1.28,t=73.67,P＜0.05).结论:西洛他唑可以有效抑制血管平滑肌细胞迁移,这种抑制作用可能与其对细胞内信号调节激酶活性的影响有关.
关键词： 四唑类 肌 平滑 血管 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 -
胃癌中DAPK基因启动子区CpG岛高甲基化的研究
目的:探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)基因高甲基化与胃癌的发生以及临床病理特征之间的联系.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)法分别检测66例胃癌患者的肿瘤组织、癌旁正常组织、手术前外周血浆以及37例术后血浆中DAPK基因启动子的甲基化状况,以20例健康人的外周血浆和胃镜活检正常胃组织作为对照.结果:胃癌组织中有66.7%(44/66)存在DAPK基因的异常甲基化,显著高于相应的癌旁正常组织[10.6%(7/66)],差异有统计学意义(P<0.001).术前外周血浆中DAPK基因甲基化阳性率为16.7%(11/66);37例同时有胃癌根治术前后血浆标本的患者中,5例术前血浆甲基化阳性,术后全部转阴.而20例健康人的外周血浆和胃镜活检组织中均未检测到该基因甲基化. 结论:DAPK基因在胃癌患者肿瘤组织和外周血浆中的高甲基化可能为胃癌的诊断以及临床预后评估提供有益的线索,手术后血浆中DAPK甲基化状态的变化可能与手术治疗有关.
关键词： 胃肿瘤 DNA甲基化 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 DAPK基因 血浆 -
局部Ang Ⅱ水平与ERK的活化在人门静脉高压症脾静脉血管病变中的作用
目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平与细胞外信号调节激酶(ERK)活化在人门静脉高压症(PHT)脾静脉血管病变中的作用及可能机制.方法 选取乙型肝炎感染后肝硬化PHT患者26例为PHT组;选取因外伤性脾破裂行脾切除术患者10例为对照组.放射免疫分析法(RIA)检测脾静脉中AngⅡ水平;免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测脾静脉中ERK的表达.结果 PHT组脾静脉组织AngⅡ水平(248.91±48.31) ng/L,显著高于对照组(143.35±36.45) ng/L(P<0.01).蛋白免疫印迹/免疫组织化学染色均显示PHT组脾静脉ERK表达较对照组明显增加.结论 PHT时脾静脉组织AngⅡ水平升高,ERK表达增加.局部AngⅡ升高及ERK信号传导通路的激活可能与门静脉高压症的形成和维持有关.
关键词： 高血压 门静脉 脾静脉 血管紧张素Ⅱ 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 -
巨细胞病毒感染小鼠学习记忆与CaMK Ⅱ表达的变化
目的:探讨巨细胞病毒感染对小鼠学习记忆的影响、ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)的表达,及其在学习与记忆中的作用.方法:采用颅内注射制造巨细胞病毒颅内感染小鼠模型,利用Morris水迷宫试验对病毒感染组和对照组动物的学习和记忆成绩进行3 d测试.记录其学习和记忆成绩,同时观察海马组织神经细胞[Ca2+];及CaMKⅡ在胞膜中表达水平的变化.结果:Morris水迷宫测试的结果显示,病毒感染组小鼠的学习记忆成绩明显下降,神经细胞[Ca2+].较对照组增高,胞膜蛋白CaMKⅡ的水平表达下降,且差异有显著性(P<0.01).结论:巨细胞病毒感染能够导致小鼠学习记忆能力下降及CaMKⅡ在神经细胞胞膜的表达下降.说明CaMKⅡ参与了巨细胞病毒对学习记忆的影响.
关键词： 巨细胞病毒感染 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 学习记忆能力
