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AMPK 信号通路在异丙酚减轻老年大鼠短暂脑缺血再灌注损伤中的作用
目的：探讨AMPK信号通路在异丙酚减轻老年大鼠短暂脑缺血再灌注损伤中的作用。方法健康雄性SD老龄大鼠（18～22月龄）150只，体重450～600 g，采用随机数字表法将其分为5组（n＝30）：对照组（C组）；假手术组（S组）；缺血再灌注组（IR组）；缺血再灌注组＋异丙酚组（IR＋P组）和缺血再灌注组＋异丙酚组＋AMPK激活剂组（IR＋P＋Y组）。采用Pusinelli四动脉阻断法建立全脑缺血模型。于缺血前10 min腹腔内注射异丙酚100 mg/kg，于夹闭动脉前时腹腔注射AMPK激活剂AICAR 500 mg/kg，假手术组仅暴露两侧翼孔和颈总动脉，对照组不行任何处理。采用Lawner等制定的评分标准神经行为学评估。于再灌注1、3和5 d时每组随机取10只处死，采用TUNEL法检测神经元的凋亡情况；采用Western blot法测定大鼠海马内AMPK、pAMPK、Bcl-2和Bax的表达。结果与C组比较，IR组、IR＋P组和IR＋P＋Y组老年大鼠缺血/再灌注24 h后神经行为学评分升高，海马区TUNEL阳性神经元计数增加，海马AMPK、pAMPK表达水平升高，Bcl-2表达下调，Bax表达上调（P＜0.05），与IR组比较，IR＋P组老年大鼠缺血/再灌注24 h后神经行为学评分降低、海马区TUNEL阳性神经元计数减少、海马AMPK、pAMPK表达水平降低，Bcl-2表达上调、Bax表达下调（P＜0.05），与IR＋P组比较，IR＋P＋Y组老年大鼠缺血/再灌注24 h后神经行为学评分升高，海马区TUNEL阳性神经元计数增加，海马AMPK、p-AMPK表达水平升高，Bcl-2表达下调，Bax表达上调（P＜0.05）。结论 AMPK信号通路参与了异丙酚减轻老年大鼠短暂脑缺血再灌注损伤的过程。
关键词： 环AMP依赖性蛋白激酶类 二异丙酚 再灌注损伤 脑 -
环腺苷酸结合蛋白在心脏功能及相关心脏疾病中的作用研究进展
3,5-环磷酸腺苷(cAMP)是心血管系统中细胞对于外界刺激反应的关键信号分子.它控制很多生物效应,如细胞增殖、变异和凋亡等.cAMP是ATP通过跨膜腺苷酸环化酶激活的G蛋白偶联受体[1].细胞内cAMP不仅由腺苷酸环化酶产生,而且由cAMP的磷酸二酯酶调控其降解,催化cAMP水解成5-AMP.磷酸二酯酶是限制cAMP合成的关键因素,并且是各种特定反应动态微小区域的关键组成部分[2].研究显示,细胞内cAMP效应与蛋白激酶A(PKA)及环核苷酸-门控离子通道相关联.1998年,一种新的cAMP受体蛋白被发现,即环腺苷酸结合蛋白(EPAC).EPAC家族由作为小分子G蛋白Rap的特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的EPAC1和EPAC2组成,其功能与PKA平行.EPAC可促使二磷酸鸟苷(GDP)转变为三磷酸鸟苷(GTP),从而激活小分子G蛋白Rap[3]相反,Rap-GTPase激活蛋白提高了内在GTP水解活性,使Rap转化为无活性的GTPase.Rap在有活性和无活性状态的转换形成其与效应蛋白结合的主要机制.EPAC的发现打破了关于cAMP与PKA的传统观点,并揭示cAMP信号在心血管系统中新的作用.这些cAMP敏感的GEF在不同亚细胞器及细胞内环境中的功能将逐步阐明,诸多研究表明,EPAC与cAMP的多种生理反应相关联,例如心肌肥大和血管炎症等[4].我们将对EPAC在心脏中的功能及相关心脏疾病中的作用进行综述,并探讨EPAC配体在相关心脏疾病中的治疗潜力.
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类风湿关节炎相关的HLA-DRβ1亚型对蛋白激酶A信号的影响
目的 研究类风湿关节炎（RA）相关的HLA-DRβ1基因亚型对细胞内蛋白激酶A（PKA）信号通路的影响。方法 测定HLA-DRβ1*0401、*0402、*0403、*0404亚型转基因细胞内PKA、cAMP及腺苷环化酶（AC）的浓度及活性。结果 RA相关的HLA-DRβ1*0401和*0404转基因细胞的PKA活力、cAMP水平及AC活力明显低于HLA-DRβ1*0402和*0403转基因细胞（P值均<0.01）。结论 RA共同表位QK/RRAA的表达可抑制PKA、cAMP和AC的活性，并可能通过干扰细胞内PKA信号通路参与RA的发病。
关键词： 关节炎 类风湿 HLA-DR抗原 环AMP依赖性蛋白激酶类 -
环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号转导通路在重症急性胰腺炎肺损伤中的作用
目的 探讨环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信号转导通路在重症急性胰腺炎肺损伤的作用机制.方法 健康雄性SD大鼠72只,按完全随机法分为假手术(SO)组、重症急性胰腺炎组(SAP组)、SAP+ H89(cAMP抑制剂)组,后两组按取材时间不同又分为3、6、12及24 h四个亚组,共9组,每组8只.采用酶联免疫吸附法检测血清TNF-α、IL-1β,同时观察胰腺和肺组织的病理变化,免疫组织化学蛋白方法检测cAMP依赖PKA催化亚基C(PKA C)和磷酸化的血管扩张刺激磷蛋白(p-VASP),荧光定量聚合酶链反应检测肺组织VSAP mRNA表达水平.结果 与SO组比较,SAP组各时间点血清TNF-α 、IL-1β明显上升(P＜0.05),胰腺、肺病理学改变明显,肺组织PKA C蛋白、VASP磷酸化水平及VASPmRNA表达水平明显增强(P＜0.05),12 h达高峰[TNF-α(266.07±17.14) pg/mL、IL-1β (169.17±25.92) pg/mL、PKA C(210.69 ±6.32)×103、p-VASP(56.62 ±0.57)×103、VASPmRNA(2.06 ±0.21)],且与TNF-α、IL-1β之间存在明显的正相关性.与SAP组比较,SAP+ H89组各时间点胰腺、肺病理学改变明显减轻,肺组织PKA C蛋白、VASP磷酸化水平及VSAP mRNA表达水平明显下降(P＜0.05).结论 cAMP/PKA信号转导通路的活化参与了重症急性胰腺炎肺损伤的病理过程,可能与TNF-α及IL-1β水平上调及VASP磷酸化而发挥作用有关.
关键词： 胰腺炎 环AMP依赖性蛋白激酶类 肺损伤 血管扩张刺激磷蛋白 -
羊膜上皮细胞水通道蛋白3表达的cAMP-PKA信号通路调控机制
目的 探讨羊膜上皮细胞水通道蛋白3(AQP3)表达过程中环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信号传导通路的调控机制.方法 选择2012年l至11月温州医科大学附属第二医院无并发症、羊水量正常的足月孕妇30例,剖宫产时取羊膜进行上皮细胞培养,并进行如下分组实验:(1)毛喉素组:不同浓度的毛喉素(forskolin,0、2.5、5、50、100 μmol/L)作用羊膜上皮细胞2h,再以适宜浓度的forskolin作用不同时间(0、1、2、10、20h)；(2)SP-cAMP组:不同浓度的PKA激动剂SP-cAMP(0、2.5、5、50、100 μmol/L)作用羊膜上皮细胞2h,再以适宜浓度的SP-cAMP作用不同时间(0、1、2、10、20 h)；(3)H-89组:不同浓度的PKA抑制剂H-89(0、5、10、50、100 μmol/L)作用人羊膜上皮细胞2h,再以适宜浓度H-89作用不同时间(0、1、2、10、20 h).采用ELISA方法检测各组细胞内CAMP水平及PKA活性,免疫细胞化学染色法检测AQP3表达定位,蛋白印迹法检测总cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)和AQP3表达水平,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖率.结果 (1)各组羊膜上皮细胞的胞质及胞膜均有AQP3蛋白表达.(2)各组不同浓度forskolin、SP-cAMP和H-89作用羊膜上皮细胞后,细胞增殖率无明显变化,分别比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).(3)不同浓度forskolin作用羊膜上皮细胞2h,总CREB表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).cAMP水平、PKA活性、p-CREB和AQP3表达水平分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),2.5、5、50μmol/L forskolin作用后,上述4种因子均高于0μmol/L(P＜0.05)；而5 μmol/L明显高于2.5、50 μmol/L(P＜0.05).forskolin作用的适宜浓度为5μmol/L.(4)不同浓度SP-cAMP作用羊膜上皮细胞2h,细胞中cAMP和总CREB表达水平分别比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).PKA活性、p-CREB和AQP3表达水平比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)；SP-cAMP浓度为5、50 μmol/L时,上述3种因子高于0μmol/L(P＜0.05)；50 μmol/L时明显高于5 μmol/L(P ＜0.05).SP-cAMP作用的适宜浓度为50 μmol/L.(5)不同浓度H-89作用羊膜上皮细胞2h,细胞中cAMP水平和总CREB表达水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).PKA活性、p-CREB和AQP3表达水平比较,差异均有统计学意义(P ＜0.05)；H-89浓度为10、50和100μmol/L时,上述3种因子均低于0 μmol/L(P＜0.05),10 μmol/L时明显低于50和100 μmol/L(P＜0.05).H-89作用的适宜浓度为10 μmol/L.(6)5 μmol/L forskolin联合10 μmol/L H-89作用2h后,羊膜上皮细胞中总CREB表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).p-CREB与AQP3表达水平比较,低于5 μmol/L forskolin作用2 h(P ＜0.05),但高于10 μmol/L H-89作用2 h(P ＜0.05).结论 cAMP-PKA信号传导通路对羊膜上皮细胞中AQP3蛋白的表达起调控作用.
关键词： 羊膜 上皮细胞 水通道蛋白质3 环AMP依赖性蛋白激酶类 信号传导 -
感染期子宫颈癌U14细胞荷瘤小鼠巨噬细胞分泌CCL5受到抑制的机制
目的：探讨感染期子宫颈癌U14细胞荷瘤小鼠巨噬细胞分泌CC型趋化因子配体5（CCL5）受到抑制的机制。方法取6~8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机（采用随机数字表法）分为4组，每组6只。无瘤组：皮下注射DMEM培养基；荷瘤组：皮下注射子宫颈癌细胞系U14细胞；无瘤+脂多糖（LPS；用于诱导小鼠感染）组：皮下注射DMEM培养基，腹腔内注射LPS；荷瘤+LPS组：皮下注射U14细胞，腹腔内注射LPS。（1）采用ELISA法及荧光定量PCR技术检测各组小鼠血清及巨噬细胞中CCL5和前列腺素E2（PGE2）的表达。（2）提取各组荷瘤小鼠血清制备肿瘤条件培养基（TCM），体外诱导巨噬细胞，检测诱导前、后各组上清液和巨噬细胞中CCL5、PGE2和环磷酸腺苷（cAMP）的表达。（3）荷瘤+LPS组选用环氧合酶2（COX-2）抑制剂——NS398阻断PGE2的产生（即荷瘤+LPS+NS398组），蛋白激酶A（PKA）阻滞剂——H89阻断cAMP/PKA信号通路（即荷瘤+LPS+H89组），分别制备TCM并检测两组上清液和巨噬细胞中CCL5、PGE2和cAMP的表达。结果（1）荷瘤组小鼠血清中CCL5蛋白含量及巨噬细胞中CCL5 mRNA的表达水平[分别为（151±35）pg/ml、1.0]均明显低于无瘤组[分别为（691±85）pg/ml、4.5±0.8；P<0.05]；其血清中PGE2蛋白含量及巨噬细胞中PGE2 mRNA的表达水平[分别为（1198±83）pg/ml、5.8±0.8]均明显高于无瘤组[分别为（187±25）pg/ml、1.0；P<0.05]。无瘤+LPS组小鼠血清中CCL5蛋白含量及巨噬细胞中CCL5 mRNA的表达水平[分别为（4049±141）pg/ml、31.5±2.0]均高于明显高于荷瘤+LPS组[分别为（1951±71）pg/ml、12.1±2.8；P<0.05]；其血清中PGE2蛋白含量及巨噬细胞中PGE2 mRNA的表达水平[分别为（676±70）pg/ml、3.4±0.4]均低于荷瘤+LPS组[分别为（2550±382）pg/ml、11.6±0.9；P<0.05]。（2）各组小鼠血清制备的TCM在体外培养巨噬细胞后，荷瘤组上清液中CCL5、PGE2、cAMP蛋白含量[分别为（1626±177）、（790±156）、（164±30）pg/ml]及巨噬细胞中CCL5、PGE2、cAMP mRNA的表达水平（分别为28.6±1.2、1.7±0.3、1.6±0.3）均明显高于无瘤组[其蛋白含量分别为（27±3）、（448±115）、（118±25）pg/ml，其mRNA的表达水平均为1.0；P<0.05]。无瘤+LPS组上清液中CCL5蛋白含量及巨噬细胞中CCL5 mRNA的表达水平[分别为（10475±742）pg/ml、212.0±5.7]均明显高于荷瘤+LPS组[分别为（6375±530）pg/ml、142.3±2.5；P<0.05]；无瘤+LPS组上清液中PGE2、cAMP蛋白含量[分别为（2438±95）、（340±13）pg/ml]及巨噬细胞中PGE2、cAMP mRNA的表达水平（分别为4.3±0.7、4.1±0.4）均明显低于荷瘤+LPS组[其蛋白含量分别为（3441±163）、（542±42）pg/ml，其mRNA的表达水分别为5.9±0.3、5.4±0.5；P<0.05]。（3）与荷瘤+LPS组比较，荷瘤+LPS+NS398组上清液中CCL5蛋白含量及巨噬细胞中CCL5 mRNA的表达水平[分别为（7691±269）pg/ml、159.0±8.9]明显升高（P<0.05），而上清液中PGE2、cAMP蛋白含量及巨噬细胞中PGE2、cAMP mRNA的表达水平均明显降低（P<0.05）；荷瘤+LPS+H89组上清液中CCL5蛋白含量及巨噬细胞中CCL5 mRNA的表达水平[分别为（8375±520）pg/ml、177.0±8.8]进一步升高（P<0.05），而上清液中PGE2、cAMP蛋白含量及巨噬细胞中PGE2、cAMP mRNA的表达水平均进一步降低（P<0.05）。结论感染期子宫颈癌U14细胞荷瘤小鼠血清可在体外抑制巨噬细胞分泌CCL5，这种抑制效应可能是通过cAMP/PKA通路而受PGE2的调控。
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应激对大鼠空间学习记忆的影响及与蛋白激酶活力的关系
目的 探讨不同时段的应激对大鼠海马依赖性空间学习记忆的影响及与海马蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活力的关系.方法 将60只雄性SD大鼠随机分为对照组、应激1次组、应激1周组、应激2周组和应激4周组,每组动物12只,其中应激模型为强迫大鼠游泳.应用Morris水迷宫(MWM)测试大鼠的空间学习记忆情况,采用同位素法检测蛋白激酶的活力.结果 (1)MWM实验,应激1周组在第7和第8个实验中逃避潜伏期(EL)分别为(9.8±2.8)s和(9.8±4.6)s,少于其他4组(P＜0.01);其他10个实验各组的EL相互比较,差异无统计学意义(P＞0.05);记忆保留实验中,应激4周组的EL长于对照组(P＜0.05);应激1周组大鼠60 s内穿越原平台位置的次数[(3.2±1.2)次]多于对照组[(1.8±0.5)次;P＜0.05].(2)应激1周组大鼠PKA和PKC活力[分别为(6.42±0.27)×10-2和(4.71±0.37)×10-2]高于对照组[分别为(5.53±0.49)×10-2和(1.48±0.27)×10-2;P＜0.01];应激2周组和应激4周组PKA[分别为(4.88±0.23)×10-2和(3.92±0.22)×10-2]和PKC[分别为(0.57±0.03)×10-2和(0.69±0.02)×10-2]活力则低于对照组(P＜0.01).各应激组海马CaMKⅡ的活力均明显低于对照组(P＜0.01).结论 慢性应激损害大鼠海马依赖性空间长时记忆,抑制大鼠海马PKA、PKC和CaMKⅡ的活力;短时间的重复应激选择性提高大鼠海马依赖性空间短时记忆,提高PKA和PKC活力.应激导致记忆改变可能与蛋白激酶活力变化有关.
关键词： 应激 记忆 蛋白激酶类 环AMP依赖性蛋白激酶类 蛋白激酶C 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 -
cAMP-PKA信号通路对L02细胞药物代谢酶CYP3A的调控作用
目的 探讨cAMP-PKA信号通路对细胞色素P4503A(CYP3A)在正常肝细胞L02表达中的作用.方法 102细胞中分别加入8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)10μmol·L<'-1>及抑制剂H-8910μmol·L<'-1>,培养48 h,分别采用完整细胞免疫组化法、Western印迹法和红霉素-N-脱甲基法检测细胞中PKA、孕烷X受体(PXR)及CYP3A的表达.结果 与正常对照组PKA蛋白表达(211±20)、PXR蛋白表达(0.45±0.14)及CYP3A的活性[(0.38±0..2)μmol·min<'-1>·g<'-1>蛋白]相比,8-Br-cAMP 10μmol·L<'-1>处理后,细胞PKA蛋白表达(296±18)升高、PxR蛋白表达(0.69±0.21)升高、CYP3A的活性[(0.43±0.01)μmol·min<'-1>·g<'-1>蛋白]增强;H-89 10μmol·L<'-1>处理后细胞中PKA蛋白表达(176±14)降低,PxR蛋白表达(0.47±0.13)及CYP3A的活性[(0.39±0.05)μmol·min'-1>·g<'-1>]减弱,无统计学差异.结论 cAMP-PKA信号通路可能是药物代谢酶CYP3A的调控途径之一.
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cAMP-PKA信号转导通路在缺血预处理减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤中的作用
目的 探讨cAMP-PKA信号转导通路在缺血预处理减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤中的作用.方法 成年SD大鼠50只,体重300-350g,采用Langendorff装置建立大鼠离体心脏缺血再灌注模型后随机分为5组(n=10):缺血再灌注组(IR组)、缺血预处理组(IPC组)、H89组、脯氨酸二硫氨基甲酸组(PDTC组)和双丁酰环磷酸腺苷组(db-cAMP组).K-H液平衡灌注10 min后,R组K-H液继续灌注30 min后停灌1 h,再灌注30 min;IPC组停灌5 min,再灌注5 min.反复3次,停灌1 h再灌注30 min;PDTC和H89组停灌5 min,分别用含有PDTC 100μmol/L和含有H89 10 μmol/L的K-H液再灌注5 min,反复3次,余同IPC组;db-cAMP组用含db-cAMP 200 μmollL的K-H液灌注30 min,停灌1 h再灌注30 min.于平衡灌注10 min、再灌注10、20和30 min时记录左心室压力大变化速率(±dp/dtmax)和左心室发展压(LVDP).于平衡灌注10 min和再灌注30 min时记录冠脉流出量(CF);测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CK)活性.于再灌注30 min时取心肌组织,采用EMSA法检测NF-κB-DNA结合活性,采用RT-PCR法检测TNF-α mRNA表达,采用Western blot法检测磷酸化环腺苷酸反应元件结合蛋白(p-CREB)(Serl33)表达.结果 与IR组比较,IPC组和db-cAMP组NF-κB-DNA结合活性和TNF-α-mRNA表达降低,±dp/dt和CF升高,CK和LDH活性降低,WC组、PDTC组和db-cAMP组p-CREB(Ser133)表达升高(P<0.05或0.01);与IPC组比较,H89组和PDTC组NF-κB-DNA结合活性和TNF-αmRNA表达升高,±dp/dt、LVDP和CF降低,CK和LDH活性升高.H89组p-CREB(Serl33)表达降低(P<0.05或0.01).结论 缺血预处理通过激活cAMP-PKA信号转导通路抑制NF-κB-DNA结合活性,减少炎性因子的基因转录.从而减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤.
关键词： 环AMP 环AMP依赖性蛋白激酶类 缺血预处理 心肌再灌注损伤 -
环腺苷酸-蛋白激酶A在大鼠内毒素性急性肺损伤时血红素加氧酶-1表达上调中的作用
目的 探讨环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)在大鼠内毒素性急性肺损伤时血红素加氧酶-1(HO-1)表达上调中的作用.方法 健康清洁级雄性SD大鼠48只,体重180 ～ 220 g,2.5 ～ 3.0月龄,采用随机数字表法,将大鼠随机分为4组(n=12)∶正常对照组(C组)股静脉注射生理盐水(LPS溶媒)0.5 ml,2h后皮下注射生理盐水(H89溶媒)0.5 ml；内毒素性急性肺损伤组(ALI组)股静脉注射10 mg/kg LPS 0.5 ml,2h后皮下注射生理盐水0.5 ml; H89+内毒素性急性肺损伤组(H+ALI组),股静脉注射10 mg/kg LPS 0.5 ml,2h后皮下注射5 mg/kg H89 0.5 ml; H89组(H组)股静脉注射生理盐水0.5 ml,2h后皮下注射5 mg/kg H89 0.5 ml.静脉注射LPS后6h时处死大鼠,取肺组织,行病理学评分,测定肺组织含水量；采用Western blot法测定HO-1和PKA表达；采用荧光定量PCR法测定HO-1mRNA表达.结果 与C组比较,ALI组和H+ALI组肺组织含水量和病理学评分升高,肺组织PKA、HO-1和HO-1 mRNA表达上调(P＜0.05),H组上述各指标差异无统计学意义(P＞0.05)；与ALI组比较,H+ALI组肺组织含水量和病理学评分升高,肺组织PKA、HO-1和HO-1 mRNA表达下调(P＜0.05).结论 大鼠内毒素性急性肺损伤时HO-1表达上调的机制与cAMP-PKA信号通路活化有一定关系.
关键词： 环AMP依赖性蛋白激酶类 血红素加氧酶-1 内毒素血症 呼吸窘迫综合征 成人 -
cAMP-PKA信号转导通路在利多卡因上调大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞表面活性物质相关蛋白-A表达中的作用
目的 评价环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信号转导通路在利多卡因上调大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)表面活性物质相关蛋白-A(SP-A)表达中的作用.方法 健康雄性SD大鼠,处死后分离、纯化、培养AECⅡ,接种于24孔细胞培养板中,100μl孔,细胞密度1×106个/ml,培养2h后,换无血清DMEM培养基,采用随机数字表法,将其分为4组(n=48):正常对照组(C组)培养基中不加入任何药物处理;腺苷酸环化酶激动剂佛司可林组(F组)培养基中加入佛司可林10 μmol/ml;利多卡因组(L组)培养基中加入利多卡因200 μg/ml; PKA抑制剂H89+利多卡因组(P+L组)培养基中加入H89 10μmol/ml孵育AECⅡ10 min后,再加入200μg/ml利多卡因.于药物孵育6、12、24 h(T1-3)时采用ELISA法检测AECⅡ内环cAMP含量和PKA活性,采用实时荧光定量PCR法检测SP-A mRNA表达,采用Western blot法检测SP-A表达.结果 与C组比较,F组T1-3时、L组T2.3时AECⅡSP-A和SP-AmRNA表达上调,cAMP水平和PKA活性升高(P＜0.05);与L组比较,P+L组T1-3时AECⅡSP-A和SP-A mRNA表达下调,PKA活性降低(P＜0.05),cAMP水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利多卡因可通过激活cAMP-PKA信号转导通路上调大鼠AECⅡ的SP-A表达.
关键词： 利多卡因 环AMP 环AMP依赖性蛋白激酶类 上皮细胞 肺泡 肺表面活性物质相关蛋白质A -
电针预处理对小鼠脑缺血再灌注时海马神经元AMPK活性的影响
目的 评价电针预处理对小鼠脑缺血再灌注时海马神经元单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)活性的影响.方法 雄性C57BL6小鼠60只,7周龄,体重20～ 22 g,采用随机数字表法,将其分为5组(n=12):正常对照组(C组)、假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、电针刺激百会穴预处理组(EA+I/R组)和电针刺激非穴位预处理组(NEA+I/R组).电针刺激百会穴预处理的实施:疏密波,频率2 Hz/15 Hz,强度1 mA,持续30 min,1次/d,连续5d,后一次针刺结束后24 h制备脑缺血再灌注损伤模型.采用夹闭双侧颈总动脉15 min后恢复脑血流的方法建立脑缺血再灌注损伤模型.术后3d时进行神经行为学缺陷(NDS)评分,随后处死,取海马组织,光镜下观察病理学结果,采用TUNEL法检测凋亡神经元,采用Western blot法检测磷酸化AMPKα(pAMPKα)和caspase-3的表达.结果 与C组比较,I/R组和EA+ I/R组NDS评分和海马CA1区凋亡细胞计数升高,海马pAMPKα和caspase-3上调(P＜0.05),S组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与I/R组比较,EA+I/R组NDS评分和和海马CA1区凋亡细胞计数降低,海马pAMPKα表达上调,海马caspase-3表达下调(P＜0.05),NEA+I/R组述指标差异无统计学意义(P＞0.05).EA+I/R组海马CA1区病理学损伤明显轻于I/R组.结论 电针预处理减轻小鼠脑缺血再灌注时海马神经元凋亡的机制与促进AMPK激活有关.
关键词： 电刺激疗法 脑 再灌注损伤 环AMP依赖性蛋白激酶类 -
异丙酚麻醉对新生大鼠海马PKA-CREB信号通路的影响
目的 评价异丙酚麻醉对新生大鼠海马蛋白激酶A(PKA)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)信号通路的影响.方法 雄性SD大鼠175只,7日龄,体重8～15g,采用随机数字表法,将其分为5组(n=35):对照组(C组)、异丙酚25 mg/kg(E组)、异丙酚50 mg/kg(P2组)、异丙酚100mg/kg(B组)和异丙酚200 mg/kg(P4组).E组和P2组为单次腹腔注射异丙酚25或50 mg/kg;P3组和n组首次腹腔注射异丙酚50 mg/kg,待翻正反射恢复后,追加异丙酚50 mg/kg,直至给完总量.每组取5只大鼠,于苏醒后即刻抽取动脉血样行血气分析.分别于苏醒后2h和饲养9周时,电镜下观察海马神经元超微结构,采用RT-PCR法测定海马组织PKA mRNA和CREBmRNA的表达,采用Westernblot法测定PKA蛋白和pCREB蛋白的表达.结果 5组动脉血气指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).P2组、P3组和P4组海马神经元出现核肿胀、碎裂,染色质边集、凋亡小体,突触数量减少,间隙增宽.与C组相比,E组、P2组、R组和P4组苏醒后2h和饲养9周时海马组织PKA mRNA、CREBmRNA、PKA蛋白和pCREB蛋白表达均下调(P＜0.05).结论 异丙酚麻醉对新生大鼠产生神经毒性的机制可能与抑制海马组织PKA-CREB信号通路的激活有关.
关键词： 二异丙酚 婴儿 新生 环AMP依赖性蛋白激酶类 cAMP反应元件结合蛋白质 海马 -
七氟醚对老龄大鼠海马cAMP-PKA-CREB信号通路的影响
目的 评价七氟醚对老龄大鼠海马环磷酸腺苷-蛋白激酶A-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP-PKA-CREB)信号通路的影响.方法 健康老龄雄性SD大鼠60只,18月龄,体重600～750 g,采用随机数字表法分为2组(n=30):对照组(C组)和七氟醚组(Sev组).Sev组吸入2％七氟醚4h,C组吸入50％空氧混合气体(2 L/min)4 h.于麻醉前1～6d(训练期)及麻醉结束后1d时(C组于相应时点)行Morris水迷宫实验.于麻醉结束后1、3和7d时(C组于相应时点)处死大鼠后取海马组织,采用ELISA法检测海马cAMP含量,Western blot法检测海马CREB、磷酸化CREB(p-CREB)及PKA表达,计算p-CREB/CREB比值.结果 与C组比较,Sev组麻醉结束后1d时逃避潜伏期和游泳距离延长,原平台穿越次数减少,原平台象限停留时间缩短,麻醉结束后1、3及7d时海马cAMP和PKA表达下调,麻醉结束后1d时CREB和p-CREB表达下调,p-CREB/CREB比值降低(P＜0.05).结论 七氟醚诱发老龄大鼠认知功能障碍的机制可能与抑制海马cAMP-PKA-CREB信号通路活性有关.
关键词： 环AMP 环AMP依赖性蛋白激酶类 cAMP反应元件结合蛋白质 麻醉药 吸入 认知障碍 -
瑞芬太尼致小鼠急性阿片类药物耐受时脑组织cAMP和PKA水平的变化
目的 探讨cAMP/PKA通路是否参与瑞芬太尼致急性阿片类药物耐受的形成.方法 雄性昆明小鼠56只,体重25～35 g,随机分为5组:生理盐水对照组(C组,n=8)、吗啡组(M组,n=8)、低剂量瑞芬太尼组(R1组,n=8)、中剂量瑞芬太尼组(R2组,n=8).和高剂量瑞芬太尼组(R1组,n=24),M组腹腔输注吗啡0.6 μg·kg-1·min-1,R1组、R2组和R3组分别腹腔输注瑞芬太尼0.4、0.8或1.6 μg·kg-1·min-1,C组给予等容量生理盐水,给药时间均为120 min.各组取8只动物,分别在给药前(基础状态)、给药30、60、90、120 min时和停药后15、30、45、60 min时测定热刺激甩尾潜伏期,并于停药后60 min处死,R3组的另外16只动物分别于停药后30、45 min时处死8只,测定大脑皮层、下丘脑和纹状体cAMP含量和蛋白激酶A(PKA)活性.结果 与基础值比较,给药期间M组、R1组、R2组和R3组热刺激甩尾潜伏期延长,M组停药后15 min时热刺激甩尾潜伏期延长,R3组停药后30 min时热刺激甩尾潜伏期缩短,R2组停药后45 min时热刺激甩尾潜伏期缩短,R3组停约后30、45 min时热刺激甩尾潜伏期缩短(P<0.05或0.01).与C组比较,M组和R1组停药后60 min时大脑皮层PKA活性降低,R2组停药后60 min时大脑皮层cAMP和PKA水平降低,下丘脑和纹状体PKA活性降低,R,组停药后60 min时大脑皮层cAMP和PKA水平降低(P<0.05).结论 腹腔输注瑞芬太尼可诱发小鼠痛觉过敏,产生了急性阿片类药物耐受,其受体后cAMP/PKA通路没有出现上调现象,不同于慢性阿片类药物耐受.
关键词： 哌啶类 药物耐受性 脑 环AMP 环AMP依赖性蛋白激酶类 -
当归对大鼠心肌缺血/再灌注损伤蛋白激酶C的影响
目的 目的研究当归抗心肌缺血/再灌注损伤的分子生物学机制.方法 结扎/开放左冠状动脉前降支结扎40min/开放120min建立心肌缺血/再灌注模型.选用SD大鼠40只,随机分成三组:对照组(A组,n=10只),丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎;缺血/再灌注组(B组,n=15只),缺血/再灌注前舌静脉注射生理盐水0.8ml/100g,当归治疗组(C组,n=15只),缺血再灌注前舌静脉注射25%当归注射液0.8ml/100g.采用免疫组化SP法测定蛋白激酶C(PKC)含量和同位素标记法测定PKC活性.结果 与B组比较,C组心肌梗死面积显著缩小(P＜0.01),A组及C组PKC灰度值显著性降低(P＜0.01),A组PKC的活性无显著性差异(P＞0.05),而C组PKC活性明显升高(P＜0.01).与A组比较,C组PKC的灰度值无显著性差异(P＞0.05),PKC的活性明显升高(P＜0.01):C组的PKC多分布在细胞膜上,A组及B组的PKC多分布在细胞核和细咆浆内.结论 当归可促使PKC从细胞核转移到细胞膜,从而激活PKC抑制心肌缺血/再灌注损伤.
关键词： 当归 心肌再灌注损伤 环AMP依赖性蛋白激酶类 -
鞘内注射H-89对神经病理痛大鼠脊髓背角磷酸化cAMP反应元件结合蛋白表达的影响
目的观察鞘内注射高选择性蛋白激酶A抑制剂H-89对慢性神经病理痛大鼠脊髓背角磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(pCREB)表达的影响.方法成年雌性SD大鼠58只,体重230～270 g.采用右侧慢性坐骨神经结扎的方法建立慢性神经病理痛模型.第一部分,取28只模型大鼠随机分为4组(n=7),H1、H2、H4组分别单次鞘内注射1、2、4 nmol H-89[用二甲亚砜(DMSO,10mmol/L)溶解成10 μl],Con组单次鞘内注射10 mmol/L DMSO 10μl.给药前和给药后15、30、60min分别测定右侧50%缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL).第二部分,取24只模型大鼠随机分成4组(n=6),Con组:单次鞘内注射10 mmol/L DMSO 10 μl,H1、H2、H4组分别单次鞘内注射H-89 1、2、4 nmol(10μl);另取6只大鼠实施假手术后,单次鞘内注射10mmol/LDMSO 10μl(Sham组).第二部分大鼠给药后30min处死,取L4,5脊髓,免疫组织化学染色观察脊髓背角pCREB的表达.结果与给药前比较,H2组MWT给药后15 min增加,H4组给药后15、30 min MWT增加,TWL延长(P＜0.05或0.01);与Con组比较,H2组MWT给药后15 min增加,H4组给药后15、30minMWT增加,TWL延长(P＜0.05或0.01).与Con组比较,Sham、H1、H2和H4组脊髓背角pCREB免疫反应阳性神经元数量和表达降低(P＜0.05或0.01).结论鞘内注射H-89抑制了神经病理痛大鼠脊髓背角pCREB表达,PKA/CREB信号通路的激活参与了慢性神经病理痛的维持.
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鞘内注射布托啡诺混合氯胺酮对炎性痛大鼠脊髓背角cAMP-PKA-CREB信号转导通路的影响
目的 探讨鞘内注射布托啡诺混合氯胺酮对炎性痛大鼠脊髓背角环磷腺苷-蛋白激酶A-环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP-PKA-CREB)信号转导通路的影响.方法 雄性SD大鼠,体重240～280 g,取鞘内置管成功的大鼠24只,随机分为4组(n=6):炎性痛组(IP组)、布托啡诺组(B组)、氯胺酮组(K组)和布托啡诺+氯胺酮组(BK组).置管后5 d,于大鼠左后足掌面皮下注射5%甲醛50μl,以制备炎性痛模型.IP组、B组、K组和BK组于皮下注射甲醛前30 min分别鞘内注射生理盐水10 μl、布托啡诺12.5 μg、氯胺酮50μg、布托啡诺12.5μg混合氯胺酮50μg.注射甲醛后1 h内,每5 min观察大鼠痛行为学,并计算痛加权评分(PIS评分);于注射甲醛后2 h时处死大鼠,取L5脊髓组织,采用免疫组化法测定脊髓背角PKA和磷酸化CREB(p-CREB)的表达水平,并行免疫组化染色分级.结果 大鼠注射甲醛后均表现出典型的痛双相期,即急性痛时相(第1时相)和继发性痛时相(第2时相).与IP组比较,BK组第1、2时相PIS评分降低,大鼠脊髓背角PKA、p-CREB表达下调,免疫组化染色分级降低(P<0.05或0.01),B组、K组上述指标差异无统计学意义(P>0.05).结论 鞘内注射布托啡诺混合氯胺酮可减轻大鼠炎性痛,其机制可能与抑制脊髓背角cAMP-PKA-CREB信号转导通路有关.
关键词： 布托啡诺 氯胺酮 环AMP 环AMP依赖性蛋白激酶类 cAMP反应元件结合蛋白质 疼痛 注射 脊髓 -
蛋白激酶A在干扰素-γ抑制创面愈合和瘢痕形成中的作用
目的 :观察干扰素γ(IFN-γ)用于兔耳伤口肉芽组织和瘢痕组织后蛋白激酶 A(Protinase A, PKA)活性变化及对伤口愈合和瘢痕形成影响,探讨 PKA的信号转导作用. 方法 :用 32P掺入法测定使用 IFN-γ前后兔耳伤后 3, 6, 11～ 16 d（上皮化时),以及上皮后 14, 30, 45和 60 d组织的 PKA活性,观察伤口愈合时间和瘢痕变化. 结果：上皮化时肉芽组织和伤口周边组织的 PKA活性高于正常皮肤 [(1.5± 0.6) pmol/min· mg, t=3.76, P< 0.001和(1.4± 0.5) pmol/min· mg, t=2.96, P< 0.01]. IFN-γ延迟创面愈合约 1.5 d(t=2.64, P=0.01),同时进一步活化 PKA：肉芽组织在伤后 6 d和上皮化时 [(1.6± 0.6) pmol/min· mg, t=2.59, P< 0.05和 (1.8± 0.7) pmol/min· mg, t=2.92, P< 0.01]和周边组织上皮化时 [(1.7± 0.6) pmol/min· mg, t=2.42, P< 0.05]高于对照.增生性瘢痕组织的 PKA活性仅在上皮化时升高 [(1.5± 0.5) pmol/min· mg, t=2.26, P< 0.05],非增生性瘢痕组织的 PKA活性在上皮化时 [(1.4± 0.5) pmol/min· mg, t=2.08, P< 0.05]和上皮化后 14 d[(1.4± 0.5) pmol/min· mg, t=2.08, P< 0.05]时较高； IFN-γ进一步升高上皮化时 IFN-γ 1组： [(1.8± 0.7) pmol/min· mg, t=2.92, P< 0.01]和伤后 14 d时非增生性瘢痕组织的 PKA活性 [IFN-γ 1组： (1.79± 0.6)pmol/min· mg, t=2.59, P< 0.05和 IFN-γ 2组： (1.8± 0.6) pmol/min· mg, t=2.55, P< 0.05],但上皮化前后使用无差异(P >0.05).上皮化后 60 d时,上皮化前后使用 IFN-γ的瘢痕增生数分别为 8和 9个,低于对照的 24个 (χ 2 =13.33和 11.61, P< 0.001),而且瘢痕增生程度较低,但两组间无差异. 结论 :IFN-γ延迟创面愈合与其活化 PKA有关.增生性瘢痕组织上皮化后 PKA活性即下降,而非增生性瘢痕的高活性维持到 14 d后,且 IFN-γ活化非增生性瘢痕组织的 PKA,提示 PKA活化介导 IFN-γ抑制瘢痕增生的信号.
关键词： 伤口愈合 瘢痕 环AMP依赖性蛋白激酶类 干扰素Ⅱ型 -
肥胖大鼠骨骼肌AMPK表达及其与糖脂代谢的关系
目的 探讨肥胖大鼠骨骼肌组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的表达及其对糖脂代谢的影响.方法 将28只6周龄雄性SD大鼠随机分为普通饮食组(NC组,15只)和高脂饮食组(HF组,13只),分别测体重(BW)、血清游离脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TCH)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)等指标.采用免疫印迹法测定各组大鼠骨骼肌中AMPK和磷酸化AMPK(p-AMPK)的水平.以p-AMPK/AMPK代表AMPK的活性.结果 与NC组大鼠相比,HF组大鼠的BW、FFA、TG、FPG、FINS均明显升高(P＜0.05),骨骼肌中AMPK表达降低,但差异无统计学意义(P＞0.05),p-AMPK表达及AMPK活性(p-AMPK/AMPK)降低显著(均P＜0.05).骨骼肌组织p-AMPK表达水平与FPG、FFA呈负相关(P＜0.05),AMPK活性与FPG、FFA、TG呈负相关(P＜0.05),与FINS无相关性.结论 高脂饮食诱导大鼠营养性肥胖,降低AMPK的活性,从而导致TG和TCH的合成增加,血糖升高,脂质在外周组织沉积增加.
关键词： 环AMP依赖性蛋白激酶类 肥胖症
