人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选

目的:PC-1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C4-2中高表达.为了进一步研究PC-1基因的功能及作用机制,构建C4-2细胞的Cdna文库,寻找与前列腺癌相关基因PC-1相互作用的蛋白.方法:从前列腺癌细胞系C4-2中提取总RNA,进而分离poly(A) + RNA,用poly(A)+ RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(Dt)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组.通过文库片段、线性化的Pgadt7-Rec和诱饵质粒Pgbkt7-PC-1-C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC-1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的Pgadt7-Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选.后用Far-Western印迹方法进一步从体外论证了PC-1蛋白可与自身相互作用形成二聚体.结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌Cdna文库,双链Cdna片段的长度大小范围为250～5 000 bp.共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105.接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106.筛选到4个与PC-1蛋白相互作用的阳性克隆.从体外证明了PC-1蛋白可形成二聚体.结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求.可用于前列腺癌相关基因的进一步筛选,已筛选得到的蛋白尚需进一步鉴定.

尿酸氧化酶的表达纯化及活性形式鉴定

目的:在大肠杆菌内表达具有活性的黄曲霉尿酸氧化酶.方法:用重叠PCR从黄曲霉(Aspergillus flavus)3.1398中钓取了尿酸氧化酶(urate oxidase,UO,EC 1.7.3.3)基因,克隆到原核表达载体pET22b中,转化大肠杆菌 BL21(DE3),筛选到高表达的重组转化子菌株.经乳糖诱导目的蛋白表达,阴离子交换柱纯化,获得纯品.SDS-PAGE分析样品纯度.用尿酸缓冲液测定酶活性,用戊二醛交联结合质谱法测定相对分子质量.结果:目的蛋白为胞内可溶性表达,表达量达菌体总蛋白的35%,纯化后的样品纯度达 99%,其酶比活力可达35 U/mg.经质谱测定重组UO单体的相对分子质量为34×103.交联后相对分子质量为160×103.结论:黄曲霉尿酸氧化酶可在大肠杆菌中可溶表达,并具有活性,其活性形式为四聚体.

亚甲蓝/光化学法灭活血浆中的SARS冠状病毒

目的:探讨亚甲蓝/光化学法灭活人血浆中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的效果.方法:从SARS患者血清中分离出冠状病毒,经VeroE6细胞增殖后将病毒加入含有不同浓度亚甲蓝的人血浆中,再用亚甲蓝/光化学法处理不同时间,取样接种细胞,观察细胞病变作用.结果:在激发光源照度为40 000 lx条件下,经1 μmol / L的亚甲蓝作用30 min可灭活血浆中6.5 lgTCID50/ ml的SARS-CoV,经5 μmol / L的亚甲蓝作用3 min可灭活上述滴度病毒.结论:亚甲蓝/光化学法能够灭活血浆中的SARS-CoV.

人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR序列包含潜在蛋白结合位点

目的:检测中国人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR多态性,探询VNTR序列是否具有潜在的蛋白结合位点,从而为进一步研究这些VNTR的功能提供线索.方法:采用PCR方法扩增健康中国人外周血淋巴细胞基因组hTERT 基因第2内含子多态性VNTR片段,克隆并鉴定,以多态性重复单元做为探针进行凝胶延迟实验,以确定该片段是否存在蛋白结合位点.结果和结论:hTERT基因第2内含子内上游的一个VNTR序列(VNTR2-1st)存在一个潜在蛋白结合位点,该蛋白能够与多态性VNTR DNA序列形成复合物,蛋白结合的关键位点处于42 bp重复单元C端的典型E-box基序(CACGTG),但是c-myc并不参与结合该VNTR2-1st重复单元.此外,利用第6内含子内上游的VNTR (VNTR6-1st)的重复单元做为探针,结果发现该38 bp VNTR6-1st重复单元不能与HeLa细胞核蛋白因子结合,从而提示了不同VNTR序列功能的多样性.

应用离子对-反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中阿德福韦酯水解产物

目的:建立一种快速、简单的测定大鼠血浆中阿德福韦酯水解产物阿德福韦单特戊酸甲基酯和阿德福韦的离子对-反相高效液相色谱方法.方法:用Hypersil ODS C18反相柱,乙腈-50 mmol/L醋酸铵缓冲液(2∶ 98和50∶ 50)为流动相,采用梯度洗脱,流速1.0 ml/min,紫外检测波长为262 nm.结果:测定血浆中阿德福韦浓度的线性范围为1.25～60.0 μg/ml(r＝0.9999),低检测限为0.40 μg/ml(S/N>3),绝对回收率为76.72%～80.61%.结论:本方法准确,灵敏度较高,重复性好,适于对阿德福韦酯结构类似物进行体外血浆稳定性评估筛选,并可为临床前/临床药代研究提供重要的方法学参考.

肝刺激物促肝细胞增殖信号转导途径的初步研究

目的:探讨新生牛肝肝刺激物(hepatic stimulator substance,HSS)促进SMMC7721肝癌细胞增殖的信号转导途径.方法:对新生牛肝进行多步分离,采用3H-TdR DNA掺入法检测分离物的促增殖活性,从而获得具增殖刺激活性的HSS;Western印迹方法检测其对肝癌细胞MAPK Thr202/Tyr204的磷酸化作用并检测其对SPK的激活作用.结果:经多步分离纯化,获得了活性较高的HSS粗提物,Western印迹法结果显示HSS粗提物能明显提高MAPK的磷酸化水平,并能激活细胞内的SPK活性.结论:HSS对细胞的增殖刺激可能是通过SPK和MAPK途径发挥作用.

延迟氟桂嗪、尼莫地平处理支持大鼠坐骨神经元存活

目的:观察、比较氟桂嗪与尼莫地平对慢性退变中神经元的保护作用.方法:21只生后2 d新生大鼠,切断右侧坐骨神经作为实验侧,左侧为正常对照侧.术后第5天,氟桂嗪组皮下注射氟桂嗪(25 μg/g体重),尼莫地平组皮下注射尼莫地平(20 μg/g体重),对照组注射等量溶剂,连续14 d,然后取L4～6脊髓,在光镜下观察并计数脊髓前角神经元.结果:在神经元慢性退变过程中,氟桂嗪组与尼莫地平组可以分别平均支持78.3%和58.1%神经元存活, 统计学上以前者占优势,且两者与对照组相比(存活53.2%)差异显著.氟桂嗪组实验侧脊髓前角神经元核团改变较小,其胞体萎缩程度较轻.结论:氟桂嗪与尼莫地平对慢性退变过程中神经元均有保护作用,而氟桂嗪的保护作用更显著.

泪道冲洗和探通术治疗先天性泪囊炎

目的:探讨治疗先天性泪囊炎的佳途径.方法:3个月以上的患儿在1%的卡因表面麻醉下采用泪道冲洗术及泪道探通术.冲洗时加入适量抗生素及地塞米松注射液.结果:先天性泪囊炎 2 623例,3 422只眼,加压冲洗治愈率24%.一次性探通治愈率51%,2次以上探通治愈率为21.7%,总治愈率为96.7%. 结论:3～6个月为治疗先天性泪囊炎的佳年龄.泪道加压冲洗术及泪道探通术是治疗先天性泪囊炎既安全又有效的方法.

基因重组α-半乳糖苷酶的生化性质研究

目的:在成功构建咖啡豆α-半乳糖苷酶毕赤酵母工程菌株及完成基因重组α-半乳糖苷酶发酵与纯化研究的基础上,对基因重组α-半乳糖苷酶的生物化学性质进行研究.方法:测定了基因重组α-半乳糖苷酶的N端序列、相对分子质量、氨基酸组成、三批发酵产物的紫外吸收光谱和肽图以及Vmax、Km、适反应温度、适反应pH值等酶的生化性质.结果与结论:基因重组α-半乳糖苷酶的N端序列与理论序列完全一致;氨基酸组成与理论值相符;相对分子质量为39.4×103.三批发酵产物的紫外光谱吸收和肽图基本一致,表明发酵纯化后的产物稳定;Km=0.275 mmol/L,大酶促反应速度Vmax=0.014 mmol/min;适反应温度为37℃,适反应pH值为5.6.

不同培养体系对猪卵母细胞体外发育潜力的影响

目的:研究猪卵母细胞体外成熟的佳条件,为用体细胞核移植的方法生产转基因克隆猪提供大量优质的MⅡ期卵母细胞.方法:采用猪卵母细胞体外成熟技术,研究了不同激素组合、猪卵泡液、半胱氨酸和颗粒细胞对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响.结果与结论:以15 U/ml PMSG+20 U/ml hCG成熟率高,为(70.0±3.30)%,显著高于15 U/ml FSH+30 U/ml LH、10 U/ml PMSG+10 U/ml hCG[成熟率分别为(45.6±5.10)%,(60.0±3.30)%],添加激素能促进卵母细胞的分裂,添加15%的猪卵泡液成熟率高,为(86.7±3.35)%,显著高于5%,10%和20%组[成熟率分别为(73.3±3.35)%,(71.2±5.08)%和(70.0±6.70)%],添加猪卵泡液促进了激活卵母细胞的分裂,在培养基中添加半胱氨酸和颗粒细胞,实验组和对照组成熟率差异不显著(P>0.05),但孤雌激活后卵裂率显著提高(P<0.05).

小鼠新基因 msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征

目的:研究小鼠系统性RNAi相关基因msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征.方法:通过生物信息学方法寻找小鼠中与线虫的sid-1基因同源的基因,用RT-PCR方法从小鼠大脑中分离到其全长cDNA;将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,用脂质体介导转入CHO细胞,确定其亚细胞定位.结果与结论:基因msid2的cDNA全长1 353 bp,编码450个氨基酸,定位于小鼠16号染色体,其基因组全长16 kb,包括14个外显子和13个内含子.亚细胞定位试验结果初步表明,该蛋白定位于内质网及质膜.RT-PCR结果显示msid2在小鼠大脑、小脑中高表达,而在其他组织表达水平较低.

RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达

目的:通过抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达,从而部分恢复抑癌基因的表达.方法:采用RNAi技术来抑制DNMT1的活性.应用体外转录的方法,共合成了5个针对DNMT1不同靶位的siRNA序列,并转染人肺癌细胞NCI-H157.采用MSP-PCR、COBRA等方法对抑癌基因RASSF1A进行甲基化分析,半定量RT-PCR检测DNMT1 mRNA的敲降与RASSF1A基因的表达.结果与结论:5个靶位的siRNA序列中有两个靶位能够有效地抑制DNMT1的表达,且呈剂量依赖效应.人肺癌细胞NCI-H157中抑癌基因RASSF1A发生了高度甲基化,在抑制DNMT1活性后, RASSF1A基因去甲基化而恢复表达.

胸腺肽致HL-60细胞DNA损伤的初步研究

目的:观察相对分子质量小于10 000的小分子胸腺肽(thymopeptide, TP)在体外液体培养中对人急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞增殖的影响.并探讨可能的作用机制.方法:在加或不加TP的情况下,体外悬浮培养HL-60细胞.实验分为3组:空白对照组、TP 20 μg/ml和40 μg/ml实验组,每组设3个平行孔;胎盘蓝染色法计数细胞并绘制细胞生长指数曲线;单细胞凝胶电泳法(SCGE)检测细胞出现的DNA损伤;琼脂糖凝胶电泳法检测基因组DNA断裂情况.结果:TP作用于细胞72 h后,较低浓度的TP(20 μg/ml)对HL-60细胞的增殖即有抑制作用;对TP两个实验组的SCGE检测结果显示,HL-60细胞的慧尾现象明显增多;琼脂糖凝胶电泳上出现了相差200 bp左右的DNA梯度现象.结论:TP对HL-60细胞的增殖具有抑制作用,凋亡诱发的DNA损伤可能参与了这一过程.

猪血清白蛋白基因的克隆及其5'端调控序列功能分析

目的:克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析.方法:以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84 两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选.经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接.以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究.结果:共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35 kb(GenBank登录号:AY663543).将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%.荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达.结论:获得猪血清白蛋白全基因.猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能.此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料.

抑制核因子-κB活性对糖尿病大鼠肾组织一氧化氮水平的影响

目的:研究抑制核因子-κB(NF-κB)活性对实验性糖尿病大鼠肾组织一氧化氮(NO)水平的影响.方法:雄性Wistar大鼠分为3组,A组(11只)为正常对照组,B组(11只)为糖尿病未干预组,C组(9只)为糖尿病大鼠吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC,NF-κB活性抑制剂)干预组.以链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型.大鼠饲养18周后取出肾脏以电泳迁移率变动分析技术检测NF-κB活性,RT-PCR技术检测诱导型NO合成酶(iNOS)mRNA表达并检测肾组织NO水平,同时电镜检测大鼠肾小球基底膜厚度及系膜基质密度(系膜基质面积/系膜面积).采用大鼠白蛋白特异的酶免疫分析试剂盒检测24 h尿白蛋白排泄(UAE). 结果:肾组织iNOS mRNA表达在B组大鼠(0.30±0.12)显著高于A组(0.12±0.04, P<0.01)和C组(0.16±0.08,P<0.01).肾组织NO水平在B组大鼠(0.56±0.20 μmol/mg肾组织)显著低于A组(1.05±0.25 μmol/mg肾组织, P<0.01)和C组(1.45±0.61 μmol/mg肾组织,P<0.01).基底膜厚度在B组大鼠(531.6±107.6 nm)显著高于A组(312.4±25.4 nm, P<0.05)和C组(315.8±21.4 nm,P<0.05).系膜基质密度在B组大鼠(56.41±6.78)显著高于A组(33.95±5.22, P<0.05)和C组(37.97±7.37,P<0.05). 结论:在实验糖尿病大鼠,肾组织iNOS mRNA表达明显增加,但NO水平明显降低;抑制NF-κB活性不但能延缓糖尿病肾病的发生,还能增加肾组织NO水平并降低iNOS mRNA表达.

含有RSV G蛋白片段和CTL表位融合蛋白的表达及纯化

目的:构建表达呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段(G126,来自100～225氨基酸)和来自RSV M2蛋白的CTL表位的原核表达质粒,探索适宜的表达和纯化条件,获得融合表达产物,为进行体内外实验检测奠定基础.方法:利用PCR技术,从质粒pUC18(G10)、pUC18(CTL)中扩增G126和CTL基因,通过DNA重组技术构建含DsbA-G126-Linker-CTL(DsbA-GLC)融合基因的表达载体pET(GLC).转化宿主菌E.coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,并采用亲和层析纯化目的蛋白.结果:DsbA-GLC在E.coli BL21(DE3)plysS中可获得高效表达,表达量可达菌体总蛋白的21%.通过可溶性测试,DsbA-GLC能以可溶性形式表达.纯化后目的蛋白的纯度可达到95%以上.结论:实现RSV G126和M2蛋白CTL表位的融合表达,所获得的重组蛋白可作为抗原用于RSV重组蛋白疫苗的筛选.

真核细胞诱导表达系统研究进展

在体内外表达外源基因是研究基因功能的一种重要手段.常规表达系统可实现基因的组成型表达,但却不能调控基因的表达时间和表达水平.用常规表达系统研究那些对细胞有毒性作用的基因或在特定组织或特定发育阶段表达的基因,存在一定的局限性.诱导表达系统可以在特定时间以适当的水平表达目的蛋白,这有利于基因功能的研究.目前已经建立了几种较理想的诱导表达系统,它们是研究新基因功能、构建人类疾病动物模型、寻找新的有效药物的有力工具.本文总结了目前常用的几种真核细胞诱导表达系统及其特点.

放射性皮肤损伤的研究进展

放射性皮肤损伤具有长期性、持久性、潜在性和进行性作用的特征.皮肤损伤与吸收剂量存在明显的量效关系.皮肤损伤机制研究表明, 核糖核酸、脱氧核糖核酸、蛋白质等分子受电离辐射作用能产生一系列损伤,这一系列改变构成辐射生物效应的物质基础.辐射造成细胞内DNA 的损伤, 引起双螺旋结构的复制紊乱和错误;癌基因激活及其产物的高表达,抑癌基因突变产物高表达或缺失,以及端粒酶的改变是造成损伤皮肤癌变的基础.

14-3-3ζ与细胞凋亡

细胞凋亡的调控是一个复杂的过程,14-3-3ζ作为凋亡抑制蛋白,近年来对其研究不断深入.本文介绍了14-3-3ζ的结构特点以及抑制细胞凋亡的机制,同时简要介绍了该蛋白的配体类型及其拮抗剂的应用.

电磁辐射对男性生殖系统的影响

睾丸是电磁辐射敏感的靶器官之一,电磁辐射(包括微波、极低频率电磁场、脉冲电磁场、电场和静电磁场)不仅可以引起睾丸结构和功能的损伤,造成性功能和生精能力下降,而且可影响子代.本文对该方面的研究进展进行了综述.

异源性表达载体--爪蟾卵母细胞的内源性离子通道

作为异源性表达载体,非洲爪蟾卵母细胞用于各种蛋白的表达,包括受体、离子通道、转运体等,为研究所表达蛋白的结构、功能及药理学特性提供了重要的手段,已在生命科学研究领域内得到了广泛的应用.本文就近年来对爪蟾卵母细胞内源性离子通道的研究进展作一综述,以期对全面、客观的解释和评价爪蟾卵母细胞所表达的异源性离子通道的研究结果提供帮助.

人胚胎胸腺基质细胞的体外分离培养与鉴定

目的:体外分离培养胎儿胸腺基质细胞,即上皮网状细胞,为研究T淋巴细胞的分化增殖及相关药物筛选奠定基础.方法:从水囊引产的胎儿胸腺中分离组织细胞,经筛选培养获得胸腺上皮网状细胞.结果:细胞染色体正常,为46条染色体,包括1对性染色体.倒置显微镜下观察,细胞呈扁平状,多边形,胞体较大,核圆形或椭圆形,核仁明显,胞质内含明显的颗粒和小泡.透射电镜显示细胞间有桥粒相连,并可见张力丝.用免疫组化法检测上皮细胞特异性表达标志(角蛋白)为阳性.结论:本法获得细胞为胸腺网状上皮细胞,为进一步工作打下基础.

Hendra病毒的实时PCR检测方法的建立

目的:建立针对Hendra病毒的敏感、特异和快速的实时PCR法,为Hendra病的早期诊断提供依据.方法:采用常规PCR法和实时PCR法分别对构建的Hendra病毒全长G基因的重组质粒DNA进行扩增,并比较两种方法的敏感性.结果与结论:应用常规PCR方法可检测到100 fg/μl的含Hendra病毒特异序列的重组质粒DNA,而实时PCR法则可检测到0.1 fg/μl的DNA,后者的敏感性比常规PCR法的提高了1 000倍,该方法不但操作上更加简便、快速,还可避免交叉污染,适于对Hendra病毒特异序列的检测.

改进的质谱兼容的胶内酶切方法

目的:改善胶内酶切的肽段回收率,提高蛋白质的有效鉴定率.方法:将改进的胶内酶切"四步提取法",应用到96个双向电泳蛋白质斑点分析.结果:该方法提高了胶内蛋白质酶切肽段的回收率,改善了质谱图谱的质量.蛋白质的有效鉴定率达89.6%,其中,数据库检索得分80分以上者达82%.另外,证实了酶解原液直接用于质谱分析可获得较好信噪比的谱图.结论:应用"四步提取法"使得酶解肽段提取率和蛋白质的有效鉴定率明显提高.

超声引导下介入治疗3例未破裂型异位妊娠

超声检查作为诊断异位妊娠的重要辅助手段已在临床广泛应用,然而在实时超声显像引导下进行穿刺并注射药物以达到定性诊断和治疗目的的介入性超声新技术在我国尚未普及.我们尝试采用这一新技术经腹穿刺胚囊、注射甲氨蝶呤以达到治疗未破裂型异位妊娠的目的.

老年恶性心律失常先兆识别及护理体会

心律失常是老年器质性心脏病的常见并发症,其中恶性心律失常可威胁患者生命.老年人随着年龄增长,生理和病理特点均发生变化,常合并多器官病变,治疗难度加大;如果救治不及时或措施不当,可能危及生命.临床观察发现,老年恶性心律失常均有一个短暂的病理、生理演变过程,从而在临床上产生一系列的恶性心律失常的先兆症状,了解并掌握这些征兆有利于早期识别,及时处理,积极施以佳的护理干预.我们对2001～2003年我院老年病房收治的老年心律失常患者采取了早期先兆识别、针对性的急救和护理干预措施,提高了抢救成功率.现将我们的经验报告如下.

62例肾脏偶发癌的临床报告

随着健康查体的逐渐普及,B超等影像检查手段的广泛应用,临床上无任何症状而体检发现的肾癌近年来有逐年增多的趋势.为提高对此类肾癌的认识,我们对1993年3月至2004年7月收治的62例肾偶发癌(IRC)与174例症状肾癌(CRC)的临床资料进行分析.

关于投搞的统计学要求

试论登岛作战卫勤保障需求与卫生装备研究

本文探讨了登岛作战卫勤保障需求和卫生装备研究的有关问题,研究提出了:登岛作战卫勤保障将呈现需求多元化、阶梯扁平化和聚焦卫勤能力等新特点;不同作战阶段、不同作战样式引发不同的伤员救治需求,航渡、抢滩登岛和扩大登陆场作战伤员救治需求是重中之重;应优先研制海上、岛上及"三防"作战卫勤保障专用卫生装备,完善配套单兵自救互救及师救护所医技保障装备,解决岛上伤员战略、战役后送和卫生装备战略投送问题,形成5种卫勤保障能力,即:海上系列救治装备保障能力、生防系列救治装备保障能力、单兵非医救治自我保障能力、师救护所医技自我保障能力和卫生装备信息化保障能力;加强登岛作战的卫勤理论研究,加强卫生装备科研的组织领导工作,顶层设计、整合力量、集中财力,采用新的组织体制和运行机制,形成科技攻关合力、科技攻关助推力和科技攻关制度约束力.

第四届海峡两岸肿瘤学术会议征文通知