血流切应力影响动脉内皮形态重建的在体研究

目的探讨动脉血流受阻后壁切应力(WSS)变化对内皮细胞形态适应性重建的影响. 方法 60只实验兔建立颈总动脉血流减小模型,在术后0～30 d 8个不同时相点,制作血流减小后的颈总动脉铺片,应用银染及荧光素标记的鬼笔环肽特染方法,显微镜及共聚焦激光扫描显微镜下观察动脉内皮细胞(AEC)的形状及骨架纤维肌动蛋白(F-actin)的变化,计量AEC结构参数. 结果 WSS减小后12 h即导致AEC张力纤维的减少或消失,形状由棱形变为椭圆形,计量显示,AEC形状指数、长宽比分别较正常对照显著增大、减小(P<0.01).术后7 d改变为显著,外周带微丝增粗,中央张力纤维完全消失,细胞排列无明显定向.随着WSS的递增,部分细胞可见张力纤维,AEC形状指数在逐渐减小,长宽比增大. 结论 AEC的形态随WSS的动态变化而改变,提示WSS是导致AEC形态结构重建的主要因素.

人类风湿性关节炎滑膜细胞系(RASB)的建立和生物学特性的观察

目的建立人类风湿性关节炎滑膜细胞永生细胞系. 方法用重组有HPV16病毒E6/E7基因阅读框架的逆转录病毒载体转染原代培养的人类风湿性关节炎滑膜细胞,经G418筛选,获取细胞克隆RASB,并从形态学、生长特性、核型组成、致瘤性和分泌功能等多方面对建系细胞RASB进行生物学观察. 结果实验和观察证实,转化滑膜细胞染色体整合HPV病毒DNA,表达HPV E6蛋白,基本保留了B型滑膜细胞特征形态、细胞骨架和分泌功能,倍增时间缩短一半,对裸鼠无致瘤性,软琼脂培养形成细小集落.已稳定传代大于100代. 结论建立了能长期体外稳定传代的人类风湿性关节炎滑膜细胞系.此细胞系的建立将为类风湿关节炎致病机理的研究和治疗提供极有意义的体外细胞模型.

低氧下小鼠肝细胞的细胞化学变化

目的探讨低氧时小鼠肝细胞的细胞化学变化. 方法实验用雄性小白鼠45只,低氧组36只,对照组9只,低氧仓氧浓度为10%.用组织化学和图象分析方法,检测小鼠在低氧条件下肝细胞PAS,乳酸脱氢酶(LDH),细胞色素氧化酶和镁离子依赖性ATPase活性. 结果低氧组乳酸脱氢酶活性随低氧时间延长而升高;肝细胞色素氧化酶活性随低氧时间延长而降低. 结论 10%低氧浓度可造成小白鼠肝细胞损伤,出现明显的细胞化学改变.

男性不育症患者精液细胞成分DNA流式细胞术分析

目的研究男性不育症患者精液细胞DNA的病理改变. 方法采用流式细胞仪(FCM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)和常规精液检查法,对82例男性不育症患者进行精液细胞DNA分析. 结果男性不育症患者精液细胞成分等有多种变化:1.亚单倍体细胞碎片和凋亡细胞增多.2.单倍体的成熟精子数量减少.3.单倍体圆形精子细胞增多.4.畸形精子增多,精子DNA含量和密度异常.5.≥2倍体的细胞(白细胞、G1期精原细胞、精母细胞、上皮细胞及4倍体细胞等)增多.6.少精和无精. 结论精液细胞DNA变化反映男性不育症患者精液细胞成分有明显改变.精液DNA流式细胞术分析可作为研究和诊断男性不育症的辅助方法.

人心传导系统的变异

目的探讨划分心传导系统(CCS)形态变异与发育异常(畸形)的界线. 方法用我们建立的CCS检查法,即窦房结和房室结沿其长轴切1～2块,房室束沿长轴垂直切2～4块,连续切片,间断取片,每例共取30片.对886例(非心源性死亡737例,心源性猝死149例)人CCS进行组织学观察,并对两组进行CCS形态、死因分析比较. 结果 1.人CCS具有大小、位置及形态的先天性变异;2.也有增龄性变化的后天性变异;3.死因不明的心源性猝死者中CCS见到有成年人胎儿型房室结、房室结全部移位至房室束穿部、房室束穿部完全分成3束以上、房室束分叉部房室结化及移位至三尖瓣根部等,这些改变不应认为是正常变异,因为它们都可能有病理学意义. 结论房室束分叉部向室间隔膜部内移位、偏位于室间隔左侧、向室间隔左下侧移位,以及不足1/2房室结移位至中心纤维体内(房室束穿部),心肌束移位于房室束或左束支内等应属CCS变异,不是畸形.

一氧化氮合酶与缺氧复氧所致神经细胞凋亡及银杏叶提取物的保护作用

目的探讨一氧化氮(NO)在缺氧复氧诱导神经细胞凋亡中的作用及中药银杏叶提取物的保护机制.方法实验使用胎龄16～17日Wistar大鼠的大脑皮层神经细胞进行原代分离培养;采用Wright-Giemsa染色,光镜、透射电子显微镜观察;原位末端标记法确立缺氧复氧神经细胞凋亡病理模型;应用NADPH-d组织化学方法检测神经细胞一氧化氮合酶(NOS)的表达并用计算机图像分析系统进行定量检测. 结果缺氧复氧可以使大鼠大脑皮层神经细胞发生凋亡,随缺氧时间的延长,凋亡细胞数渐多,至缺氧8 h复氧18 h达高峰;在缺氧2 h(H2R0组)和缺氧8 h复氧18 h(R8R18)组中神经细胞NOS表达均显著增高,与正常对照组比有显著性差异(P＜0.01;P＜0.05).EGB能显著抑制此双时相NOS活性的增强,并明显降低神经细胞凋亡率. 结论缺氧复氧损伤可诱导培养的大鼠大脑皮层神经细胞发生凋亡.NOS表达增强从而使NO产生增加可能是缺氧复氧诱导神经细胞凋亡的机制之一.银杏叶提取物(EGB)经下调NOS表达活性,抑制NO的产生保护培养的大鼠大脑皮层神经细胞免于凋亡.

钮蛋白在神经生长锥的三维分布及其机能意义

目的探索钮蛋白(vinculin)在神经生长锥形态变化和神经生长过程中的作用机制. 方法用免疫细胞化学方法,检测了初代培养鸡胚脊神经节细胞生长锥的细胞骨架蛋白vinculin的三维分布特征及其与纤维型肌动蛋白(F-actin)的相互关系. 结果在三维的水平面上,vinculin与F-actin的免疫反应活性在P领域和C领域的部分区域重合,在P领域伸展方向前端和丝状伪足内免疫反应活性强.vinculin比F-actin更接近细胞膜分布;在纵轴方向,vinculin主要分布在中部以上的表面游离侧,基质侧未见分布;F-actin大部分与vinculin重叠,但比vinculin分布更广泛. 结论 vinculin是构成膜骨架蛋白成分之一,具有连接生长锥细胞膜和F-actin的作用,参与生长锥形态变化、伪足伸缩,使神经突起生长.

HIV-1基因限制性显示片段的制备（英文）

目的快速分离HIV-1基因片段制备DNA芯片探针. 方法以Sau3AⅠ酶切HIV基因后,将得到的限制性酶切片段两端接上接头.根据酶切位点与接头的序列设计通用引物.在该通用引物的3'端分别延伸1个碱基后,通过引物间的两两组合,将PCR反应分成10个亚组.纯化各组PCR产物,克隆到T载体上.挑取白色菌斑进行快速鉴定后扩大培养阳性克隆、提质粒.以质粒为模板扩增靶片段并测序. 结果每个亚型得到了十几个100～1 000 bp的HIV基因片段. 结论限制性显示技术是一种有效的快速分离制备基因片段的方法.

嗅神经鞘细胞在体外培养时对GABA能神经元的作用

目的研究嗅神经鞘细胞(OECs)在培养状态下对GABA能神经元的存活及突起生长的影响. 方法用原代培养的方法,分别进行OECs和脊髓神经元的培养,培养6 d后,将OECs接种在Millipore细胞培养板的内嵌培养皿中,然后置入脊髓神经元的培养板中,使两者进行不接触的联合培养,培养进行至6 d,分别作GABA免疫细胞化学染色,观察突起生长情况以及GABA阳性细胞计数. 结果与OECs联合培养组(实验组)GABA能神经元存活为39.7±6.3,对照组为27.6±2.7(P＜0.05),并且实验组GABA能神经元染色较对照组深,突起长度(630±112 μm)较对照组长(270±97 μm)(P＜0.01). 结论在体外培养状态下,OECs对GABA能神经元有明显的促进作用.

同一心内神经元酪氨酸羟化酶、生长抑素的各自基因表达与贮存——原位杂交和/或免疫组织化学法光镜观察

目的在转录与翻译水平同时证明1.部分心内神经节的单一细胞内既出现酪氨酸羟化酶(TH)的基因表达,又储存TH;2.部分心内神经节的单一细胞内既出现生长抑素(SS)的基因表达,又储存SS. 方法在中华蟾蜍心房后壁腔静脉窦部位的冰冻切片(30 μm)上,分两组以原位杂交、免疫组织化学及原位杂交/免疫组织化学结合双标方法分别进行心内神经节细胞的THmRNA、TH-免疫反应(TH-IR)及SSmRNA、SS-免疫反应(SS-IR)染色观察. 结果在两组心内神经节切片分别发现下述标记细胞:TH-IR阳性神经元、THmRNA阳性神经元、TH mRNA/TH-IR双阳性神经元;以及SS-IR阳性神经元、SS mRNA阳性神经元、SS mRNA/SS-IR双阳性神经元. 结论 1.证明部分心内神经节的细胞内既出现TH的基因表达,同时又有TH,可能是肾上腺素能的交感神经细胞;2.SS系心内神经节细胞的一种内源性神经递质.本研究为心内SS能神经结构参与心功能(兴奋传导、心肌分泌及收缩)的局部神经调节提供直接的化学神经解剖学证据.

CKIp15INK4B相关新基因p15rs对HeLa细胞增殖影响的初探

目的探讨新克隆的CKIp15INK4B相关基因p15rs对细胞增殖的作用. 方法克隆p15rs编码区cDNA,通过基因转染技术将其导入HeLa细胞,检测细胞的生长曲线,细胞周期和集落形成能力. 结果构建了p15rs高表达的细胞模型HPS21,发现p15rs高表达可使HeLa细胞增殖被显著抑制,细胞生长速率下降,倍增时间延长,G1期细胞增加,S期细胞减少,集落形成能力下降. 结论新基因p15rs具有抑制癌细胞增殖和对细胞周期进程进行负调节的作用.

HPV18永生化人胚食管上皮细胞的细胞遗传学研究

目的研究HPV18永生化人胚食管上皮细胞的细胞遗传学改变,为深入研究食管癌发病机理提供实验依据. 方法采用Giemsa染色、G显带、间期核荧光原位杂交(FISH)分析人胚食管上皮永生化细胞株(SHEE)染色体数目异常和结构畸变. 结果人SHEE第10、20代细胞染色体众数分别为58～63、57～64,第61代为双众数:58～60、63～65.G显带发现,在大多数核型中出现异常染色体:1.del(1)(q12);2.del(1)(p32);3.der(4),t(4;?)(q31;?);4.der(5),t(5;?)(q31;?).FISH结果显示,1号3体和7号4体伴随传代数目增加而明显增加.8号2体保持相对恒定. 结论 SHEE细胞伴随传代数目增加,染色体众数有双众数分布倾向,染色体数目异常表现为不平衡增加,结构异常的染色体恒定存在,提示细胞的永生化是一个由多染色体参与的多阶段过程.

早期人胚羊膜共聚焦激光扫描光学切片及F-肌动蛋白的研究

目的建立羊膜组织共聚焦激光扫描显微镜光学切片的方法,探讨早期人胚羊膜细胞结构、分层及细胞骨架的空间结构. 方法采用共聚焦激光扫描光学切片和荧光探针双重标记技术对妊娠7～9周早期人胚羊膜进行形态观察、细胞F-肌动蛋白表达定量分析、细胞分层及厚度计算. 结果羊膜由两层不同类型的细胞组成,内层细胞为多边形扁平细胞,外层细胞为长梭形细胞;内层细胞胞质中的F-肌动蛋白表达量较低,外层细胞胞质中的F-肌动蛋白表达量明显高于内层细胞,两者差异有统计学意义;7～9周人胚羊膜厚度为30±2μm.其中,上皮层厚度为10μm±2μm,间充质层厚度为14μm±2μm. 结论 1.早期人胚羊膜由两层细胞即内层的上皮细胞层和外层的间充质细胞层组成,胞质中F-肌动蛋白的表达量间充质细胞高于上皮细胞;2.通过共聚焦激光扫描连续光学切片可以计算出羊膜各层的厚度;3.共聚焦激光扫描显微镜光学切片技术结合FITC-鬼笔环肽和碘化丙啶双重标记技术是观察和分析羊膜组织细胞立体结构的良好方法.

霍乱毒素对远端视神经损伤后视网膜节细胞再生的影响

目的探讨霍乱毒素(CTx)对成年金黄地鼠远端视神经受损后视网膜节细胞(RGCs)再生的作用.方法远端切断视神经并对接一段自体坐骨神经(AG),玻璃体内注射CTx及/或植入小段坐骨神经分支(SN).动物随机分为对照组Ⅰ(AG组)与对照组Ⅱ(溶剂组);AG+SN组;AG+CTx组;AG+SN+CTx组和量效关系组,前五组分别存活4周～6周,用粒蓝逆行标记再生的RGCs,荧光显微镜下观察. 结果 AG+CTx组各时间点再生的视网膜节细胞比对照组Ⅰ与对照组Ⅱ明显增加,具统计学意义(P＜0.05);AG+SN组得出相似结果.AG+SN+CTx组与其它几组相比在各时间点上均存在极显著性差异(P＜0.01). 结论霍乱毒素可明显提高远端视神经受损后视网膜节细胞的再生.

人胚胎大脑皮层神经干细胞的分离培养

目的为人神经干细胞的基础研究及临床应用提供细胞模型. 方法采用无血清培养技术,分离培养了10～14周人胚大脑皮层细胞,并用神经上皮干细胞蛋白(Nestin)免疫组化鉴定培养细胞;5%胎牛血清诱导其分化,神经丝-200(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化鉴定分化细胞. 结果获得了大量未分化、呈簇状悬浮生长的神经干细胞团,且能被诱导分化成神经元和神经胶质细胞.经传12代后仍具干细胞特性. 结论本实验成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础.

糖尿病大鼠肺部超微结构的变化

目的观察糖尿病大鼠肺部超微结构的变化. 方法将20只大鼠分为正常对照组和糖尿病组,每组10只.糖尿病组以STZ 60 mg/kg体重腹腔注射制成糖尿病模型.成模6个月后杀检,电镜下观察肺组织的超微结构. 结果糖尿病大鼠肺泡隔增宽,肺间质中胶原和弹性蛋白增生,部分肺泡萎缩甚至塌陷;肺泡毛细血管管腔狭窄甚至闭锁.糖尿病组大鼠肺泡毛细血管内皮细胞基板的平均厚度比正常对照组明显增厚(P<0.01);Ⅱ型肺泡上皮细胞粗面内质网和高尔基复合体的扁平囊扩张. 结论糖尿病肺部超微结构的变化可能引起呼吸功能异常,引发机体缺氧,加重糖尿病的各种并发症.

食管鳞癌组织中的肽能神经支配研究

目的探讨食管鳞癌组织中的肽能神经支配情况. 方法采用免疫组织化学ABC法,检查外科手术取得的食管鳞癌标本中10种神经肽免疫反应性神经纤维的分布及其与肿瘤细胞的关系;采用食管鳞癌组织块和鸡胚背根神经节共培养的方法,初步探讨肿瘤组织对神经元的影响,以推测肿瘤中神经纤维的来源. 结果食管鳞癌组织中存在相当数量的GAL、SP、NPY等多种神经肽免疫反应神经纤维,神经纤维与肿瘤细胞紧密接触.共培养组有约63%的神经节长出突起,其中有49%的神经节突起在靠近肿瘤组织块的一侧较浓密,对侧则较稀少.对照组鸡胚神经节则无突起生长. 结论食管鳞癌组织中可能存在肽能神经支配;食管鳞癌组织块对神经节突起具有促生长作用.

E钙粘蛋白/catenin复合体在人非小细胞肺癌细胞系中的表达

目的探讨E钙粘蛋白/catenin粘附系统在人非小细胞肺癌细胞系中的表达. 方法采用免疫组织化学和RT-PCR两种方法分别从蛋白及mRNA两个水平分析E钙粘蛋白、α-catenin、β-catenin在7种人非小细胞肺癌细胞系中的表达情况. 结果每个细胞系至少出现1个、两个或多个E钙粘蛋白/catenin复合体成分的表达异常. 结论 E钙粘蛋白、α-catenin和β-catenin的蛋白及mRNA异常表达与人非小细胞肺癌有关.

P物质神经元在鸽旁听觉神经通路中的分布

目的观察P物质(SP)在鸽旁听觉神经通路中的分布. 方法免疫组织化学ABC方法. 结果 SP免疫阳性神经元胞体及纤维集中分布在中脑外侧核背部(MLd)周围的丘间核(ICo)、脑桥外膝体腹侧核(VLV)的周围、丘脑卵圆核(Ov)的背侧和内侧、下丘脑腹内侧核(VMN)周围、端脑带状核(Tn)周边区及端脑的视前区前核(POA). 结论在鸽旁听觉神经通路和控制生殖脑区中存在大量SP免疫阳性结构,推测SP可能参与了鸟类的发声控制及生殖内分泌调制.

bFGF、FGF受体I在HEp-2喉癌和MGE803胃癌细胞株中表达的检测

目的通过对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF),成纤维细胞生长因子受体-1(fibroblast growth factor receptor-1, FGFR-1)的检测,揭示两者在体内外的表达以及与肿瘤形成的关系. 方法采用免疫组织化学的检测方法,检测了体外培养的HEP-2喉癌细胞和MGE803胃癌细胞以及由两者在裸鼠皮下形成的实体瘤组织中bFGF和FGFR-1的表达情况. 结果在体外培养的这两种肿瘤细胞中bFGF的阳性染色存在于整个细胞.FGFR-1的染色主要存在于细胞核.在两种肿瘤细胞形成的实体瘤组织中bFGF和FGFR-1阳性染色细胞主要是围绕于坏死区的肿瘤细胞. 结论此两种肿瘤细胞在体内外均能表达bFGF和FGFR-1.bFGF与其高亲和力受体FGFR-1结合后进入细胞核,并在细胞核内发挥其生物功能,参与了肿瘤组织的形成和发展.

大鼠面神经核小GTP结合蛋白TC10的表达和真核表达载体的构建

目的分析大鼠小GTP结合蛋白TC10基因在大鼠面神经损伤早期的表达和作用,构建大鼠TC10的真核表达载体. 方法由大鼠损伤的面神经核中提取组织总RNA,利用逆转录聚合酶链反应技术观察面神经损伤后面神经核团TC10的表达变化,将获得的基因片段酶切后插入pcDNA3真核表达载体中,利用酶切电泳和核苷酸序列分析鉴定. 结果逆转录聚合酶链反应显示在正常情况下,面神经核团有TC10的表达,切断后6h即出现增加,24h达到大值.TC10真核表达质粒酶切电泳及序列测定证明,所获得的基因片段为大鼠TC10全长基因cDNA序列. 结论面神经切断后,TC10在面神经核团出现急剧增加,可能参与了神经元早期损伤反应的信号转录.本实验首次从大鼠面神经核团中获得大鼠TC10的cDNA,并构建了TC10真核表达质粒.为研究TC10的表达及作用提供了必要条件.

神经-免疫-内分泌网络与癫痫发病机理的关系

癫痫是一种严重危害人类健康的神经系统疾病，但长期以来对其发病机理的研究一直未取得突破性进展，而缺乏综合性系统研究是其重要原因之一。我们将20世纪70年代提出的“神经-免疫-内分泌网络”学说应用于癫痫发病机理研究，以期取得新的进展。现以此为题，结合我们的工作，综述如下。

GFP基因重组病毒在神经解剖研究中的应用

绿色荧光蛋白(GFP)基因重组病毒标记技术是神经解剖研究的新方法.此方法可以用于观察神经元的形态学特点、神经活性物质及其受体的化学构筑、神经元形态与投射终止部位和功能的关系以及有关的局部神经环路.该法弥补了以往形态学研究方法的一些缺陷,能为机能学研究提供直接的形态学证据.

移植研究中X-gal染色的影响因素及优化条件

目的研究在细胞移植过程中,利用X-gal染色定位lacZ转基因细胞时,消除宿主内源性β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)非特异背景的条件. 方法分别取成年及新生大小鼠,侧脑室注入LacZ转基因神经干细胞C17.2后,于两种不同灌注条件下取脑,在5个pH点,6个孵育时间点行x-Gal染色,计数不同条件下海马区非特异性着色细胞数,得出X-gal染色的佳条件. 结果 X-gal染色中非特异染色随pH增高及孵育时间缩短而减少,在pH为9.5,孵育时间为1 h时较为理想.并与宿主的种属,年龄有密切关系. 结论 X-gal染色必须从动物灌注、pH和孵育时间等诸方面加以优化并设立同种属同年龄的对照才可获得客观可信的结果.

同时显示大鼠中枢神经系统神经元和神经纤维的全程连续切片方法

目的探索一种简便易行并能同时显示大鼠中枢神经系统(CNS)神经元和神经纤维的全程连续切片方法. 方法经过灌流固定的CNS组织低温冰箱速冻后连续冰冻切片和改良的苏木精染色方法. 结果大鼠全程CNS连续切片各断面上神经元呈蓝黑色,神经纤维呈蓝色,背景淡黄色. 结论运用低温速冻、连续冰冻切片、改良的苏木精染色方法可制作同时显示CNS神经元和神经纤维的全程连续切片.

神经干细胞移植对大鼠全横断性脊髓损伤修复的影响

我们先前探讨了移植的神经干细胞在大鼠半横断损伤脊髓内存活及分化的情况,结果表明神经干细胞在损伤脊髓内可以存活、迁移并分化为神经元和星型胶质细胞.在此基础上,本研究应用神经干细胞移植,观察其对大鼠全横断性脊髓损伤后结构与功能的影响.取SD新生大鼠海马,剪碎后,用胰酶消化,制成细胞悬液,用含B27和bFGF的DMEM/F12培养液进行培养.神经干细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,5～6!d形成克隆球,7～9!d后进行传代.

《医学分子细胞生物学》即将出版

江苏省神经再生重点实验室