鸽圆环病毒浙江株全基因组的克隆及序列分析

鸽圆环病毒(Pigeon circovrius,PiCV)是圆环病毒科的一个成员,是一种免疫抑制性病原,鸽子感染圆环病毒后可以出现昏睡、嗜眠、厌食、体重减轻、呼吸窘迫等症状.本研究应用建立的.PCR方法,检测了从浙江省5个鸽场采集的样品,结果在杭州某鸽场检测到阳性.进一步设计引物分段PCR扩增、克隆并测定了2株鸽圆环病毒的全基因组序列,分别命名为PiCV-zj1和PiCV-zj2,序列的GenBank登录号为DQ090945和DQ090944.基因组序列分析表明,PiCV-zj1及PiCV-zj2全长均为2039bp,具有圆环病毒共同的与病毒复制相关的茎环结构和Rep蛋白保守基序等特征,与已发表的国外11株鸽圆环病毒序列在全基因组核苷酸水平有86%～89.1%的同源性,在Rep和外壳蛋白的氨基酸水平分别有92.1%～94.7%和76.6%～81.4%的同源性.应用PHYLIP方法作进化树分析并应用bootstrap重复1000次进行检验,结果显示:10个欧美株组成一个大的分支,而浙江株和澳洲株各自独立分支.这是我国首次检测确认鸽圆环病毒的存在,并测定了2株PiCV病毒的全基因组序列.

鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救

参照GenBank上公布的鸽源Ⅵb亚型新城疫病毒JS/07/04/Pi株基因组全序列设计9对引物,RT-PCR扩增目的片段后,依次亚克隆至TVT7/R转录载体,成功构建出含JS/07/04/Pi株基因组全长cDNA的转录载体TVT/071204.然后将其与三个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,60h后将转染细胞及其上清接种鸡胚,收集死亡鸡胚尿囊液进行HA与HI试验.结果显示死亡鸡胚尿囊液HA呈阳性,并能被ND阳性血清所抑制,表明该病毒已成功拯救,且拯救病毒rNDV/071204在细胞上的生长增殖能力同母本病毒相似.该病毒的成功拯救为鸽源Ⅵb亚型NDV感染的宿主特异性及鸽用ND新型疫苗的研究提供了理想的生物材料.

单眼视网膜摘除鸽视盖差异表达基因的筛选

目的筛选单眼剥夺鸽视盖差异表达的基因. 方法采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后左视盖基因差异表达的文库,对部分重组克隆进行序列分析,反Northern进一步去除假阳性. 结果随机测序150个表达序列标签,16个表达序列标签经反Northern证实为真阳性,包括与基因库已知基因同源的及未发现明确的同源序列,138个基因片段已申请序列号. 结论视盖差异表达基因的研究为深入研究视觉发育、视中枢的分子构筑提供有益的线索.

鸽CDC10 cDNA全序列的克隆与测序

目的自鸽视盖克隆CDC10全长cDNA. 方法建立鸽左侧单眼剥夺模型,采用cDNA末端快速扩增法和RNA转录物转换机制技术分别克隆鸽CDC10基因的3′和5′半分子并进行序列分析. 结果鸽CDC10 cDNA全长为2329bp,开放阅读框为1257bp,推测编码419个氨基酸残基,氨基酸水平与人CDC10有87%的同源性.结论鸽CDC10全长cDNA序列的克隆为进一步研究该基因在视觉发育中的作用提供条件.

P物质神经元在鸽旁听觉神经通路中的分布

目的观察P物质(SP)在鸽旁听觉神经通路中的分布. 方法免疫组织化学ABC方法. 结果 SP免疫阳性神经元胞体及纤维集中分布在中脑外侧核背部(MLd)周围的丘间核(ICo)、脑桥外膝体腹侧核(VLV)的周围、丘脑卵圆核(Ov)的背侧和内侧、下丘脑腹内侧核(VMN)周围、端脑带状核(Tn)周边区及端脑的视前区前核(POA). 结论在鸽旁听觉神经通路和控制生殖脑区中存在大量SP免疫阳性结构,推测SP可能参与了鸟类的发声控制及生殖内分泌调制.

河南省肉鸽隐孢子虫感染情况调查

目的 了解河南省肉鸽隐孢子虫感染情况. 方法 应用饱和蔗糖溶液漂浮法结合改良抗酸染色法检查鸽粪中隐孢子虫卵囊. 结果 郑州、洛阳、南阳、鹤壁、平顶山、安阳6地市11个养鸽场1 625份粪便样品有16份阳性,阳性率0.98%.鸽源隐孢子虫分离株初步鉴定为贝氏隐孢子虫(Crysporidium baileyi). 结论 河南省鸽隐孢子虫感染率存在地区差异,且与鸽龄有关.

乳鸽和蛇提取液延缓衰老的实验研究

鸽肠道沙门菌分离鉴定、药敏试验及毒力基因、耐药基因检测

目的 对安徽蚌埠某鸽场2014年初至2014年底5次送检以腹泻、败血症为特征的病死鸽肝组织进行病原菌分离鉴定,并测定其致病性、毒力基因和耐药基因.方法 将5次送检的病死肉鸽肝脏组织在麦康凯琼脂平板上进行病原菌的分离鉴定、同源性分析,并测定其毒力基因和耐药基因.结果 从上述病死鸽肝脏中分离到5株革兰阴性杆菌.基因比对结果显示,5株分离菌均为肠道沙门菌.分离菌均含有磺胺类耐药基因sull,均不含β-内酰胺类耐药基因blacMY-2,2株含p-内酰胺类耐药基因blatem-1,4株含氨基糖苷类耐药基因aadA1,2株含喹诺酮类耐药基因qnr.实验组小鼠多数于接种后24 h内死亡.分离菌均含肠毒素基因stn,菌毛基因invJ,毒力岛基因mis、orf31.9和pipC,3株含毒力岛基因基因sipA和ssaB基因.结论 该鸽场5次送检的病死鸽死亡是由肠道沙门菌感染引起的.5株分离菌致病性均很强,均含多重耐药基因和多种毒力基因.

重组鸡痘病毒vFV282疫苗株免疫鸽抗体消长规律的检测

目的:检测重组鸡痘病毒vFV282疫苗株免疫鸽后的抗体消长规律.方法:将共表达NDV F、IBDV VP0基因重组鸡痘病毒免疫30日龄的幼鸽,将鸽子分为2组,分为刺种组和对照组,每组40只,按一个使用剂量(每0.1 ml含毒≥105.5TCID50)进行免疫,对照组刺种生理盐水,在免疫后的第7、14、21、28、35、42、49和56天采血,并分离血清,将血清56℃、30分钟灭活,用固定病毒稀释血清血清中抗FPV、NDV、IBDV的抗体效价,统计结果,并用SPSS 10.0分析.结果:鸽刺种后,抗FPV中和抗体效价免疫后7天显著升高,14天达到高峰,且保持到21天以后,28天开始下降,49天时仍保持一定水平;抗NDV和抗体效价免疫后7天显著升高,14天达到高峰,且保持到21天以后,28天开始下降,56天时仍保持一定水平;抗IBDV中和抗体效价免疫后7天显著升高,14天达到高峰,且保持到21天以后,28天后开始下降,49天时仍保持一定水平.结论:重组鸡痘病毒vFV282疫苗株免疫鸽后,鸽产生了良好的免疫力.

单眼剥夺鸽视盖与人CDC1O同源基因的克隆与表达分析

初步研究鸽视觉偏侧化的分子机制.建立鸽左侧单眼剥夺模型,采用抑制消减杂交和反Northern方法筛选右视盖差异表达的表达序列标签.自右视盖消减文库随机取60个重组克隆进行反Northern杂交,证实为真阳性克隆6个,随机对其一进行序列分析,发现该片段与人CDC10有84%的同源性.CDC 10属MBF转录因子复合体的一部分,介导细胞周期调节的转录,该表达序列标签在右视盖表达增强,可能调制一些视觉相关神经元的分化、增殖,其与鸽视觉偏侧化的关系需进一步克隆其全序列了解其功能方可定论.

鸽左视网膜摘除视盖的人TMEFF2同源基因差异表达

目的研究在左视网膜摘除后鸽与人TMEFF 2同源基因在左右视盖的差异表达.方法从本室构建的左视盖消减基因差异表达的文库得到一基因片段 ,该片段与人TMEFF 2高度同源.采用逆转录PCR和RNA点杂交方法研究该片段在左视网膜摘除后鸽左右视盖的差异表达.结果 RT-PCR和RNA点杂交表明该片段在左视盖高表达. 结论 TMEFF 2为中脑神经元和海马神经元存活因子,推测该片段在视觉发育过程中可能起着重要的作用.

单侧视觉剥夺后鸽脑两侧视盖基因的差异表达

目的探讨单侧视觉剥夺后鸽子两侧视盖基因的差异表达情况。方法建立单眼剥夺动物模型，抽提、纯化左右视盖mRNA，利用SSH方法建立左侧视盖差异表达文库，对其中EST进行克隆、测序，反Northern杂交去除假阳性。结果共筛选得到12个差异表达片段，经同源性检索，其中11个未发现有高同源性的基因，提示可能为新的EST；另一差异片段与CGI－31蛋白有85％的同源性。结论视觉相关脑区差异表达序列的分析可能为视觉形成的分子机制或视觉通路的分子构筑提供有益的线索。

单眼视网膜摘除后鸽左右前脑基因的差异表达

利用消减抑制杂交(SSH)技术分析左眼视网膜摘除后成鸽左右前脑基因差异表达情况, 对14个重组子经反Northern杂交去除假阳性, 终获得4 个阳性重组子, 对阳性重组子进行克隆和测序,其中PFB/SSH-8片段长226 bp, 它的138 bp与人CaM Ⅰ基因外显子有85% 的同源性; PFB/SSH-15片段长252 bp, 与 nexin I alpha非表达序列有低的同源性; 另外2个片段未发现有同源物。

定眩颗粒镇静催眠及镇吐作用的实验研究

目的研究定眩颗粒的镇静、催眠、镇吐及对毛细血管通透性的影响.方法采用阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠法、小鼠走动时间和举双肢法,研究受试药的镇静作用;采用硫酸铜和顺铂致家鸽呕吐的模型,观察受试药的镇吐作用;采用小鼠腹腔毛细血管通透性实验,观察受试药对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响. 结果定眩颗粒可明显缩短小鼠入睡潜伏期,减少小鼠自发活动次数;延长硫酸铜和顺铂致家鸽呕吐潜伏期,并能减少硫酸铜所致家鸽呕吐次数;降低腹腔毛细血管通透性.结论定眩颗粒具有一定的镇静、催眠及镇吐作用,并能降低毛细血管通透性.

小半夏汤不同剂型药效学比较研究

目的:比较仲景小半夏汤中原生药材制成的微粉中药与传统煎剂的药效.方法:用2%硫酸铜制备家鸽呕吐模型,用顺铂制备小鼠胃动素;随机分为模型组,小半夏汤煎剂高、低剂量组,小半夏汤粉剂高、低剂量组,胃复安阳性对照组;观察小半夏汤止吐效果及对胃动素影响情况,并比较小半夏汤煎剂和粉剂对正常小鼠的肠推进影响.结果:小半夏汤煎剂、粉剂均对家鸽呕吐模型有显著止吐作用,并能显著降低血液中胃动素(MTL)水平;两种剂型均可显著降低正常小鼠小肠推进速度.结论:小半夏汤粉剂疗效优于传统煎剂,但统计学意义不明显.

调查分析河南省肉禽和蛋禽中弓形虫的感染状况

目的:调查分析河南省肉禽和蛋禽的弓形虫感染状况.方法:随机抽取1152份家禽血液样品,其中鸡462份、鸭212份、鹅181份和鸽297份.提取样品中白细胞DNA并使用巢式PCR检测弓形虫529重复序列.结果:1152份家禽血液样品中检测出175份弓形虫阳性,阳性率为15.19％.四种家禽都有弓形虫感染,其中鹅的阳性率高(24.31％),鸽的阳性率低(5.39％).结论:河南省鸡、鸭、鹅、鸽四种家禽均有弓形虫感染,家禽感染率比同时期人的感染率(3.47％)高,提示禽肉和禽蛋是人感染弓形虫的风险因素.

鸽源冠状病毒核衣壳基因克隆及分子进化分析

目前新研究发现, 冠状病毒除能感染鸡、火鸡外,也能感染孔雀、鹧鸪、海鸟、灰雁、野鸭、野鸽等多种禽类[4-5].2005年初笔者从以呼吸锣音、上呼吸道粘液异常增多、气管壁出血、胰脏肿大充出血和肺脏出现肉样病变为主要特征的病鸽中分离到1株病毒,通过形态学观察、动物回归试验、鸡胚接种试验、血凝特性试验等证实为冠状病毒,暂命为PSH[2].本研究对PSH N基因进行了克隆和序列分析,其目的一方面是为揭示该病毒N结构基因的变异特点和该病毒的遗传演化规律;另一方面为进一步研制出快速诊断试剂和安全有效的基因工程疫苗及防治鸽源冠状病毒病奠定良好的基础.

实验性鸽半规管冷冻术的初步结果及其临床应用

目的:探讨治疗Meniere病合理有效的新方法.方法:对42只家鸽水平半规管在不同低温、时间剂量作用下的形态和功能改变进行了观察,并选用适宜的温度、时间剂量对6例Meniere病患者进行了临床应用观察.结果:在-70°C 12 min、 -90°C 6 min和9 min显示冷冻处外淋巴间隙纤维组织轻度增生,选择性的半规管功能降低;6例患者经1年4个月至2年5个月随访,5例治疗成功,眩晕消失,1例耳鸣有缓解,4例听力无变化,1例听力下降18 dB.结论:应用本术既可控制眩晕,又可保存听力.

复方止呕颗粒与昂丹司琼防治化疗呕吐作用的比较

目的:比较中药复方止呕颗粒与西药昂丹司琼防治化疗呕吐的药效.方法:用顺铂造家鸽急性化疗呕吐模型,随机分为空白对照组、模型组、盐酸昂丹司琼组、复方止呕颗粒小、中、大剂量组;以呕吐潜伏期、呕吐次数和呕吐频率为指标观察各组家鸽的呕吐情况.结果:与模型组比较,盐酸昂丹司琼组、复方止呕颗粒小、中剂量组家鸽发生呕吐次数明显减少(P<0.01),但复方止呕颗粒大剂量组家鸽发生呕吐次数较多.结论:复方止呕颗粒与昂丹司琼均具有防治化疗呕吐的作用.

左侧视网膜剥夺鸽右视盖差异表达基因的克隆与鉴定

采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后右视盖基因差异表达的文库,研究在无光刺激的条件下视盖发育受阻的分子机制.随机测序21个序列,6个序列经反Northern 证实为真阳性,3个序列未发现明确的同源序列,另外3个分别与homo sapiens SH3GL2、G.domesticaus、 transthyretin有较高的同源性.21个序列中,11个基因片段被分配序列号.这些结果为深入研究视觉发育提供了有益的线索.