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GFP基因重组病毒在神经解剖研究中的应用
绿色荧光蛋白(GFP)基因重组病毒标记技术是神经解剖研究的新方法.此方法可以用于观察神经元的形态学特点、神经活性物质及其受体的化学构筑、神经元形态与投射终止部位和功能的关系以及有关的局部神经环路.该法弥补了以往形态学研究方法的一些缺陷,能为机能学研究提供直接的形态学证据.
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骨发育相关基因在SEDT中差异表达的研究
目的:分别靶向增强和干扰人软骨细胞(human chondrocytes-articular,HC-a)X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)基因,骨再生PCR芯片检测细胞内骨发育相关基因表达变化,观察干扰后基因表达谱的变化.方法:分别转入前期构建的靶向增强SEDL的腺病毒质粒pAd5-SEDL和靶向干扰SEDL的慢病毒质粒LV-siSEDL到293T细胞包装成重组腺病毒pAd5-SEDL和重组慢病毒LV-siSEDL,扩增重组腺病毒,收集病毒液,检测病毒滴度.将重组腺病毒、重组慢病毒以适感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别感染HC-a,实验分4组:增强组(HC-a/pAd5-SEDL,重组腺病毒pAd5-SEDL感染HC-a增强SEDL基因表达)、增强阴性对照组(HC-a/空载体(pAd5),空白腺病毒pAd5感染HC-a作阴性对照)、干扰组(HC-a/LV-siSEDL,重组慢病毒LV-siSEDL感染HC-a干扰SEDL基因表达)、干扰阴性对照组(HC-a/空载体(LV),空白慢病毒LV感染HC-a作阴性对照),通过QPCR检测HC-a中SEDL基因表达、Western blot检测HC-a中sedlin蛋白表达,验证是否成功干扰或增强SEDL基因表达,收集4组细胞mRNA进行骨再生PCR芯片(含84个基因)检测.结果:(1)收获高滴度重组腺病毒pAd5-SEDL,病毒滴度为2.6×1011 pfu/ml.并使重组腺病毒pAd5-SEDL和重组慢病毒LV-siSEDL成功感染HC-a.(2)HC-a SEDL基因表达量中增强组(2.14±0.36)较增强阴性对照组(1.21±0.25)增高(-0.022),干扰组(0.86±0.11)较干扰阴性对照组(1.34±0.06)降低(P=0.003);sedlin蛋白表达量中,增强组(0.56±0.04)较增强阴性对照组(0.37±0.05)增高(P=0.006),干扰组(0.13±0.02)较干扰阴性对照组(0.36±0.04)降低(P=0.001).(3)基因芯片结果:HC-a内SEDL基因干扰后,芯片结果显示:基因上调21个,下调5个.HC-a内SEDL基因增强后,骨再生PCR芯片结果显示:基因上调27个,下调12个.干扰组的差异表达基因中,在增强组中呈反向变化,且与软骨发育相关的基因有5个:COL2A、BMP3、FLT1、GDF10、IGF1.结论:通过增强及沉默软骨细胞内SEDL基因,发现骨发育相关基因中COL2A、BMP3、FLT1、GDF10、IGF1出现差异表达,可能与SEDL基因有关联.
关键词： X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 基因芯片 基因重组病毒
