微囊化转TH基因人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型的研究

目的探讨微囊化转酪氨酸羟化酶(TH)基因的细胞在帕金森病(PD)大鼠模型脑内存活、组织反应及对异常行为的治疗效果. 方法以人TH基因作为目的基因,重组到逆转录病毒载体感染人成纤维细胞,将细胞包裹在APA半透膜中进行微囊化后,植入6-羟多巴胺单侧损毁的PD大鼠模型纹状体内,观察移植物的存活状况和功能作用16周. 结果体外和植入体内的微囊化转基因细胞具有良好的存活能力.移植微囊化细胞可以使大鼠异常运动明显改善,移植位点周围的免疫反应较小. 结论微囊化对转基因细胞异种移植以进行基因治疗具有显著意义.

用mRNA差异显示法寻找人绒毛膜上皮癌与孕早期绒毛组织间的差异基因

目的寻找人绒毛膜上皮癌(JAR)与孕早期绒毛组织间的差异基因. 方法采用mRNA差异显示法(mRNA differential display PCR, DD-PCR),即分别提取正常孕早期绒毛及绒毛膜上皮癌的总RNA,在oligodT15作用下分别合成相应的cDNA,并以其为模板利用试剂盒中的20对引物组合和α-32PdATP,Taq酶等进行PCR,将两者的PCR产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)上电泳,放射自显影后寻找两者间的差异片段,回收差异片段进行二次PCR,对二次PCR产物先采用反杂交法初步筛选后再用Northern Blot鉴定. 结果从PAG上切下32条差异条带,经反杂交初步筛选出11个阳性片段,对11个阳性片段分别做Northern Blot鉴定,其中1个片段(T26)的基因长度约1.2kb,其在绒毛膜上皮癌中的表达远高于正常绒毛组织. 结论 T26基因片段可能是绒癌相关基因.

小鼠树突状细胞肉瘤不同转移能力克隆的分离筛选鉴定

目的利用小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞分离鉴定不同肺转移能力的克隆细胞株,为进一步筛选与肺转移相关cDNA片段奠定基础. 方法采用极限稀释单细胞克隆法,分离出不同克隆,经体内生长转移性,体外水解酶分泌等方法进行鉴定. 结果 DD1、DG6肺转移分别为100%,27%,其具蛋白酶水解能力的细胞分别为15.80%和5.39%,DG6的体内生长明显较DD1缓慢. 结论筛选出了高肺转移克隆DD1,低肺转移克隆DG6.

用BrdU标记技术观察大鼠脊髓上胸段灰质细胞的分化发育

目的观察脊髓灰质细胞的分化发育,寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的佳时间. 方法用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记DNA,ABC免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况. 结果孕鼠于E10d腹腔注射BrdU,胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角,脊髓侧角的BrdU免疫反应神经元较少,前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元;孕鼠于E11d腹腔注射BrdU,胎鼠脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少,侧角和前角BrdU免疫反应神经元增多;孕鼠于E12d腹腔注射BrdU,胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角,而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元;孕鼠于E13d、E14d腹腔注射BrdU,胎鼠脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元. 结论 BrdU标记技术能较好的标记脊髓灰质细胞,胎鼠脊髓进行BrdU标记的佳时间应选择E12d,已标记胎鼠脊髓的佳移植取材时间为E13d.

镉对大鼠前列腺损伤及锌保护的超微结构与硫胺素焦磷酸酶细胞化学的研究

目的研究镉对大鼠前列腺腹侧叶的超微结构影响及锌保护作用. 方法小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)及锌腹腔内注射后用透射电镜观察及硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学定量分析. 结果镉注射后4 h,前列腺上皮主细胞出现轻微的超微结构改变,3～7 d呈明显退变,15 d退变减轻,出现粗面内质网(RER)形成的同心圆性小体,30～60 d基本恢复正常.镉注射后4 h,TPPase反应产物较正常组减少,3 d和15 d进一步减少.锌保护组较相应的单纯镉组的超微结构损伤轻,且TPPase反应产物也较多. 结论镉对大鼠前列腺腹侧叶上皮主细胞早期直接损伤较轻,所致TPPase反应产物减少明显.锌对镉所致主细胞超微结构损伤及TPPase活性降低均有保护作用.

bax基因在小鼠睾丸及实验性隐睾中表达的研究

目的研究bax基因在正常小鼠睾丸中的表达、定位及隐睾所导致的改变. 方法以Western-blotting印迹法从蛋白水平检测bax基因在正常小鼠睾丸及实验性隐睾中的表达、变化;原位杂交技术及Northern杂交法从mRNA水平检测bax基因在小鼠生精上皮中的定位及隐睾所导致的改变. 结果 bax基因在正常小鼠睾丸中有弱表达,实验性隐睾导致其表达明显增强,表达细胞主要为精母细胞、精原细胞和精子细胞,支持细胞和间质细胞未见表达. 结论 bax基因可能在生精细胞主动退化的调节中起着重要作用.

猪体外成熟卵母细胞卵质膜电场行为的研究

目的研究体外成熟不同时间猪卵母细胞卵质膜的抗电击和电融合能力. 方法利用电刺激,显微操作与电融合方法分别对体外成熟不同时间猪卵母细胞的抗电击和电融合能力进行了研究. 结果 1.培养48h卵母细胞质膜的抗电击能力显著高于培养24h和36h的未成熟卵以及培养60h和72h的老化卵;2.体外成熟48h的卵母细胞,在进行同卵或异卵核体移值时,其融合能力强(融合率90%以上);3.将小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球分别移入IVM 48h去核猪卵母细胞,电融合率(75%～88.6%)无统计学差异. 结论同细胞核与细胞质成熟一样,细胞膜也存在成熟问题.培养48h的猪卵母细胞质膜的抗电击能力和发生电融合的能力达到强.

猪卵巢卵母细胞体外成熟及体外受精过程中皮质颗粒变化的研究

目的研究猪皮质颗粒在体外成熟及体外受精过程中的变化,以及皮质颗粒与多精受精的关系. 方法用异硫氰荧光素联接的花生四烯酸(FITC-PNA)标记体外成熟不同时间及体外受精不同时间皮质颗粒. 结果皮质颗粒在猪卵母细胞体外成熟过程中逐渐由皮质部向卵质膜下迁移,并在质膜下排布成单层.体外成熟过程中所排出的第1极体也被FITC-PNA所标记,说明第1极体中含有皮质颗粒.在对不同体外成熟时间的卵母细胞进行授精时发现,皮质颗粒的释放速度与体外成熟时间呈正比例关系.为进一步证实皮质颗粒的排放速度与多精受精之间的关系,还进行了精子穿透实验.结果显示,体外成熟48h的卵母细胞其多精受精率为73%,比体外成熟36h(83%)、24h(80%)的卵母细胞要低.并且进入卵子的精子数目(1.7)比后两者(分别为3.1和2.9)的少. 结论多精受精率与皮质颗粒释放的速度和数量的大小有关.

去甲二氢愈创木酸对胶质瘤诱导的血管内皮细胞成型的作用

目的观察去甲二氢愈创木酸(NDGA)对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞成型的影响并初步探讨其机理. 方法采用在Ⅰ型胶原凝胶上的细胞立体培养和内皮-胶质瘤细胞的联合培养法,观测人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞或其条件培养基对人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞形成管腔样结构的影响,同时以免疫组织化学结合图像分析的方法检测SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白的表达. 结果 100μmol/L的NDGA作用1～3d后,SHG-44细胞VEGF、bFGF的表达明显降低.联合培养3d左右,胶质瘤SHG-44细胞及其条件培养基均能诱导内皮细胞在Ⅰ型胶原凝胶上拉长并形成管腔样结构;而100μmol/L的NDGA可明显抑制内皮细胞变长和管腔样结构的形成(P＜0.01). 结论 NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型有抑制作用,此作用可能与瘤细胞VEGF、bFGF表达减低有关,提示NDGA具有抗血管生成的作用.

吗啡依赖大鼠脊髓Ⅱ板层初级传入纤维突触性终末数量变化的电镜定量研究

目的应用电镜定量方法探讨在吗啡依赖条件下,大鼠背根节感觉神经元发出的初级传入纤维能否在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触. 方法用光镜体视学方法测知吗啡依赖组和对照组大鼠L4脊髓Ⅱ板层横切面积没有差异的情况下,直接比较了两组动物脊髓Ⅱ板层神经毡单位面积内突触性终末的数量变化. 结果吗啡依赖组脊髓Ⅱ板层来自初级传入纤维的突触性终末数,明显多于对照组的初级传入纤维突触性终末数.其中来自无髓传入纤维的突触性终末数与对照组同类型的突触性终末数比较增加61%.来自有髓传入纤维的突触性终末数比对照组增多70%.尤其是来自含有致密核芯小泡的初级传入纤维突触性终末数比对照组多98%. 结论吗啡可能促进初级传入纤维在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触.

与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的抗凝血因子、粘附分子

目的探讨平滑肌细胞对内皮细胞功能的影响,为内皮细胞种植的组织工程学提供理论基础. 方法模拟血管壁的内层结构及内皮细胞与平滑肌细胞间的相互影响途径,建立内皮细胞与平滑肌细胞接触生长的联合培养模型,用免疫细胞化学、放射免疫学技术和图像分析等方法研究内皮细胞vWF、PGI2、CD29的合成、分泌及表达. 结果联合培养的内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原(vWF)的合成减弱,前列腺环素的分泌增加,整合素β1亚族的表达增强. 结论联合培养内皮细胞的细胞因子的合成、分泌和表达的变化更有利于其抗凝血及抗应力功能的调节.

Fos蛋白在血管加压素诱发急性心肌缺血大鼠脑内的分布

目的研究与急性心肌缺血功能有关的神经元在大鼠脑内的分布. 方法股静脉注射血管加压素诱发大鼠急性心肌缺血,用免疫组织化学ABC法,观察Fos蛋白在脑内的表达和分布. 结果 Fos阳性产物分布于梨状皮质、伏核、终纹床核、扣带回、斜角带核、下丘脑室旁核、视上核、视交叉上核、弓状核、中央杏仁核、穹窿下器、丘脑室旁核、外侧缰核、中脑中央灰质腹外侧区、脑桥臂旁外侧核、蓝斑、延髓内脏带等脑区,而在大脑白质及小脑中无明显的密集分布区. 结论心肌缺血诱发的Fos阳性神经元在大鼠脑内有着广泛的分布.

Fos蛋白在LPS免疫激发大鼠脑内的分布

目的研究与神经免疫调节有关的功能神经元在大鼠脑内的分布. 方法以腹腔注射脂多糖(LPS)为免疫激发模型,采用免疫组织化学ABC方法,观察Fos蛋白在脑内的分布情况. 结果 Fos阳性产物多集中分布在大脑额顶皮质、边缘前脑(扣带皮质、梨状皮质、外侧隔核和中央杏仁核等)、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、弓状核、视上核、视交叉上核、下丘脑外侧区、中脑导水管周围灰质腹外侧部、外侧臂旁核和延髓内脏带.小脑内无明显Fos分布密集区. 结论 LPS诱发的Fos阳性神经元在脑内有相对广泛的分布.

不同妊娠时期人胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的研究

目的探索妊娠不同时期人胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的规律及其与细胞分化的关系. 方法采用多种细胞连接蛋白基因cDNA探针,通过Northern印迹法,研究了不同妊娠时期胎盘绒毛细胞内Cx基因的表达状态. 结果 1. Cx基因表达有器官特异性,绒毛细胞中Cx43、Cx32及Cx40表达,而Cx31.1、Cx33、Cx37、Cx46不表达;2.在不同发育阶段的胎盘绒毛中,Cx43、Cx32、Cx40的表达水平与周龄呈各自特点的曲线关系;3.Cx基因的表达与绒毛细胞的分化及绒毛的形成过程基本一致. 结论某些Cx基因在调节绒毛细胞分化、增殖与胎盘形态发生过程中可能起重要作用.

细胞内Retinoid结合蛋白mRNA水平在生精过程中的周期性变化

目的研究大鼠睾丸细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ(CRBP-Ⅰ)及细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)mRNA水平与曲细精管生精上皮周期的相关关系. 方法分别以地高辛标记的大鼠CRBP-Ⅰ及CRABP-ⅡcDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交,应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量. 结果 CRBP-Ⅰ及CRABP-Ⅱ mRNA在支持细胞(sertoli cell, SC)中表达.CRBP-Ⅰ mRNAⅦ～ⅪⅤ期处于高水平,ⅪⅠ～ⅪⅤ期达到高峰,至Ⅰ期骤然下降,Ⅰ～Ⅵ期为低水平,其中Ⅱ～Ⅳ期低,仅为高峰时期的28%.CRABP-Ⅱ mRNA Ⅰ～Ⅵ期为低水平,Ⅶ～ⅪⅤ期水平增加1倍以上,其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰,随后缓慢下降. 结论 SC可合成CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ,且合成量具有与生精周期相伴的周期性变化.总的来说Ⅶ～ⅪⅤ期合成量较高,生精周期后期CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的高表达提示它们在圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用.CRBP-ⅠⅪⅠ～ⅪⅤ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用.总之,SC周期性分泌的蛋白可能是它调节周期性精子发生的重要因素.

晚期糖化终产物对糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞的影响

目的探讨血管平滑肌细胞(VSMC)在糖尿病早期的改变及其与晚期糖化终产物(AGEs)的关系. 方法应用荧光分光光度法、免疫组织化学、计算机图像分析和透射电镜等技术,研究链脲佐菌素诱导的糖尿病(DM)大鼠血浆和腹主动脉晚期糖化终产物(AGEs)的含量以及腹主动脉VSMC的变化. 结果从4周起,DM大鼠血浆和腹主动脉的AGEs显著增多;腹主动脉α-SM-肌动蛋白的相对面积减小,VSMC的细胞核密度增大,线粒体和粗面内质网增多.DM大鼠腹主动脉血小板源生长因子-A的免疫组织化学反应呈持续阳性.非酶糖化抑制剂氨基胍不降低血糖,但能降低血浆和组织的AGEs水平,对VSMC的改变也有减缓作用. 结论 VSMC在糖尿病早期已出现由收缩型向合成型转化的趋势,AGEs是VSMC发生改变的重要因素.

备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定

目的进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液,以获得某种神经营养活性物质. 方法用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质. 结果手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后,得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示,A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带. 结论结合生物活性检测结果,分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质.

实验性铅中毒对睾丸神经生长因子基因表达的影响

目的探讨实验性铅中毒对睾丸组织神经生长因子(NGF)基因表达的影响. 方法小鼠以0.5%醋酸铅自由饮服8周,测定血铅和睾丸铅含量.采用原位杂交法(以地高辛标记NGF DNA为探针)和RT-PCR方法,观察睾丸组织NGF mRNA含量的变化. 结果铅染毒小鼠血铅和睾丸组织铅含量明显升高;原位杂交结果显示,铅染毒小鼠睾丸杂交信号明显减少;RT-PCR结果表明,铅染毒小鼠睾丸组织NGF mRNA表达量明显下降. 结论铅中毒可使睾丸组织NGF基因表达量减少.

影响大鼠胚胎多巴胺能神经元原代培养因素的研究

目的试图通过方法改进获得高纯度原代多巴胺能神经元,并研究Matrigel及多聚左旋赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)等不同基质对于大鼠胚胎13d中脑黑质神经元突起生长的不同作用. 方法无菌技术取得孕13d SD大鼠胚胎,采用改进的取材方法,得到胎鼠腹侧中脑细胞,以较高密度(1×105/cm2)分别种入由Matrigel及PLL作为基质的塑料培养皿中.体外培养5d后,对培养物进行TH免疫细胞化学染色,测量TH免疫反应突起的长度并计算TH免疫反应神经元占细胞总数的比例. 结果和结论 1.采用改进的方法,能够得到高纯度的多巴胺能神经元(多巴胺神经元占培养细胞总数的比例为15%);2.与PLL相比,Matrigel能有效地促进多巴胺能神经元突起的生长,但不能特异地促进中脑培养细胞的存活.

多聚乙酸亚胺介导基因转移

目的采用一种新的多聚阳离子化合物--多聚乙酰亚胺(polyethylenimine,PEI),作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物. 方法骨骼肌细胞取自新生SD大鼠,经胰酶消化后培养,将LacZ基因DNA-PEI复合物导入骨骼肌细胞内,后用X-gal组织化学染色检测已转染的细胞. 结果 PEI可作为介导剂使LacZ基因在培养的骨骼肌细胞中表达,其表达率可达到30%. 结论 PEI在真核细胞中实施基因转移是一种有效方法,为基因治疗、研究提供了一种新的技术途径.

小鼠肺发育中细胞增殖与凋亡及相关调控基因的表达

目的探讨小鼠肺发育过程细胞增殖与凋亡的变化规律及凋亡相关基因p53、bcl-2在肺发育中的表达意义. 方法不同发育天数的小鼠肺组织,采用免疫组织化学及TUNEL法,观察细胞增殖与凋亡及相关基因p53、bcl-2的表达. 结果 1.胎14和16 d肺PCNA阳性细胞数达到高峰;之后PCNA阳性率逐渐下降;生后4到14 d,又恢复低水平的细胞增殖;2.小鼠肺发育过程中出现两个细胞凋亡高峰:即胎14至16 d及生后7 d;3.bcl-2阳性表达开始于胎19 d延续至生后14 d,仅见于近端支气管上皮及血管平滑肌细胞;4.小鼠肺发育的各个时期均未见p53阳性细胞. 结论小鼠肺发育过程中的细胞增殖与凋亡相伴存在,肺发育中的结构分化与两者的动态变化密切相关;肺发育中bcl-2的表达可能在于抑制细胞凋亡,细胞凋亡可能不依赖p53基因的调控.

小鼠胸腺树突状细胞的形态学观察

目的观察小鼠胸腺树突状细胞(TDC)的形态. 方法密度梯度离心结合小鼠CD5单抗淘洗法(panning),分离出小鼠TDC并行光镜及电镜观察. 结果台盼蓝排斥试验示90%以上细胞存活.光镜下发现初分离的TDC常和周围的胸腺细胞形成紧密的细胞簇.S-100蛋白染色见 TDC胞体和突起内有棕黄色反应产物.ANAE反应呈阴性或在核附近有数个小颗粒反应.ATP酶反应阴性.电镜见细胞表面有许多树状突起,核形不规则,胞质电子密度低,有丰富的线粒体、核糖体及完整的高尔基复合体. 结论所分离的TDC具有典型的树突状细胞的形态学特征.

人胚胎气管上皮几种粘蛋白表达的研究

目的研究人胚胎气管上皮细胞分化过程中,粘蛋白MUC1、MUC2和MUC5ac的表达,以及MUC5ac mRNA的表达. 方法免疫组织化学及原位杂交技术. 结果胚胎气管上皮细胞中MUC1呈阴性表达,不同胎龄的胚胎气管上皮细胞MUC2和MUC5ac均呈阳性表达.胚胎气管上皮的细胞核及胞浆中MUC5ac mRNA呈阳性表达. 结论胚胎气管上皮均能产生MUC2和MUC5ac粘蛋白,而且MUC5ac蛋白表达是在转录水平进行的.

吗啡备用根大鼠脊髓组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定

我室以往的研究表明,吗啡作用的部分去传入大鼠脊髓组织提取液中,大于10kD组份具有神经营养活性作用,但尚不知道是哪些分子量的蛋白质具有神经营养活性.为了寻找这些物质,本研究用Sephacryl S-200凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和组织培养等技术和方法,进一步分离纯化吗啡备用根大鼠部分去传入的脊髓组织提取液,以期获得某些神经营养活性物质,为吗啡促进脊髓可塑性变化的分子基础提供新资料.

解剖学报………2000年1～4期(第31卷)文题索引