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猴/人免疫缺陷嵌合病毒(SHIV)的研究进展
SHIV是在SIV其因组框架的基础上利用基因重组技术以HIV部分基因片段来取代SIV相应基因而构建的一种重组病毒.SHIV与亲本株病毒有相似的生物学特性,能在CD4+细胞、PBMCs、巨噬细胞中复制,并能引起猴发生AIDS症状.另外SHIV能诱使机体产生中和抗体,可以作为侯选疫苗株,在AIDS预防中有广阔的前景.
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免疫相关基因在结核性肉芽组织中的表达变化分析
目的:研究免疫相关基因在结核性肉芽组织中的差异表达.方法应用基因芯片技术和生物信息学方法,采用多聚赖氨酸修饰玻璃载玻片进行接触式点样,制作包含626个人体免疫相关基因片段的cDNA芯片.
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RTPCR技术检测人B组轮状病毒的方法研究
目的:建立一种快速灵敏的方法来检测人B组轮状病毒.方法:参照文献,设计并合成了8对不同引物,利用RT-PCR技术同时扩增相应的基因片段.结果:经过一轮RT-PCR后,均扩增出与引物对应的大小不一的DNA条带.结论:由于常规B组轮状病毒的免疫诊断和聚丙烯酰胺凝胶电泳存在各自的缺点,不能很好的应用于临床和实验室诊断.RT-PCR是一种高灵敏度的检测方法,8对特异性引物同时用于人B组轮状病毒的检测,其灵敏度和特异度相当高,且使用一个配方和一样的扩增程序,这使得在实验室诊断变得更为便捷和简单.
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对中小学生甲型H1N1流感患者及家属的心理疏导
甲型H1N1流感为急性呼吸道传染病,其病原体是一种新型的甲型H1N1流感病毒,在人群中传播.与以往或目前的季节性流感病毒不同,该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段.
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甲型H1N1流感流行病学特征及防控策略
甲型H1N1流感为急性呼吸道传染病,其病原体是一种新型的甲型H1N1流感病毒,在人群中传播.该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段.人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感,并可以人传染人,人感染甲流后的早期症状与普通流感相似,包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等,有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等.
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转基因技术的安全性考虑及展望
转基因技术是通过基因工程将外源基因片段引入目标生物体,使之具有新的稳定遗传性状.目前转基因技术已在动植物品种改良领域得到广泛应用,由于植物培育条件易于控制,因此种植作物中转基因技术的应用更为广泛.通过生物遗传信息的人为操作,使动植物和微生物的生物特性可以打破种属间的然隔离屏障进行转移.这一新的发展态势,一方面展示出先进科学技术在生产上的巨大应用前景,另一方面也预示着可能带来的不利影响.20世纪80年代以来,生物技术飞速发展,新的基因工程体不断问世,这既是机遇也是挑战.随着转基因作物商业化种植的全球性发展,转基因食品也有全球化的趋势.然而,转基因食品的安全性问题也越来越引起各国政府和国际组织的关注.因此,在生物技术迅速发展的同时,相应地加强基因工程工作的安全性管理,是非常重要的.
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不同基因型丙型肝炎病毒混合感染者体内丙型肝炎病毒基因型和序列的分布
应用套式PCR从一例维吾尔族丙型肝炎病毒(HCV)感染者血清[职业献血员,有多次献血史,无自觉肝炎症状,抗-HCV(+),PCR基因分型为Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ混合型]中,扩增出C区部分基因片段(357bp),将其克隆于T载体中进行基因型分析,并对不同基因型的C区片段进行序列测定.
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甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素HA1氨基端的表达及双抗体夹心ELISA法的建立
甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒是一种人类常见的流感病毒之一,2009年引起流感大流行的病毒并非一种全新的流感病毒[1],陆一涵等[2]推测可能是北美地区的H1N4病毒发生了一定程度的变异(包括重组和重排)所致。基因组测序发现,该病毒包含禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段[3-4],其中血凝素(HA)蛋白来源于猪谱系,一直存在于经典猪流感病毒和三源重排子猪流感病毒中[5]。HA蛋白是流感病毒主要的表面抗原,与病毒吸附穿膜及宿主对病毒易感性有关[6-8],其变异率较高,常通过突变使病毒逃脱宿主免疫引起新的流感大流行。这种变异主要体现在HA1氨基端球形头部的受体结合部位与抗原决定簇氨基酸的改变,因此甲型H1N1病毒HA1氨基端蛋白的表达是建立特异性检测方法的关键。笔者通过原核表达此次甲型H1N1流感病毒血凝素HA1氨基端蛋白,制备多抗血清,建立了特异性双抗体夹心ELISA检测法。
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半夏中的活性成分生物碱及其蛋白基因研究
目的:研究半夏属中药凝集素的序列分析以及基因片段的克隆.方法:参照已知半夏中凝集素的基因序列进行引物设计,选择RT-PCR法,自三叶半夏、掌叶半夏、盾叶半夏、石蜘蛛半夏、滴水珠半夏中分别克隆出凝集素的基因片段(长度为530bp),选择Proteomics Ex2PASy Server,finderORF,Genescan 3种软件对凝集素的基因片段分别给予分析.结果:基因片段的编码分别为三叶半夏170个氨基酸,掌叶半夏170个氨基酸,滴水珠半夏170个氨基酸,石蜘蛛半夏171个氨基酸,盾叶半夏107个氨基酸,并且所编码肽链当中均具有功能位点,如糖基化N位点、磷酸化蛋白激酶C位点和磷酸化酪蛋白激酶Ⅱ位点.因为编码序列当中突变的碱基因素,导致肽链氨基酸出现变化,因此具有多态性,且功能位点也存在差异.结论:中药半夏的凝集素基因能够成功克隆,但是否能够成功转移到其他药材植物当中,以此来获得新的抗虫中药植株,还有待进行更深层次的研究.
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Ad5F35重组腺病毒载体研究进展
在分子生物学领域,腺病毒载体是将外源基因导入动物细胞内经常使用的载体之一.由于其靶细胞种类多,转导效率高,对增殖期及静止期细胞均有很高的转导效率,不整合到宿主基因组中,不会引起插入突变,理化性质较稳定,易于分离纯化,可容纳较大的目的基因片段等优势,因而被广泛用于基因治疗、体外基因转染及基因疫苗制备等实验及临床研究中,其中Ad5F35型腺病毒载体为近年来研究热点之一,此文就其研究进展作一综述.
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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白基因片段的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(SARS)病毒为冠状病毒科.该病毒主要引起以破坏呼吸道肺上皮细胞为主的全身性疾病,引发免疫抑制和全身感染.同时,SARS病毒感染与全身血管病变有关.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,表达了SARS冠状病毒S1蛋白的C端部分,此区域包含主要中和抗原位点[1].利用原核表达系统快速高效的特点,可以迅速表达重要的新病原活性蛋白,为进一步建立特异性诊断方法、疫苗动物试验、中和抗体诱导、基因工程疫苗的研制提供实验手段和依据.同时也为疫苗研究提供了新的战略思路.
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中国妇女宫颈癌中HPV16E6基因序列分析及分子克隆
人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)感染与宫颈癌的发生有密切关系.研究发现,HPV16早期蛋白E6是肿瘤相关抗原,可在HPV相关肿瘤中持续表达,为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位.但也有文献报道,宫颈癌中HPV16E6基因可有一定的变异性,变异株可逃避机体体液和细胞免疫的攻击,给相应疫苗研制带来困难.为制定合理、有效的疫苗设计策略,本研究选择去除氨基端转化活性的HPV16E6羧基(C)端基因片段(nt254-559)作为构建疫苗的抗原基因,对我国妇女宫颈癌组织中E6C基因片段的序列进行分析,并在此基础上进行E6C的分子克隆,以期为宫颈癌HPV16E6DNA疫苗的研制提供资料.
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HIV-1基因限制性显示片段的制备(英文)
目的快速分离HIV-1基因片段制备DNA芯片探针. 方法以Sau3AⅠ酶切HIV基因后,将得到的限制性酶切片段两端接上接头.根据酶切位点与接头的序列设计通用引物.在该通用引物的3'端分别延伸1个碱基后,通过引物间的两两组合,将PCR反应分成10个亚组.纯化各组PCR产物,克隆到T载体上.挑取白色菌斑进行快速鉴定后扩大培养阳性克隆、提质粒.以质粒为模板扩增靶片段并测序. 结果每个亚型得到了十几个100~1 000 bp的HIV基因片段. 结论限制性显示技术是一种有效的快速分离制备基因片段的方法.
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转基因食品定性定量的检测分析方法
转基因食品(genetically modified foods,GMF)是指由细胞DNA中经非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段,并获得某种良好性状的动物、植物或微生物制成的食品.自1993年转基因作物Flavr Savr延熟番茄实现商品化以来,转基因食品的安全性问题一直为公众所注目,且至今尚无统一定论.
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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下,于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步,针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用,PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了,从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介,再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分,直接关系到PCR的敏感性和特异性,通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加,引物的职能也在不断增加,除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外,还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段(MSP1-17)的PCR扩增,其引物设计时,在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码,反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码,由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组[1]。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如,对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(DHFR)基因进行多态研究时,所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点,通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态[2]。又如,为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因(Pfmdr1)片段的多态性,使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列,带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因,从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在[3]。另外,在PCR引物末端带上某种配体,以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结,如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素,带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接[4]。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域的应用
1985年Smith率先将EcoRI内切酶的部分基因片段插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白基因Ⅲ区,使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面,并建立了噬菌体表面呈现技术(Phage display techniques).在此基础上,1990年Scott首次将编码随机序列肽的DNA与丝状噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ整合,使随机肽与噬菌体蛋白以融合形式表达,并呈现在噬菌体表面,从而建立了噬菌体随机肽库技术(Phage display random peptide libraries).近年来,噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具,在抗原表位(抗原决定簇)定位和模拟蛋白相互作用位点定位、功能配体或药物的筛选、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗上拓宽了研究者的思维,提供了新的途径.目前,该技术在寄生虫学领域同样受到研究者的青睐.本文就噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域中的应用作一综述.
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电子基因微芯片在医学研究中的应用
基因芯片(DNA microchip)也称 DNA 微阵列(DNAmicroarray),是把大量基因探针或基因片段按特定的排列方式固定在芯片载体上,形成致密有序的 DNA 分子点阵,按碱基互补配对原则与样品 DNA 杂交,然后通过计算机进行解读和分析获取大量信息,实现对生物样品高效、平行地检测或医学诊断.由于具有高通量、快捷、便宜等优点,基因芯片在各个领域起着越来越重要的作用.
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一种高通量筛选结直肠癌转移相关cDNA文库的方法
我们已利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),构建了结直肠癌转移相关cDNA消减文库,为进一步开展结直肠癌转移相关研究提供了大量的信息[1].如何高效、便捷、高通量地差异筛选该文库,成为目前急需解决的问题.以往多用Northern blot和反向Northern印迹进行差异片段的检测,但筛查量有限.cDNA微阵列用于文库筛查具有明显的优越性,但成本较高、对小插入片段的检出率还有待提高.本研究利用并改进了差异筛选方法,实现了对SSH消减文库的高通量筛选.该方法不仅有利于发现低丰度的差异基因片段,还能大大提高筛选正确率,加快基因鉴定的过程.
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利用广谱细菌聚合酶链反应-DNA测序技术进行细菌病因学诊断
16S核蛋白体RNA基因(16S rRNA gene, 16S rDNA)存在于所有细菌中,其基因序列由保守性序列和多样性序列相间排列而成.其中高度保守的序列几乎在所有细菌中都是一致的,而多样性序列随细菌种类不同而不同.因此,在16S rDNA 多样性序列两侧的高度保守序列中设计聚合酶链反应(PCR)引物,便可将多种细菌的多样性(特异性)基因片段扩增,再通过DNA测序技术,就能确定细菌的种类.
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肝炎基因诊断芯片检测肝炎患者血清及肝组织中HBVDNA、HCVRNA的临床研究
肝炎基因芯片是根据肝炎病毒的特征基因片段设计探针序列,将探针以微阵列形式排列在经过特殊处理的玻片上,从待测血液、组织标本中抽取微量肝炎病原体DNA(RNA),与探针杂交,用特有的荧光波长扫描芯片,通过计算机软件进行分析诊断.我们用病毒性肝炎基因诊断芯片,分别双盲检测40份乙型肝炎患者和健康人、丙型肝炎患者血清,99份肝炎后肝硬化肝组织蜡块标本,15份慢性乙型肝炎患者肝组织活检标本;同时用荧光微粒子定量法测定血清中乙型肝炎病毒标志物HBcAg,PCR法检测血清中HBVDNA、HCVRNA,用免疫组化法、原位分子杂交法分别检测肝组织HBcAg、HBVDNA.结果报道如下.