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HFRS患者BLCL的建立及HTNV S基因片段在其内获得长期稳定的表达
虽然对汉坦病毒核蛋白(HV NP)氨基端蛋白的原核表达产物的抗原性及免疫原性已进行了许多研究,并已用于出血热的诊断,但该抗原表位的精确一级结构及其基因定位迄今尚未完全明确.而研究T细胞表位的前提是首先要构造含病原体抗原基因片段的表达载体质粒.要实现CTL效应细胞对靶细胞的有效杀伤,前提条件之一是效靶细胞必须具有相同的HLA型别.通常选用与效应细胞同源即同一供者的PBMC建立靶细胞,本研究采用与HV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line,BLCL)建立靶细胞系,将含有不同汉滩病毒(HTNV)S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系.
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56例神经系统疾病患者外周血尼帕病毒N基因片段检测
尼帕病毒(Nipah vires,NiV)为副黏液病毒,Henipavims亚属,单股负链RNA病毒,不分节段.人感染NiV后病死率达4|D%~70%,因此,NiV被列为危险的生物安全4(P-4)级病原.NiV共有6个结构基因,其中N基因高度保守且高效表达,因此被广泛用于NiV感染的诊断和流行病学调查.
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SARS冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其活性测定
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)病原体是SARS冠状病毒(SARSCoV),研究开发安全有效的SARS-CoV疫苗以控制SARS成为热点.经过对12株SARS冠状病毒基因序列比较,发现S蛋白的氨基酸突变率仅为0.23%,其较高的保守性为疫苗研究奠定了良好的基础,由此,S蛋白成为候选疫苗的重要靶位[1].pcDNA3.1(+)是一种高效率的质粒型真核表达载体.本研究将SARS-CoV的S1基因片段连至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组pcDNA3.1(+)/S1并初步研究其免疫效果.
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多发性硬化患者博尔纳病病毒p24基因片段的检测
博尔纳病病毒(Boma disease virus,BDV)是引发神经系统感染性疾病病原体的一种.我国重庆、哈尔滨、贵州等地区在病毒性脑炎、抑郁症、精神分裂症、帕金森病等部分疾病患者血液和脑脊液中检出过BDV,但多发性硬化(multiplesclerosis,MS)患者中未见报道.我们在13例MS患者外周血单个核细胞(PBMC)中检测BDV-p24基因片段,2例阳性,报道如下.
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SARS冠状病毒S蛋白高保守性C区重组核酸疫苗肌肉免疫和黏膜免疫的研究
构建含SARS冠状病毒S蛋白基因高保守性C区基因的真核表达重组质粒pCDNA-Sc作为DNA疫苗,其中C区位于SARS冠状病毒S蛋白S1亚基基因片段的811~1221bp区域的病毒外部羧酸端多肽肽段.
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改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)作为递送载体在抗感染治疗中的应用
改良型痘苗病毒安卡拉株( modified vaccinia virus Ankara,MVA)是人类在寻求痘苗病毒作为天花疫苗的过程中获得的高度减毒的痘苗毒株. MVA来源于一个土耳其的痘病毒毒株(chorioallantois vaccinia virus Ankara,CVA),CVA在鸡成纤维细胞中传代570代后得到MVA[1]. 对MVA全基因序列测序后发现, MVA基因组全长178 kb,与CVA相比MVA在传代的过程中丢失了大约15%(30 kb)的病毒基因,这些基因大多与病毒的毒力和宿主选择范围密切相关[2].MVA在允许细胞(permissive cell),如BHK-21、CEF等细胞内,可以完成完整的生活周期. 而在非允许细胞( non-permis-sive cell) ,如大部分哺乳动物和人类细胞内,MVA病毒的早期和晚期蛋白都进行了表达,但是病毒不能包装成完整的粒子[3]. 与其他痘病毒一致,MVA在感染细胞后,基因组不进入细胞核,而是在细胞质中依赖自身的启动子与转录系统来完成基因的复制与表达. 传代过程中MVA丢失了6个主要的基因片段,这些部位可以用来插入25 kb以上的外源基因,并且在外源基因插入后并不影响病毒本身的感染能力和表达能力[4].
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汉坦病毒疫苗株84FLi的全基因序列测定
汉坦病毒(Hantavirus, HV)属于布尼亚病毒科,其基因组是一个单链含大(L)、中(M)和小(S)3个基因片段的负链RNA.编码的结构蛋白分别为L蛋白(即依赖RNA的RNA多聚酶)、外膜糖蛋白G1和G2以及核壳蛋白.
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甲型H1N1流感14例临床特点分析
2009年3月,墨西哥暴发"人感染猪流感"疫情,并迅速在全球范围内蔓延.世界卫生组织(WHO)初始将次型流感称为"人感染猪流感",后将其更名为"甲型H1N1流感".6月11日全球进入流感大流行阶段.此次流感为一种新型呼吸道传染病,其病原为新甲型H1N1流感病毒株,病毒基因中包含有人流感、禽流感和猪流感三种流感病毒的基因片段.
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甲型H1N1流感诊疗方案(2009年第三版)
2009年3月,墨西哥暴发"人感染猪流感"疫情,并迅速在全球范围内蔓延.世界卫生组织(WHO)初始将此型流感称为"人感染猪流感",后将其更名为"甲型H1N1流感".6月11日,WHO宣布将甲型H1N1流感大流行警告级别提升为6级,全球进入流感大流行阶段.此次流感为一种新型呼吸道传染病,其病原为新甲型H1N1流感病毒株,病毒基因中包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段.
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与克拉霉素耐药相关的幽门螺杆菌基因23S rRNA序列分析
幽门螺杆菌是寄生于人体胃部的革兰阴性杆菌,是胃溃疡、十二指肠球部溃疡和胃癌的主要致病因素之一,与胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤关系密切.随着大环内酯类抗生素广泛应用于治疗幽门螺杆菌感染,幽门螺杆菌的耐药现象日益严重.现已证实,幽门螺杆菌对克拉霉素耐药主要与其23S rRNA基因的点突变有关.为此,本研究通过对江苏苏中沿海地区分离培养的幽门螺杆菌菌株的23S rRNA部分基因片段进行序列分析,希望了解本地区幽门螺杆菌耐药菌株的基因突变和耐药的关系.
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逆转录-环介导等温扩增方法检测甲型H1N1流感病毒
2009年3月墨西哥暴发"人感染猪流感"疫情,造成人员死亡.研究发现,此次疫情的病原为变异后的甲型H1N1流感病毒,甲型H1N1流感病毒属于正黏病毒科(orthomyxoviridae),甲型流感病毒属(influenza virus A).该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感3种流感病毒的基因片段,可以在人间传播.
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巨细胞病毒pp150和gp52融合基因的克隆表达及重组蛋白的抗原性研究
人巨细胞病毒(HCMV)是一广泛传播的人类致病原.我们采用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增了gp52蛋白包含IgM抗原决定簇的基因片段[1]和 pp150蛋白C端包含IgM抗原决定簇的基因片段,然后将 gp52和pp150 两个基因片段串联克隆至pGEX-5x-3表达载体,成功构建了高效表达融合基因的重组载体,并对表达产物的抗原性进行了鉴定.
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应重视对乙型肝炎病毒准种特点的研究和认识
乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的慢性肝脏疾病仍然是我国主要的传染病.1979年首次完成HBV DNA的克隆化之后,随着对更多的HBV DNA全基因或基因片段的克隆和序列分析,发现不同患者感染的HBV DNA序列存在差别,而且不同基因序列的HBV感染机体后产生的抗体应答的性质也存在显著的差别,因此,根据HBV感染之后抗体应答性质的差别,将HBV分成不同的血清型(serotype);根据HBV DNA基因序列的不同,将HBV分成不同的基因型(genotype).临床研究结果表明,不同血清型和基因型的HBV感染的流行病学特点、临床表现、预后、抗病毒治疗的应答等存在显著的不同.这仅仅是认识到不同患者感染的HBV存在异质性(heterogeneity),但是对同一患者血清中存在的不同拷贝的HBV的基因序列究竟是否存在差别及其意义如何,一直没有引起人们的广泛重视.实际上,每一个患者血清中都存在大量拷贝的HBV,每一拷贝的HBV DNA序列不尽相同,表现出准种(quasispecies)的特点[1,2].
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EAA/EMQN Y 染色体微缺失分子诊断应用指南解读
Y染色体长臂上与精子发生密切相关的区域被命名为无精子因子( azoospermia factor , AZF ),分为AZFa、AZFb、AZFc 三个区域, Y 染色体微缺失即AZF区域基因片段的缺失,在精子发生障碍引起的男性不育中,Y染色体微缺失的发生率仅次于克氏综合征( Klinefelter′s syndrome ),是居于第二位的遗传因素,已作为常规基因检测成为无精症或少精症诊断流程中的重要组成部分。
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实时荧光定量聚合酶链反应技术开始用于临床常规基因诊断
聚合酶链反应(PCR)技术问世20年来,已经成为致病基因分析的重要手段.但是,多年来PCR一直很难直接用于临床疾病的常规诊断,其原因主要是PCR常规实验中存在的污染问题难以解决.常规PCR是将样品和实验反应剂加入小试管进行基因扩增,PCR后汲取反应产物行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳,用PCR产物是否出现特异性条带来判断样本中有无疾病中发生变异的基因片段.尽管这种方法简便易行,但很难避免试管中的PCR产物飞散于实验室,污染下一次检测的结果,导致出现假阳性,影响疾病诊断.长期进行PCR的许多实验室都有污染造成试验失败的经验和教训.常规PCR的另一缺陷是PCR产物不易定量.
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含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达
目的:构建并鉴定含人全长热休克蛋白72(HSP72)基因的重组腺病毒,为严重创伤后缺血缺氧损伤的防治提供基因治疗措施.方法:用同源重组方法构建含人全长HSP72目的基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-HSP72),并加以鉴定、扩增,以制取高滴度AdCMV-HSP72转染液,体外转染肠上皮细胞株IEC-6,检测目的基因表达.结果:将构建的重组腺病毒载体AdCMV-HSP72转染肠上皮细胞并表达48 h后,RT-PCR检测转染组显示特异性扩增的532bpHSP72目的基因片段.对照组(转染空腺病毒载体组)扩增结果为阴性.蛋白印迹结果显示AdCMV-HSP72转染组HSP72蛋白的表达明显增高.结论:腺病毒载体可较高效率介导HSP72在肠上皮细胞的表达.所获AdCMV-HSP72重组腺病毒可进一步用于基因治疗研究.
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鼠CD40配体基因的克隆及表达
目的:克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因,为进一步研究打下基础.方法:用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,重组质粒用脂质体转染H22细胞,G418筛选抗性细胞,用RT-PCR检测目的基因的插入,间接免疫荧光检测目的基因的表达.结果:含mCD40L基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后,转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞,经RT-PCR鉴定有含目的基因,间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达.结论:成功克隆mCD40 L基因并在真核细胞得到有效表达.
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中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1基因的克隆与表达
目的:克隆和表达中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1;ⅡMP-1)基因,获得具有抗原性的人TIMP-1蛋白.方法:用RT-nest-PCR扩增TIMP-1编码区基因片段,用基因重组技术构建含该片段的重组质粒并进行序列分析.在大肠杆菌E.coli中表达融合蛋白MBP-TIMP-1,用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定,并用亲和层析试剂盒纯化融合蛋白MBP-TIMP-1.结果:经核苷酸序列分析表明,本研究克隆的中国人TIMP-1为624bp,与报道的国外TIMP-1基因序列同源.经SDS-PAGE和Western blot表明,表达的融合蛋白MBP-TIMP-1分子质量为66Ku,具有TIMP-1的抗原性,并可进行亲和层析纯化.结论:克隆了中国人TIMP-1基因,表达和纯化了具有免疫原性的融合蛋白MBP-TIMP-1,他将对肝纤维化的诊断有一定作用.
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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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甘氨鹅脱氧胆酸钠致阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中bcl-2 mRNA的表达意义
目的:探讨bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中的调控作用.方法:健康♂Wistar大鼠,进腹,游离出胆总管,于肝门部结扎胆总管并切断,远端再予以结扎.进腹后不结扎切断胆总管作为阴性对照.结扎后3,7,14,21 d处死大鼠,每组8只.采用胶原酶原位肝灌注法获取体外培养正常大鼠及阻塞性黄疸大鼠肝细胞.分别收取正常大鼠及胆总管结扎大鼠肝细胞1×109/L-1,用Trizol试剂盒一步法提取大鼠肝细胞总RNA,行RT-PCR扩增;用PCR扩增bcl-2和对照β-actin基因片段;分离的正常大鼠及胆总管结扎14 d大鼠的肝细胞行原代培养,培养板内置小飞片,使用100μamd.L-1甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)作用于两组肝细胞24h后,用FCM法分析肝细胞的凋亡比率,用TUNEL技术进行肝细胞凋亡的原位检测.结果:体外培养正常大鼠及结扎3 d大鼠肝细胞bel-2 mRNA的表达为阴性,仅见β-actin条带;胆总管结扎大鼠体外培养肝细胞在结扎后7 d即可见肝细胞内bel-2 mRNA的表达,其吸光度A值为O.13±0.15;结扎后14、2l d也可检测其表达,bcl-2 mRNA吸光度在结扎14 d达高峰,为O.56±0.21,且与结扎7、2l d相比,两者差异有显著性(P<0.05);100tanol@L-1的G,CDC作用正常大鼠肝细胞后,凋亡明显增加,凋亡率为34.9±2.9%;胆总管结扎14d大鼠的肝细胞凋亡比率为15.6±2.1%,100μanol@L-1的GCDC作用胆总管结扎14 d大鼠肝细胞后,凋亡率无明显增加,为17.3±1.1%,两者差异无显著性(P>0.05);GCDC作用的两组大鼠肝细胞凋亡率差异有显著性(P<0.05).结论:阻塞性黄疸大鼠肝细胞有bcl-2基因的表达,正常大鼠肝细胞则无表达;在阻塞性黄疸过程中,大鼠肝细胞通过表达bcl-2来抑制胆盐致肝细胞的凋亡作用.