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胃黏膜标本中幽门螺杆菌克拉霉素常见耐药位点PCR直接检测分析
幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori， HP ）是定植于人类胃部的螺杆状革兰氏阴性菌，人群感染率超过50％。 HP感染与胃炎、消化性溃疡及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病密切相关。克拉霉素是根除HP应用广泛的抗生素之一，耐药率的不断增高严重影响着含克拉霉素 HP 根除治疗方案的成功率［1］。现已证实，23 S rRNA V 区的点突变（ A2142 G／C， A2143 G）是引起HP产生克拉霉素耐药的主要因素［2］。本研究通过23 S rRNA V区PCR产物测序方法直接检测胃黏膜组织中HP相关基因特征从而快速获得克拉霉素耐药情况，并分析与相关菌株耐药表型测定（ E-test 药敏方法）结果的一致性。
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与克拉霉素耐药相关的幽门螺杆菌基因23S rRNA序列分析
幽门螺杆菌是寄生于人体胃部的革兰阴性杆菌,是胃溃疡、十二指肠球部溃疡和胃癌的主要致病因素之一,与胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤关系密切.随着大环内酯类抗生素广泛应用于治疗幽门螺杆菌感染,幽门螺杆菌的耐药现象日益严重.现已证实,幽门螺杆菌对克拉霉素耐药主要与其23S rRNA基因的点突变有关.为此,本研究通过对江苏苏中沿海地区分离培养的幽门螺杆菌菌株的23S rRNA部分基因片段进行序列分析,希望了解本地区幽门螺杆菌耐药菌株的基因突变和耐药的关系.
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沈阳地区幽门螺杆菌耐药情况的研究
目的:观察研究H.pylori对克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林及四环素的耐药情况,指导临床治疗.方法:从消化性溃疡、肿瘤或慢性胃炎患者的胃黏膜中分离培养出H.pylori共30株,利用E-test方法进行药物的MIC测定,现察耐药情况.结果:30株H.pylori中有7株对克拉霉素耐药,12株对甲硝唑耐药,2株对四环素耐药,未发现对阿莫西林耐药的H.pylori菌株.耐药率分别为23.3%,40%,6.7%及0%.结论:在辽宁省沈阳市H.pylori对克拉霉素及甲硝唑的耐药率比较高,而对阿莫西林高度敏感,临床选择H.pylori根除方案时要考虑这一点.
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幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的分子基础
目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)对克拉霉素耐药的分子基础.方法:采用E-test方法对35例Hp的临床分离株进行克拉霉素的MIC(minimal inhibitory concentration)检测,大于或等于8 mg/L为耐药株.按酚-氯仿方法提取Hp的DNA,PCR方法扩增23S rRNA基因中2 047-2 347之间的片段,对PCR产物进行序列分析,观察耐药株的基因突变情况.结果:与敏感菌(No33)序列比较,No13存在1个突变位点,即2 289位点T变成了C(T2289C),No17存在2个突变位点,即G2224A、T2289C,No22存在3个突变位点,即G2224A、C2245T及T2289C.三株耐药Hp菌株的MIC值分别是:No13为8.0 mg/L,No17为64 mg/L,No22为大于256mg/L.随着耐药性的提高(表现在MIC值的升高),高耐药性菌株的突变位点多于低耐药性菌株的突变位点.结论:与耐药有关的3个突变位点,G2224A、C2245T及T2289C,国内外未见报道,反映了Hp耐药的地区差异.
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幽门螺杆菌对甲硝唑和克拉霉素耐药的分子机制
微生物耐药是包括幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,下称Hp)感染在内的许多微生物感染治疗中日益受到重视的问题.抗生素联合方案根除Hp,必须克服其耐药问题.在研究Hp对抗生素的耐药机制时,必须把外部因素和内部因素区分开.外部因素包括感染的程度、机体的免疫状态、治疗方案的依从性.内部因素包括生物化学和遗传为基础的微生物耐药机制.通常,对抗生素的耐药性是通过获得编码酶的遗传物质而产生.这些酶可使抗生素失活,外排抗生素增加或改变药物的靶位点.目前,发现大多数Hp菌株对抗生素耐药是突变引起的[1-5].对Hp菌株26695和J99的整个基因组序列分析,证实其缺乏抗生素耐药基因[6,7].关于Hp耐药株研究的报道已经越来越多,但主要集中在Hp对甲硝唑和克拉霉素耐药的研究上,而重点涉及到分子机制的研究.本文就Hp对甲硝唑和克拉霉素耐药的分子机制进行综述.
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幽门螺杆菌耐药机制的研究现状
幽门螺杆菌(H.pylori)感染治疗的研究一直是H.Pylori研究领域中的热点,随着研究的深入,发现根除的难度逐渐增加,其原因是H pylori耐药菌株发生率的增加.近报道H.pylori耐药是全球性的,其对甲硝唑和克拉霉素的耐药是根除H.pylori治疗失败的主要原因[1].克拉霉素和甲硝唑及其一些相关抗生素为什么耐药?本文就近国内外对H.pylori耐药机制的研究作一综述.一、H.pylori对克拉霉素的耐药性克拉霉素为新一代大环内酯类药物,该药具耐酸和能溶解于酸性pH胃液中的特性及口服后生物利用率好、副作用少等优点.单一用药的H.pylori根除率为42%～54%,是目前已知抗生素中对H.pylori作用强的药物之一[2].因而,近年新的抗H.pylori二联或三联治疗方案中将其作为主要药物.然而,对克拉霉素耐药的产生,使含克拉霉素治疗方案的疗效明显下降.Ducons等[3]采用兰索拉唑+克拉霉素+阿莫西林的三联疗法,在克拉霉素敏感菌株中的根除率为83%,而在其耐药菌株中的根除率仅为20%.关于克拉霉素的原发耐药率各家报道不一,但一般都＜10%.Baz-zoli等[4]报道,根除治疗失败者,对克拉霉素的继发耐药率至少为50%.因此,对克拉霉素的继发耐药比原发耐药更常见,也更应引起人们的重视.
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幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的分子机制研究
目的 研究幽门螺杆菌(Hp)对克拉霉素耐药的分子机制。方法 用E-test进行克拉霉素药敏试验，选取治疗前敏感、治疗后耐药的配对菌株及原发耐药Hp菌株进行研究；应用随机扩增多态性DNA(RAPD)分析，确定治疗前后菌株的同一性；用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析探讨克拉霉素耐药机制。结果 9株克拉霉素耐药菌株23S rRNA基因功能区V PCR扩增片段，8株被BsaI酶切，9株均未被BbsI酶切，提示8株在2144位点有A→G突变。结论 上海地区大多数克拉霉素耐药Hp菌株存在23S rRNA基因功能区V 2144位点A→G突变。
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盐酸小檗碱、阿莫西林、兰索拉唑、铋剂四联疗法根除幽门螺杆菌283例的临床研究
目的 评价盐酸小檗碱、阿莫西林、兰索拉唑、铋剂新四联疗法根除H.pylori的有效性和安全性.方法 前瞻性纳入2015年12月至2016年4月在门诊就诊的H.pylori感染初治患者566例,分为观察组(盐酸小檗碱+阿莫西林+兰索拉唑+胶体酒石酸铋)和对照组(克拉霉素+阿莫西林+兰索拉唑+胶体酒石酸铋)各283例,两组疗程均为14 d.治疗结束后4周,比较两组患者的H.pylori根除率和不良反应发生率.统计学方法采用t检验和卡方检验.结果 两组患者基线特征包括性别、年龄、BMI、症状评分等差异均无统计学意义(P均>0.05).治疗结束后4周,观察组和对照组H.pylori根除率根据符合方案分析(PP)分别为87.5%(244/279)和87.1%(242/278),根据意向性分析(ITT)分别为86.2(244/283)和85.5%(242/283),差异均无统计学意义(x2=0.021、0.058,P均>0.05),两组整体不良反应发生率分别为12.5%(35/279)和16.5%(46/278),差异无统计学意义 (x2=1.795, P=0.180).结论 盐酸小檗碱联合阿莫西林的含铋剂新四联方案与克拉霉素联合阿莫西林的含铋剂标准四联方案均能有效根除H.pylori感染,新方案可作为西安地区或克拉霉素高耐药地区的一线根除方案.
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用TaqMan-MGB荧光探针法检测北京地区幽门螺杆菌A2142G/A2143G耐药突变
目的 用TaqMan-MGB荧光探针法检测北京地区幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G、A2143G突变情况.方法 收集北京大学人民医院消化科门诊尿素酶试验及病理活检均阳性的患者233例,所有患者均应用MGB荧光探针法和一代测序法对耐药位点A2142G/A2143G进行检测,其中79例患者同时进行传统培养联合药敏法检测.分析耐药位点突变发生率与患者年龄、性别和消化性溃疡的关系.结果 79例传统培养联合药敏法检测的标本中成功培养出42例,占53％(42/79),其中耐药型菌株22例,敏感型菌株20例,而MGB荧光探针法成功检出77例,占97％(77/79),其中野生型28例,突变型49例.在传统培养+药敏法培养出的42例阳性标本中,两种方法检出的符合率为86％(36/42).233例标本中,一代测序法成功检测出214例,占92％(214/233),其中野生型138例,突变型76例.在76例突变型标本中,含A2142G突变(包括A2142G和A2142G+野生)的标本占5％(4/76),含A2143G突变(包括A2143G和A2143G+野生)的标本占95％(72/76).MGB荧光探针法成功检测出231例,占99％(231/233),其中野生型141例,突变型90例.在90例突变型标本中,含A2142G突变的标本占14％ (13/90),含A2143G突变的标本占86％(77/90).一代测序法和MGB荧光探针法在区分是否含有突变上的符合率为95％ (203/214).根据MGB荧光探针法检测结果将患者分为突变组与野生组,2组在年龄和性别上差异无统计学意义(t年龄=-0.685,P=0.4 93;x2性别=0.065,P=0.890),而在消化性溃疡发生率上差异存在统计学意义(x2=6.653,P=0.044).结论 TaqMan MGB荧光探针法可应用于临床快速、敏感地检测患者胃黏膜标本中幽门螺杆菌克拉霉素A2142G、A2143G耐药位点突变情况.
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应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性
目的 建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法.方法 抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23S rRNA区187 bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序.结果 56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100％,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致.结论 DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景.
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淮南地区幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性及其耐药分子机制的研究
目的 探讨淮南地区幽门螺杆菌(Helimbacter pylori, Hp)对克拉霉素耐药情况及其耐药分子机制.方法 用E-test和琼脂稀释法进行克拉霉素药敏试验,提取Hp基因组DNA,PCR扩增Hp 23S rRNA基因,并用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析克拉霉素耐药机制.结果 淮南地区克拉霉素耐药率为9.15%(27/141),克拉霉素耐药与性别、年龄无关.PCR从Hp基因组DNA中扩增出425bp的Hp 23S rRNA基因,PCR-RFLP检测,27株耐药菌株均可被Bbsl酶切成332、93bp两个片段,未检测到被BsaⅠ酶切的耐药菌株.结论 淮南地区克拉霉素耐药率较高,耐药菌株存在23S rRNA基因功能区V 2143位点A-G突变.
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江苏宿迁地区Hp感染及粪便基因检测克拉霉素耐药现状
目的 了解江苏宿迁地区幽门螺杆菌(Hp)感染及对克拉霉素的耐药情况.方法 收集2016年10月～2017年10月在宿迁市第一人民医院行14C呼气试验检查的健康体检者的Hp检查结果,随机留取412例受检者的个人资料,并随机留取146例Hp感染者的粪便标本行粪便基因克拉霉素药敏试验,统计Hp感染率,比较相关因素对Hp感染的影响,初步了解Hp克拉霉素耐药情况.结果 共2919例纳入研究,1248例Hp阳性(42.75％),男性人群的Hp感染率为44.89％,高于女性的39.89％(P<0.05),20岁以下人群Hp阳性率低(35.42％),21～40岁人群感染率高(45.18％),40岁以上人群随年龄增大感染率有下降趋势,Hp感染与抽烟、 饮酒、 个人收入及空腹血糖值之间均无明显关系,146例Hp阳性的粪便标本中,137例可成功提取细菌基因组DNA,其中29个样本的PCR产物经BsaⅠ酶切出现两条目的条带,所有样本的PCR产物经MboⅡ酶切后均未被切开.结论江苏宿迁地区Hp感染率为42.75％,男性人群及年龄在20～40岁感染率高,粪便基因药敏试验显示克拉霉素耐药率高于21.17％,这将为宿迁地区Hp感染防治提供更有力的依据.
