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由感而发,对中医药精确化的思考
应德国著名临床化学家Gerd Assmann教授之邀,1993年新年伊始我就开始了赴欧求学之旅。当踏上这个令我仰慕已久、具有先进的技术和优美的环境、哺育着诚实的德意志人民的土地之后,我以前所未有的热情和干劲投入到学习和工作中去。以分子生物学技术为手段,我的科研项目很快取得了进展,首次发现了胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因若干新的突变位点,并分别阐明了它们各自对血脂代谢的影响,这一工作曾在1994年美国心脏年会上交流并获得专家高度评价,有关论文发表在国际著名医学杂志《Circulation》。
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催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展
甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素 P450(CYP450)氧化酶 BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用,基于细胞色素 P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干 P450 BM3突变酶的基础上,通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法,筛选出催化甾体羟基化的相关 CYP450。根据易错 PCR等定向进化技术获得了突变位点信息,进一步采用(饱和)定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析,再经过筛选获得既高于亲本酶也高于易错 PCR技术得到的突变酶活力的新突变酶,并对突变体进行功能验证,进一步阐明甾体羟基化的可行性和重要性。此外,P450 BM3催化底物和生成产物的选择性可以通过迭代的组合活性位点突变而改变。本文旨在探究近年来科研人员在 P450氧化酶 BM3蛋白质工程催化甾体羟基化的改良领域中所做的尝试、获得的成果以及存在的问题,为 P450 BM3羟基化疏水性甾体的深入研究提供理论依据。
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HBVpreC/C区基因突变与原发性肝癌预后的关系
目的 研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)preC/C区基因突变与原发性肝癌患者预后的关系.方法 收集81例乙型肝炎病毒相关性肝细胞肝癌(hepatitis B virus associated hepatocellular carcinoma,HBV-HCC)患者的癌组织并提取基因组DNA,对HBV preC/C区基因进行扩增和测序,并根据NCBI数据库鉴定出其突变位点,运用Kaplan-Meier和Cox回归等方法分析HBV-HCC患者的临床资料、突变位点与其术后生存期之间的关系.结果 门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小是与HBV-HCC患者术后生存相关的独立危险因素.1915、2134、2176、2221和2260突变位点被确定为预测HBV-HCC患者生存相关的独立危险因子,1979和2245突变位点与HBV-HCC患者生存具有临界统计学差异.结论 门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小以及HBV preC/C区基因的以上7个突变位点被确定为与肝癌患者术后预后相关的独立危险因素.
关键词: HBV-HCC HBVpreC/C区 HBV-DNA 突变位点 预后 -
江西籍肝豆状核变性第八外显子突变的研究
肝豆状核变性又称Wilson's病(Wilson's disease,WD),是一种铜代谢障碍的常染色体隐性遗传病,该基因定位于13q14.3,它含有21个外显子及20个内含子,其基因表达产物为参与铜转运的三磷酸腺苷酶(ATP)7B,故该基因又称为ATP7B基因,ATP7B酶分为三个区,第一区为金属离子结合区,第二区为磷酸化区,第三区为跨膜区.基因突变方式多种,但以点突变为主.因基因突变导致ATP7B酶发生改变,从而不能有效地运输铜而形成铜蓝蛋白,因此使铜在组织器官存积,发生脑、肝、肾等多脏器受损.经国内外学者长期研究表明[1,2],在众多的点突变中,中国人肝豆状核变性以2273位点G→T突变为高发突变热点[3],上海二医大对60例WD患者进行了Arg778Leu突变的检测,突变频率达45.6%,因此我们对12例肝豆状核变性患者采用荧光定量PCR方法检测Arg778Leu基因突变,结果这12例江西籍肝豆状核变性患者中有10例存在该突变,他们均为杂合子.而5例正常体检者均正常.说明Arg778Leu突变为肝豆状核变性的高发突变位点,可作为肝豆状核变性众多突变中的首选.
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乙型肝炎病毒S基因系列单突变克隆人工构建
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因高频突变位点(T126S,M133L,T144A)变异对HBV生物学活性的影响,开发新的检测HBsAg试剂盒,混合HBV多价疫苗及多效价的乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG).方法:利用人工定点突变技术,基因重组,建立系列HBVS基因‘a'决定簇真核细胞表达的质粒.结果:测序和计算机软件分析,克隆的质粒基因突变序列完全正确,并且能在真核细胞中表达,被HBsAg单克隆抗体识别.结论:所构建的乙型肝炎病毒S基因单突变克隆能够在真核细胞表达蛋白,所表达的蛋白可以正确折叠,维持天然二级构象,具有良好的抗原性,为开发新的检测试剂盒,HBV疫苗及高效价的乙型肝炎免疫球蛋白奠定物质基础.
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大肠癌细胞线粒体DNA D-环区的突变
目的:研究大肠癌细胞线粒体DNA D-环区突变情况.方法:用PCR与直接测序相结合的方法,对比分析三株大肠癌细胞系和1例原代培养的正常肠上皮细胞的线粒体DNA D-环区的突变位点.结果:三株大肠癌细胞系和1例正常的肠上皮细胞的线粒体DNA D-环区均存在不同程度的点突变,其中72位C→T,73位A→G,16298位C→T,16519位T→C这四个突变位点在三株癌细胞和正常肠上皮细胞中均检测到,考虑为多态性变化.在SW480和LOVO细胞线粒体中检测到16224位T→C、16311位T→C两个相同的突变位点,在SW480和HT29细胞线粒体中检测到114位C→T、498位C→T、16234位C→T三个相同的突变位点.结论:大肠癌细胞线粒体DNA D-环区具有多态性和突变性,特征性的突变可能与大肠癌的易感性有关.
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幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的分子基础
目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)对克拉霉素耐药的分子基础.方法:采用E-test方法对35例Hp的临床分离株进行克拉霉素的MIC(minimal inhibitory concentration)检测,大于或等于8 mg/L为耐药株.按酚-氯仿方法提取Hp的DNA,PCR方法扩增23S rRNA基因中2 047-2 347之间的片段,对PCR产物进行序列分析,观察耐药株的基因突变情况.结果:与敏感菌(No33)序列比较,No13存在1个突变位点,即2 289位点T变成了C(T2289C),No17存在2个突变位点,即G2224A、T2289C,No22存在3个突变位点,即G2224A、C2245T及T2289C.三株耐药Hp菌株的MIC值分别是:No13为8.0 mg/L,No17为64 mg/L,No22为大于256mg/L.随着耐药性的提高(表现在MIC值的升高),高耐药性菌株的突变位点多于低耐药性菌株的突变位点.结论:与耐药有关的3个突变位点,G2224A、C2245T及T2289C,国内外未见报道,反映了Hp耐药的地区差异.
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Kir6.2基因两位点多态性与胰岛B细胞功能指数和胰岛素敏感性指数的相关研究
钾离子内向整流器(Kir6.2)和磺脲类受体(SUR)共同组成ATP敏感的钾通道复合体.在胰岛素分泌和作用过程中,ATP敏感钾通道均发挥着十分重要的作用[1,2].Kir6.2和SUR编码基因同位于11q15,1,Kir 6.2位于SUR下游4.5 Kb,仅有一个外显子,无内含子,全长1173 bp.在Caucasian人群中研究发现的错义突变位点有E10K、E23K、L270V和I337V,此外,还发现两个寂静突变[3].本研究即观察Kir6.2基因上E23K和I337V两位点的多态性是否对正常糖耐量人群空腹胰岛素水平,胰岛B细胞分泌功能以及胰岛素敏感性构成影响.
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经典型进行性骨化性纤维结构不良症临床表现及ACVR1基因突变检测
进行性骨化性纤维结构不良( fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP; OMIM135100),亦称进行性骨化性肌炎( myositis ossificans progres-siva, MOP),是一种罕见的常染色体显性遗传性、进行性结缔组织病,主要临床特征为先天性双侧拇趾畸形(主要为拇趾短而大且外翻)和全身软组织进行性异位骨化。该病多以散发为主,1982年Connor等[1]提出该病在英国的患病率为1∶1640000,目前全世界确诊FOP患者约800例[2],中国目前尚无关于该病患病率的报道。FOP 是由于 ACVR1/ALK2( activin receptor type IA/activin-like kinase 2, MIM102576)基因突变所致,其中甘氨酸-丝氨酸激活区域中 c.617 G >A (p.R206H)是该病的热点突变位点。
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β2肾上腺素受体遗传多态性与血清总IgE关系的研究
人类β2肾上腺素受体(β2AR)基因位于染色体5q31[1,2].目前已检测出该基因编码区存在着9个突变位点(遗传多态性)[3],其中4个可导致氨基酸序列改变,16位点的精氨酸(Arg)突变为甘氨酸(Gly),27位点的谷胺酰胺(Gln)突变为谷氨酸(Glu)的频率较高.国外学者已发现,Gln27型β2AR与血清总IgE增高相关[4 ].我们以聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO)对59例哮喘患者的β2AR 16和27位点遗传多态性进行检测,并测定其血清总IgE,以探讨我国汉族哮喘人群β2AR遗传多态性与血清总IgE关系.
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上海地区耐多药结核菌突变特点
快速诊断并阻断耐多药结核茵的传播对控制耐多药结核病疫情具有非常重要的意义.结核分枝杆菌生长缓慢,传统的基于固体培养的药物敏感试验非常耗时,新的基于耐药突变的分子诊断方法将是快速诊断的发展趋势.结核分枝杆菌耐药与基因组上特定基因的点突变有关.目前WHO审核通过了2个基于检测突变的快速诊断产品,但由于不同地区耐药突变特点不同,其在不同地区检测的敏感性和特异性有很大差异.我们观察了上海地区耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变特点,筛选出一套高敏感耐药突变位点用于耐药结核病的快速诊断.
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乙型肝炎病毒YMDD变异研究进展
核苷(酸)类似物拉米夫定作用于乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶活性部位YMDD基序(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),抑制HBV DNA复制,抗病毒效果显著.但临床上部分患者可表现为无应答或随着用药时间的延长,HBV会发生突变并导致对拉米夫定耐药,影响拉米夫定的疗效,常见的突变位点在YMDD基序的第204位上,即蛋氨酸被缬氨酸或异亮氨酸取代(rtM204V或rtM204I),分别称为 YVDD和YIDD突变.目前对YMDD变异的研究是一个热点,本文就近年来该方面的研究进展作一综述.
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临床常见持续高产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampD及其突变的研究
目的 检测临床常见AmpC β-内酰胺酶产酶菌株中染色质ampD及其高概率突变位点.方法 41株临床常见AmpC β-内酰胺酶产酶菌株(阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌)分离自医院感染患者样本,头孢西丁三维试验确定持续高产产酶类型,经抽提细菌染色质DNA,PCR法扩增ampD基因并连接入pMD19-T载体,双链测序后与同种非突变标准菌株的ampD序列比对,得到高概率突变位点.结果 41株细菌的基因组中,使用PCR法扩增出染色质ampD基因有36株,并成功测定了其ampD基因的序列;并且统计出突变率>50.00%的位点,其中阴沟肠杆菌有62个,肺炎克雷伯菌1个,鲍氏不动杆菌23个,铜绿假单胞菌4个.结论 ampD基因不伴随ampC基因同时存在;ampD基因的高概率突变位点可能成为致持续高产酶的关键位点.
关键词: AmpCβ-内酰胺酶 染色质ampD 突变位点 -
胎儿ABO血型的产前诊断
母儿血型不合中以ABO血型不合多见,常导致早期流产、胎儿贫血、水肿、甚至胎死宫内.为探讨产前诊断胎儿ABO血型的简便、准确、敏感性高、特异强的方法,我们根据B基因、A2基因、O1基因、O2基因与A1核苷酸序列突变位点的不同,设计出相应的特异性引物,用特异性序列-聚合酶链反应法,对2000年3月~2001年9月,在我院产科分娩的56例未破膜孕妇(新生儿、胎儿)及其丈夫[其中足月分娩28例(剖宫产23例,阴道分娩5例),引产28例(死胎9例,妊娠合心脏病2例,肺部恶性肿瘤1例,再生障碍性贫血2例,胎儿畸形8例,妊娠合并糖尿病酮症酸中毒1例,重度妊高征2例,羊膜带综合征1例,胎儿生长受限并巨细胞病毒感染2例)]进行羊水细胞A1、A2、B、O1、O2血型基因型检测.
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反向斑点杂交技术诊断β-地中海贫血误诊分析
β-地中海贫血(β-thalassemia)是一种以β珠蛋白肽链合成缺陷为特征的遗传性溶血性贫血,是世界常见遗传性单基因疾病之一,绝大多数均为β珠蛋白基因点突变和少数碱基缺失或插入引起.研究表明[1,2],反向斑点杂交技术是检测β-地中海贫血突变位点行之有效的方法.
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对"与《产前基因诊断白化病携带者一例》作者商榷"的答复
关于提到的<产前基因诊断白化病携带者一例>一文中的疏误之处,经核对,发现的确存在疏误:(1)tyrosinase,TYR应译为酪氨酸酶;(2)所检测到的突变位点为896位核苷酸,故对应的密码子为299位,核苷酸改变仍为精氨酸→组氨组;(3)TYR基因编码529个氨基酸.
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更正">关于"C型Niemann-Pick病的诊断及两个基因新突变位点的发现"一文基金资助项目及作者单位的更正
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遗传性乳光牙本质致病基因DSPP的突变分析
遗传性乳光牙本质又名牙本质发育不全Ⅱ型(dentinogenesis imperfecta type Ⅱ,DGI-Ⅱ或DGI1)(MIM 125490)是一种常染色体显性遗传病,表现为牙齿结构异常.我们拟就新发现的一个DGI-Ⅱ家系进行牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)致病基因的突变检测,以证实是否有新的突变位点,从而进一步阐明该病基因型和表型间的相互关系.
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HIV-1耐药性突变位点研究进展
HIV耐药性的产生是抗病毒治疗的瓶颈,而耐药性的发生主要是因为HIV基因组中部分密码子位点发生突变所致.随着HIV耐药性研究的逐步深入,导致HIV耐药的突变位点也逐渐明晰化,尤其是针对高效抗病毒治疗中经常使用的抑制剂的耐药突变位点的研究取得了明显进展.明确HIV耐药突变位点单独存在或与其他位点联合作用下对病毒抑制剂的影响,将使得抗病毒治疗更有针对性.
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家族性低钾周期性麻痹突变位点的特性分析
目前已知原发性低钾型周期性麻痹与遗传有关,约69.0%与电压门控钙通道α1亚单位基因CACNA1S(1q31~32)突变相关(Ⅰ型),约8.6%与电压门控钠通道α亚单位基因SCN4A(17q23.1~25.3)突变相关(Ⅱ型),22.4%未知.多数错义突变位于离子通道电压感受器上带正电荷的精氨酸,大部分被组氨酸替代.不同的突变位点其临床表型存在着差异.现对目前所发现的突变位点的特点进行总结,以利于对本病的认识.
关键词: 家族性低钾型周期性麻痹 突变位点 特点