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大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织中脑红蛋白基因表达的变化
2000年,德国Burmester等[1]首次报道了人和小鼠脑内存在特异的功能上类似于肌红蛋白的携氧球蛋白--脑红蛋白(neuroglobin),可特异性的为脑供氧,从而对脑缺氧的研究提供了全新思路[2],并已在国际范围内掀起重新认识和研究脑缺氧的热潮.我们实验室一直在关注脑缺氧损伤的分子机制研究,并获得了人脑红蛋白全长cDNA序列和大鼠脑红蛋白基因编码区的cDNA序列[3,4],随后根据此序列设计引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑组织中脑红蛋白 mRNA水平的变化进行动态研究,发现缺氧缺血性脑损伤时脑组织中该基因的表达显著升高,提示该基因可能在脑缺氧的适应性调节过程中起重要作用.
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HBV核心蛋白结合蛋白1编码基因C1的克隆化
目的:对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白l的基因C1进行克隆化研究.方法:对应用酵母双杂交技术筛选的白细胞中与HBV核心蛋白结合的新蛋白基因,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因的编码序列,根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为C1,在GenBank中注册,注册号为AY555145.结果:C1基因编码区为366个核苷酸(nt),编码产物由121个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,表明我们克隆的C1基因属于未知功能新基因.结论:成功克隆了HBV核心蛋白结合蛋白新基因C1.
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乙型肝炎病毒基因组高变区界定的初步研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在高保守区或高变区,并探讨前-前-S基因和前-X基因的存在方式.方法:自GenBank中按血清型搜索符合要求的HBV全基因组序列,并应用Vector 6.0版软件进行核苷酸序列同源性的分析和比较.结果:GenBank中搜索出28个adr血清型和22个adw血清型HBV病毒株全基因组,比较后发现2种血清型的核苷酸序列总一致率分别为76.6%和73.9%;adr血清型病毒株存有高度变异区和高度变异区,一致率分别为54.5%和92.1%;adw血清型基因组内部含有高度保守区,一致率为85.0%,不含有高度变异区.前-前-S区的存在是较为普遍的现象,而前-X区的编码具有adr血清型特异性特点,在某些病毒基因组中,因为存在A2608→C/T和C/A2733→T替换突变,导致其前-X基因编码区起始密码子突变,因此部分HBV基因组无前-X基因结构区.结论:HBV基因组内部可能存在高度保守区,前-前-S区的存在是一个重要的现象,而前-X编码区具有adr血清型特异性的特点.
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β2肾上腺素受体遗传多态性与血清总IgE关系的研究
人类β2肾上腺素受体(β2AR)基因位于染色体5q31[1,2].目前已检测出该基因编码区存在着9个突变位点(遗传多态性)[3],其中4个可导致氨基酸序列改变,16位点的精氨酸(Arg)突变为甘氨酸(Gly),27位点的谷胺酰胺(Gln)突变为谷氨酸(Glu)的频率较高.国外学者已发现,Gln27型β2AR与血清总IgE增高相关[4 ].我们以聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO)对59例哮喘患者的β2AR 16和27位点遗传多态性进行检测,并测定其血清总IgE,以探讨我国汉族哮喘人群β2AR遗传多态性与血清总IgE关系.
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老年人高血压与β2肾上腺素能受体基因A46G多态性的关系
交感神经系统在血压的调节中发挥着重要的作用,而交感神经的递质必须通过与血管心脏等组织上的肾上腺素能受体结合才能发挥作用.因此,对主要分布在血管平滑肌上的β2-肾上腺素能受体(Beta2-adrenergic receptor,β2-AR)基因多态性的研究,有助于从遗传的角度阐明高血压的病因.我们以武汉地区汉族健康老年人和高血压患者为研究对象,应用分子生物学技术,对β2-AR基因编码区的46位点进行了分析检测,旨在了解该基因多态性与武汉汉族老年人高血压的关联情况,从分子水平探讨遗传因素在高血压发病中的作用.
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PON1 Q192R基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系
人血清对氧磷酶(paraoxonase,PON1)相对分子质量约43 000,是一种含有三条糖链的Ca2+依赖性糖蛋白,它与载脂蛋白AI、载脂蛋白J紧密结合,共同参与高密度脂蛋白的构成[1,2].我们对PON1基因编码区Q192R单核苷酸多态性与动脉粥样硬化性脑梗死关系做一探讨,为预防和治疗动脉粥样硬化性脑梗死提供思路.
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阿尔茨海默病患者载脂蛋白E基因启动子区多态性研究
载脂蛋白E(ApoE)基因与阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)关系密切.在ApoE基因的启动子区存在着多个位点的多态性,由于这些位点距ApoE基因编码区非常近,因而其多态性可能与AD的发病有关.为此我们对启动子区-491A/T,-427T/C两位点多态性与AD的关系进行了研究.
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湖南汉族人群PPP2R2B基因三核苷酸重复突变
遗传性脊髓小脑型共济失调(SCA)是一组包括多种共济失调亚型的具有高度临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病,大多数SCA亚型的发病与致病基因编码区的CAG三核苷酸异常重复突变有关[1,2],而SCA12是一种惟一由致病基因PPP2R2B非编码区CAG三核苷酸重复导致的SCA亚型[3-4].
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酵母RAD24基因区域功能分析
啤酒酵母是人类基因组计划的重要模式生物,其全基因组序列测定通过国际合作已于1996年完成.我们继先前(1993年)克隆出RAD24基因区域DNA大片段后,对照全基因组测序结果进行比较,发现在我们曾预测的RAD24基因编码区存在一个移码突变.为此,我们对该区域进行了再测序,结果证实在我们报道的RAD24基因编码区少了一个碱基.应用plasmid premier基因分析软件对下载的该区域10 kb DNA大片段进行6相开放阅读框(ORF)分析,发现原RAD24基因区域的左侧尚存在一个ORF,命名为RAD24L,于是将原RAD24基因处的ORF改名为RAD24R,预测的编码蛋白质含2 130个氨基酸.应用一步基中断法和质粒交换技术,发现RAD24L缺失突变不影响细胞存活,但生长速度减慢,对紫外线和X线敏感;RAD24R基因缺失则细胞死亡,这与我们以前报道的原RAD24基因缺失的结果是一致的,说明所谓的RAD24基因缺失引起细胞死亡,实际上是由于RAD24R基因缺失所致.我们用功能互补法克隆了RAD24L的人类同源基因hR24L(Genbank No. AF126424),它参与细胞周期检定点调控,RAD24R的人类同源基因的克隆工作目前正在进行中.
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甲型流感病毒致病力相关因子PB1-F2研究进展
流感病毒是引起流行性感冒的病原体,不定期出现的流感大流行以及每年的季节性流感给人类社会带来严重危害.Chen等[1]在研究主要组织相容性复合物Ⅰ类分子递呈甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)抗原肽时,发现了一个全新的小分子蛋白,由87个氨基酸残基组成,分子量约为10.5kDa,称之为PB1-F2.PB1-F2的起始密码子开始于PB1基因编码区的第95位核苷酸,通过核糖体扫描机制,+1位移码形成第2阅读框架.PB1-F2属于非结构蛋白,对病毒复制并非必需,其在细胞内存在时间短,半衰期仅为30min,表达起始于感染后2h,5h后表达量大.近年来,诸多研究表明PB1-F2在流感病毒的致病力方面发挥重要作用,并在一定程度上具有毒株和宿主依赖性口[2].因此,深入认识PB1-F2有助于阐明流感病毒的致病机制,对流感的预防以及新型药物研发具有重要意义.
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β2肾上腺素受体遗传多态性与夜间哮喘的相关性研究
人类β2肾上腺素受体(β2AR)基因位于染色体5q31.目前已检测出该基因编码区存在着9个突变位点(遗传多态性),其中4 个可导致氨基酸序列的改变,从而使编码的第46、79、100、491位氨基酸分别发生Arg16→Gly、Gln27→Glu、Val34→Met、Thr164→Ile的改变[1].夜间哮喘是哮喘的一种特殊类型,其夜间症状及气道阻塞加重,对其发生机制尚不清楚.但已了解到夜间哮喘其夜间β2AR下调,而非夜间哮喘者患者和正常人无此下调[2].而在定位诱变和重组表达研究中已发现,β2AR16位点上的Arg突变为Gly具有增强激动剂所促发的受体下调作用[3].于是人们推测:Gly16与夜间哮喘的β2AR下调可能有关.为了探讨这一问题,本研究利用聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO),从分子水平对夜间哮喘和非夜间哮喘的β2AR16和27位的遗传多态性进行分析,并探讨这一多态性与夜间哮喘的关系.
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细胞因子遗传多态性与造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病相关性的研究进展
毋庸置疑,“细胞因子风暴”贯穿于急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发病全程.越来越多的研究证据支持细胞因子基因多态性是诱导异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)相关并发症,特别是影响GVHD发生的重要因素.细胞因子基因多态性主要表现为单核苷酸多态性(SNP)以及短串联重复序列(STR),并且主要发生在基因编码区和启动子区.SNP可以通过影响基因的转录与翻译,从而影响细胞因子的结构、表达与活性,导致个体细胞因子的分泌水平与功能的改变.我们仅就近年来关于细胞因子,诸如IL-1、IL-6、IL-7R、IL-10、IL-17、IL-23、TNFα、IFN-γ、TGFβ的基因多态性,对alloHSCT后GVHD、感染、总体生存(OS)率以及移植相关死亡率(TRM)等的影响研究进展进行综述.
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N-乙酰基转移酶2基因多态性与柳氮磺吡啶药物效应的相关性
N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase 2,NAT2)是柳氮磺吡啶(sulfasalazine,SASP)在人体内乙酰化代谢的关键酶.NAT2基因编码区的单核苷酸多态性可以造成氨基酸序列变化,进而影响酶含量[1]或活性[2],并对相关药物的代谢产生影响.近年来,NAT2编码基因的多态性与SASP药物效应的相关性备受关注,现将目前的研究进展综述如下.
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CCR5在慢性乙型肝炎中的研究进展
趋化因子受体5( CCR5)是一类趋化因子受体,它之所以现在受到世界医学界的日益关注,主要由于十几年前它作为HIV的辅助受体之一[1], CCR5基因编码区32 bp片段的缺失(即CCR5Δ32)导致其不表达在 T 细胞表面,从而能够阻止 HIV 感染[2]。研究发现CCR5作为一个免疫反应的调节因子受体主要通过调节炎症[3],调整免疫细胞的运动及其功能而发挥重要作用[4-8]。 CCR5及其配体能够吸引效应T细胞进入肝脏并且调节炎性细胞分泌的炎性细胞因子如IFN-γ和细胞表面分子FasL等,这就为研究T细胞介导的肝脏炎症性疾病,如自身免疫性肝炎( AIH)以及HCV、HBV等引起的病毒性肝病提供了可能的治疗靶点和方向[9,10]。本文主要针对CCR5在慢乙肝研究领域中的一些研究进展进行阐述。
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人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建
目的 克隆人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因编码区cDNA序列,构建并鉴定TGF-β1真核表达载体.方法 设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1cDNA引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以人白细胞mRNA为模版,扩增TGF-猹1基因,纯化PCR产物,TA克隆,双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,用双酶切后形成分子量1.2kb的条带,符合物理图谱,表明表达载体构建成功,序列测定结果与预测结果完全一致.结论 成功克隆了TGF-猹1基因,并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.
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湖北汉族人IL-18基因编码区105位点多态性及其血清含量相关性研究
白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是一种分布广泛的细胞因子,具有诱导γ-干扰素(IFNγ)等细胞因子的产生、增强自然杀伤(NK)细胞活性及促进T辅助(Th1)细胞的分化、增强Th1类反应等多种生物学活性,在介导炎症、调节机体的免疫功能方面具有重要作用.人IL-18基因位于11号染色体的长臂上(11q22.2~q22.3),由6个外显子和5个内含子组成.其中转录起始区位于第2外显子上,2个启动子分别位于第2外显子上游6.7kb的区域和5′端非编码区.目前发现IL-18基因启动子区和编码区存在突变位点,而且启动子-137和-607位点多态性与IL-18的转录和表达有关.我们的主要目的是调查健康汉族人IL-18基因编码区105A/C位点多态性的情况,同时测定血清IL-18含量,并进行健康汉族人IL-18基因编码区105A/C位点多态性与血清IL-18含量相关性分析.
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严重急性呼吸综合征患者肺组织中S基因病毒准种特性的初步研究
严重急性呼吸综合征(SARS)病原体是一种与冠状病毒(coronaviruses)类似的新的正链RNA病毒,基因组全长约为30kb,包括复制酶A、复制酶B、S、E、M基因编码区和14个目前尚未清楚功能的开放阅读框.SARS病毒的变异率估计为每天(8.26×10-6±2.16×10-6)/nt,与普通RNA病毒类似[1].SARS病毒感染呈很短暂的急性自限性过程,变异株在患者体内能否积累形成准种,所形成准种的异质性如何?有关研究目前报道还不多,为此我们采用构象敏感凝胶电泳(CSGE)及核酸序列分析的方法初步检测了1例患者肺组织中SARS病毒准种的复杂性及差异性,结果报道如下.
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乙型肝炎病毒X蛋白转录激活细胞DNA甲基转移酶基因启动子进而上调其表达
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma ,HCC )是常见的恶性肿瘤之一。大量资料显示,慢性HBV感染是其发生、发展的一个重要病原学因素,80%的 HCC与 HBV感染有关,而85%~90%的 HBV 相关性 HCC 存在 HBV 基因组整合[1]。HBV 基因组整合位点并不随机发生,多集中在 HBV DNA反式激活蛋白的基因编码区,即X蛋白编码基因,其编码蛋白能够反式激活同源/异源的病毒/细胞转录调节序列,与乙型肝炎的慢性化和正常肝细胞中癌基因激活和(或)抑癌基因失活密切相关。之前的研究均证实,HBx是一种非常强大的反式激活因子,胞核内的 HBx尽管不能直接与DNA结合,但可与多种转移因子蛋白相互作用,导致特定基因的转录活性升高[2‐3]。有研究报道,DNA甲基转移酶(DNM T )启动子序列中含有 A P1、S P1、S P3等转录因子结合位点,而有关 HBx广泛激活转录因子AP1、SP1、SP3的研究多有报道[4],且HBx参与表观遗传路径、诱导抑癌基因甲基化进而下调其表达、参与 HCC发生与发展的研究也日益增多,而抑癌基因甲基化过程由 DNM T 催化并维持。有研究表明, HCC患者血清及肝组织中 DNM T 表达升高[5‐6],但有关HBx与DNM T转录表达之间是否存在关联及其可能的机制依然不甚明确,需更深入的研究。本研究通过分析启动子活性,从另一方面来研究影响基因调控的因素,设计特异性引物扩增包含DNM T 1、DNM T 3A、DNM T 3B启动子区域的DNA片段,构建相应的启动子报告载体,试图从启动子水平阐述HBx对DNM T的影响。
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髓过氧化物酶-463G/A基因多态性与冠状动脉硬化狭窄程度关系的分析
目前,已经证实冠心病和动脉粥样硬化是多因素的炎症性疾病,炎性细胞因子在其发生发展中发挥重要作用.髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一种在中性粒细胞和单核细胞中含量较为丰富的血红素酶,是近年来备受关注的炎性因子,也是冠心病易感因素和突发心血管事件的独立预测因子[1-4].MPO的多个基因突变位点(463G/A、R569W、Y173C、M251T等)可能与疾病相关.其中MPO-463G/A位点是MPO基因编码区上游启动子区域,其突变影响MPO的转录活性,从而影响着疾病的易感性.笔者通过对我科冠心病患者MPO-463G/A基因型分析,探讨MPO基因多态性与冠脉病变的关系.
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人脑膜瘤PTEN基因编码区点突变的检测
我们通过PCR-SSCP方法,分析人脑膜瘤PTEN基因突变高发的第5和第8外显子,并用基因直接测序证实检测结果,研究中国人脑膜瘤是否存在PTEN基因的突变和缺失,以期为脑膜瘤发病机制的研究提供新的思路.