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2017年安徽省宿州市人感染H7N9禽流感病毒基因组特征分析
目的 分析2017年安徽省宿州市人感染H7N9禽流感病毒的基因组分子进化特征.方法 收集宿州市4例H7N9病例的咽拭子样本,分离培养后进行扩增和测序,构建血凝素HA基因进化树并进行重要氨基酸位点的变异分析.结果 4株毒株的HA与A/He nan/15337/2017(H7N9)的相似度高(99％);神经氨酸酶NA与A/Changsha/44/2017(H7N9)的相似度高(99％～100％);其他内部基因与2013-2017年浙江省、湖南省、江西省和广东省等地区分离到的H9N2相似度较高(94％～100％).分子进化树显示均为长三角分支.HA蛋白受体结合位点未发生G186V、Q226L突变;NA蛋白上未发现耐神经氨酸酶的位点突变;PB2蛋白发生E627V突变;M1蛋白出现N30D、T215A突变;NS1蛋白出现P42S突变、盘状同源区域模块缺失;M2蛋白出现S31N突变.结论 4株人感染H7N9禽流感病毒均处于长三角分支,M2蛋白S31N突变提示对M2离子通道抑制剂出现耐药,应及时关注其遗传变异演变方向,为H7N9禽流感的有效防治提供科学依据.
关键词： 禽流感 基因组 序列同源性 人感染H7N9禽流感病毒 氨基酸位点 -
2011-2014年河北省急性弛缓性麻痹病例中脊髓灰质炎病毒同源性分析
目的 检测2011-2014年河北省急性弛缓性麻痹(AFP)病例粪便标本中的脊髓灰质炎(脊灰)病毒,并对其VP1基因核苷酸序列进行同源性分析.方法 收集2011-2014年河北省AFP监测系统中登记的15岁以下出现AFP症状的1 504例病例的粪便标本,每份5 g,共3 001份(1 497例采集双份标本,7例采集单份标本).采用Real-time PCR对分离到的脊灰病毒进行核酸提取及RNA检测,采用逆转录PCR扩增脊灰病毒VP1基因片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定,以构建系统进化树,与Sabin疫苗株进行同源性比较.采用x2检验比较不同年份脊灰病毒阳性率的差异.结果 3 001份粪便标本共分离到脊灰病毒50株,阳性率为1.7％,其中Ⅰ型10株,Ⅱ型15株,Ⅲ型16株,混合型9株;2011-2014年脊灰病毒阳性率分别为1.0％ (9/890)、1.4％ (12/824)、2.2％ (17/770)和2.3％(12/517)(x2=2.24,P=o.525).VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析显示,脊灰病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型株核苷酸序列与Sabin疫苗株的同源性分别为98.8％ ～ 100％、99.1％～ 100％和99.2％～ 100％,氨基酸序列同源性分别为98.6％～100％、98.3％ ～ 100％和98.6％～ 100％.VP1基因进化分析显示,脊灰病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型株的变异率分别为0.66％、0.66％和0.55％.结论 2011-2014年河北省检测出的脊灰病毒除1份为Ⅱ型疫苗衍生脊灰病毒外,其余均为脊灰疫苗类似株,均与Sabin疫苗株具有较高的同源性.
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登革2型病毒深圳分离株的鉴定及E基因序列分析
分支上,核苷酸同源性高,达99.8%,氨基酸同源性为100%,与Indonesia-76、Somalia-84和Sri Lanka-90同属基因Ⅳ亚型.结论 首次从深圳市登革热患者血清中分离到1株登革2型病毒,证实该毒株可能来源于马来西亚.
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2007-2010年湖南省B型流行性感冒病毒基因特性分析
目的 了解湖南省2007-2010年B型流行性感冒(简称流感)病毒基因变异情况.方法 选取2007-2010年湖南省流感监测网络实验室分离到的42株B型流感病毒毒株,对其血凝素重链区(HA1)及神经氨酸酶(NA)基因进行RT-PCR,扩增产物纯化后进行序列测定,测序结果与2007-2010年WHO北半球流感疫苗株序列进行同源性比对,绘制基因进化树并进行分子特征分析.结果 HA1基因进化树中,在Victoria系分支中,2007 -2009年的毒株在V1分支中,与疫苗株Malaysia/2506/2004类似；2010年的毒株在V2分支中,与疫苗株Brisbane/60/2008类似；在Yamagata 系分支中,2007年的毒株在Y1分支中,与2008-2010年的毒株(Y2分支)在进化树上距离较远.NA基因进化树中所有病毒均在Yamagata系分支中,为Yamagata系来源.对2010年的7株病毒全基因序列分析显示,病毒为基因型2和15型.HA1分子与WHO推荐的流感疫苗株进行比较,Victoria系的同源性:2007年为98.6％ ～99.1％、2008年为98.6％ ～99.1％、2009年为98.1％ ～99.1％、2010年为97.6％ ～99.1％.Yamagata系:2007年为97.9％～98.5％、2009年为97.9％～98.5％、2010年为97.9％～98.2％.2007年毒株的主要突变位点为:R48K,K88R,P108A,D197N和S230G.而2009-2010年毒株的突变主要集中在:K88R,S150I,N166Y,D197N和S230G.结论 2007-2010年湖南省人群中流行的B型流感病毒持续发生着变异.
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浙江省分离到基因Ⅲ型乙型脑炎病毒
目的 分析1982-1983年浙江省媒介蚊虫中流行性乙型脑炎病毒(JEV)的分子特征与基因型别.方法 于1982-1983年从浙江省定海区和义乌市采集蚊虫样本3188只,用于病毒分离.应用C6/36细胞分离病毒,血凝抑制试验鉴定分离株.于2011年对JEV分离株活化,应用空斑形成单位( PFU)法测定病毒滴度;进行乳鼠脑内接种实验；对病毒PrM和E基因区扩增、测序,用生物信息软件将分离株与JEV疫苗株S 14-14-2和浙江2007-2010年JEV进行序列分析比较、并构建进化树.结果 从捕获的3188只蚊虫中,分离出1 1株可以引起C6/36细胞规律病变的病毒,病变时间为72 h,病毒滴度为2.5～6.47 lg PFU/ml,乳鼠脑内接种病毒后72 h死亡.病毒PrM区和E基因基因分型分析显示,浙江1982-1983年分离株属于JEV基因Ⅲ型,而浙江2007-2010年分离株则属于JEV基因Ⅰ型.对5株分离株E基因进行分析,病毒间核苷酸同源性在98.9％以上,氨基酸同源性在99.8％以上,5株病毒与疫苗株S 14-14-2之间核苷酸同源性在97.7％以上,氨基酸同源性为99.2％,共有10个共同的氨基酸差异位点,与2007-2010年浙江省JEV相比,核苷酸同源性为87.7％～ 87.9％,氨基酸同源性在98.8％以上.结论 1982-1983年从浙江省定海和义乌蚊虫中分离到的JEV属于基因Ⅲ型毒株.
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1998-2009年浙江省H3N2亚型流行性感冒病毒全序列变异的研究
目的 比较1998-2009年浙江省H3N2亚型流行性感冒(简称流感)流行株HA基因进化与全基因进化状况的一致性,并探讨全基因组序列上可能存在的潜在抗原区域.方法 选择浙江省CDC流感实验室于1998-2009年流感疫情中分离保存的H3N2亚型流感流行代表株19株,采用RT-PCR法进行全基因组序列扩增,并将这些毒株与10株同期H3N2亚型流感疫苗株进行全序列及HA1基因的系统进化比较;通过氨基酸替换比较、熵值计算及正向选择位点的筛选,确定各基因上的氨基酸易变位点.结果 H3N2亚型流感病毒的全序列长度为4466个氨基酸,其中有137个氨基酸位点发生稳定变异.在HA基因上第144和158位氨基酸分别经历了4次和3次替换,NA基因的第93、143、307、370、372位氨基酸和NP基因的第450位氨基酸经历了2次替换,且HA基因和NA基因上分别有29%(12/41)和77%(24/31)的变异位点位于已知抗原决定簇之外的区域.氨基酸位点熵值分析显示,HA基因非抗原决定簇的3、225、361位,NA基因非抗原决定簇的93、143、147、150、372位,PB1基因的113、576、586位,PA基因的101、256、382、421、437位,NP基因的377、450位,M1基因的218位及M2基因的31位氨基酸均为易变位点.结论 浙江省1998-2009年H3N2亚型流感病毒在HA和NA已知抗原决定簇之外的区域与部分内部基因上,可能存在着一些尚未被发现或者新形成的抗原位点.与HA基因的系统进化比较,全序列能更为全面地反映出流感流行株之间的亲缘关系与进化规律.
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霍乱弧菌双精氨酸转运系统基因共转录和同源性分析
目的 研究霍乱弧菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat)基因簇各个基因的共转录情况,并确定参与Tat转录基因簇构成.方法 选择霍乱弧菌埃尔托生物型菌株N16961和tatABC基因缺失株N169-dtat进行Tat基因簇及上下游基因,即上游蛋白质生物合成ubi aarF基因和下游细胞色素C551过氧化物酶编码基因cyt551基因进行逆转录,分析Tat基因簇的共转录情况.选择霍乱弧菌及其他弧菌属菌株,通过PCR产物测序和序列比对,对Tat转运系统的同源性进行比较,进行Tat基因簇各基因聚类分析.结果 Tat基因簇4个基因(tatA、tatB、tatC和tatE)均可以共转录.ubi aarF基因可以与tatA及tatB共转录.cyt551基因与上游的4个基因均不共转录;通过N16961 Tat基因缺失株总RNA逆转录分析发现,虽然ubi aarF与tatA、tatB的共转录由于基因缺失被阻断,但该基因仍可以被分别转录.不同型别的霍乱弧菌和其他弧菌属的菌株tatA、tatB、tatC、tatE单基因和tatABC基因簇聚类分析结果表明,Tat基因簇的种属变异性很小,是一段很保守的序列.结论 霍乱弧菌ubi aarF基因与Tat基因簇可能共同受调控因子的作用;Tat基因在弧菌属中属于保守结构.
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山东省脑膜炎和脑炎病例中埃可病毒6型的基因特征分析
为分析山东省脑膜炎和脑炎病例中埃可病毒6型(Echovirus 6,E6)的基因特征,本研究对山东省2007～2012年间采集的脑膜炎和脑炎病例脑脊液标本进行了病毒分离,阳性分离物采用血清学和分子生物学方法鉴定型别,与国内外其他E6进行同源性分析,并构建VP1完整编码区系统进化树.本研究共分离到6株E6病毒,同源性分析显示:这6株分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为78.6％～99.8％和95.5％～100.0％,与原型株(D'Amori)核苷酸和氨基酸同源性分别为为76.9％～78.4％和92.3％～95.1％.系统进化树分析显示:山东省E6分离株可分为A、B、C和D4个基因簇,这6株分离株属于A、B、D3个簇.山东省E6分离株之间存在较大的遗传差异,E6在山东的循环存在不同的传播链.
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白细胞介素-10检测及其临床意义
白细胞介素-10(简称白介素-10,interleukin-10,IL-10)是具有多种生物功能的细胞因子,它与机体自身免疫疾病、感染性疾病和肿瘤等有着密切关系.IL-10主要由单核细胞,巨噬细胞,肥大细胞,T、B淋巴细胞和激活的角质细胞产生.人的IL-10是一种单肽链的,由160个氨基酸组成的酸性蛋白,分子量为18.7kD(不包括N端18个氨基酸构成的信号肽序列),等电点为8.1,通常为二聚体(39kD).人IL-10和鼠IL-10核苷酸序列同源性达81%,氨基酸序列同源性达73%.人IL-10对人细胞和小鼠细胞均有作用,小鼠IL-10只对鼠细胞有作用,而对人细胞无作用.
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埃及1982～1993年脊髓灰质炎疫苗Ⅱ型衍生病毒的流行情况
1988～1993年在埃及的27个行政区中的8个行政区发现了32例与口服脊髓灰质炎(脊灰)疫苗(OPV)Ⅱ型衍生病毒有关的病例。虽然初的分离检测表明，它们和疫苗株有不同的成分和不同的核苷酸序列，但核苷酸分析表明：1999年所有的病毒分离结果(核苷酸序列同源性为93%～96%)与OPV的Sabin疫苗株Ⅱ型有关。这一分离结果与埃及发现的脊灰Ⅱ型野病毒不同(核苷酸序列同源性<81%)，埃及后分离到脊灰Ⅱ型野病毒的时间是1979年；与其它地区发现的脊灰Ⅱ型野病毒也不同；这一分离结果与其它患急性弛缓性麻痹的病例分离到的脊灰Ⅱ型病毒(其与SabinⅡ型核苷酸序列同源性>99.5%)也不同。
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MDA-7/IL-24蛋白的功能研究进展
mda-7/IL-24基因初被命名为黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7),是1995年Jiang等[1]利用减数杂交技术从β干扰素和蛋白激酶C活化剂mezerin诱导的人黑色素瘤细胞HO-1中鉴定并克隆出来的.基于结构、序列同源性、基因定位等方面的考虑,MDA-7蛋白被归为IL-10家族,并被命名为MDA-7/IL-24蛋白.mda-7/IL-24基因在进化过程中比较保守,在酵母、猴子、牛、狗和猫的基因组DNA中都发现了mda-7/IL-24基因的同源基因[2].人mda-7/IL-24基因是单拷贝基因,定位于1号染色体(1q32.2-q41),由7个外显子和6个内含子组成,其mRNA长约2 kb,编码由206个氨基酸组成、相对分子质量约为23 800的蛋白质.
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重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165快速构建及在骨髓移植小鼠体内的分布和表达效率
目的研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率.方法利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad-EGFP/hVEGF165;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性;经尾静脉注射3×108PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB/c小鼠,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠体内分布和hVEGF165的表达.结果通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-EGFP/hVEGF165;纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一,滴度可达1010～1011PFU/ml.Hela细胞感染病毒后经多次传代未见细胞病变.借助于荧光显微镜在不同时期观测到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠组织EGFP;RT-PCR分析和免疫组化染色显示脏器内有显著VEGF表达.各脏器未见明显毒性反应.ELISA法检测小鼠血浆中VEGF水平升高可达(866.67±97.13)pg/ml.结论本研究结果证实细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,并成功介导了hVEGF165基因在骨髓移植小鼠体内的安全、稳定表达,为今后在骨髓移植过程中开展基因治疗奠定了基础.
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山东省环境污水和脑炎病例中埃可病毒6型的监测和关联
目的 探索山东省2014年急性脑膜炎/脑炎症候群(acute meningitis/encephalitis syn-drome,AMES)病例和2013—2014年环境污水监测中埃可病毒(echovirus,E)6型的基因特征及其关联.方法 对2014年的AMES病例标本和2013—2014年的环境监测标本进行肠道病毒(enterovir-us,EV)分离,阳性分离物采用分子生物学方法鉴定型别,并对E-6 VP1区序列进行同源性和系统进化学分析.结果 2013年AMES病例中未检出E-6,2014年分离到47株E-6,占EV分离株的29.56%.环境污水监测结果显示E-6从2013年夏季开始频繁出现并一直持续到2014年底,2013年分离到40株E-6,占总EV分离株的7.87%;2014年分离到139株E-6,占总分离株的26.18%.系统进化树分析表明本研究分离株属于A、C两个基因簇,各簇之内的环境和AMES分离株之间有密切的亲缘关系.在A基因簇中,2014年AMES分离株之间的核苷酸同源性是98.3%~100%,2013—2014年环境分离株之间的同源性是96.6%~100%,二者之间为97.1%~100%,C基因簇的以上核苷酸同源性分析结果分别是100%、98.7%~100%和99.1%~100%.结论 2014年山东省发生了两条E-6传播链导致的病毒性脑炎的流行;在E-6相关的病毒性脑炎流行之前,通过环境监测敏感地监测到E-6在本地的潜在流行,证明环境监测具有对相关疾病的早期预警能力.
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广东人类禽流感H5N1亚型血凝素和神经氨酸酶基因同源性分析
目的 采用生物信息学技术,寻找广东地区人类禽流感H5N1亚型基因同源毒株.方法 检测广东人禽流感H5N1亚型HA和NA基因核苷酸序列,从GenBank下载国内各种动物和人类相应基因序列,采用Mega 5.03和Lasergene 7.1软件进行核苷酸同源性和氨基酸变异分析.结果 在总共174个HA基因和173个NA基因序列中,发现广东毒株A/Guangdong/01/2006的HA和NA基因与湖南鸡和安徽鸭流感毒株同源性较高;广东毒株A/Guangdong/02/2006的HA和NA基因与香港鸟禽类流感毒株同源性较高.同源性较高的毒株基因之间,氨基酸位点存在差异,但尚未显示流行病学和临床意义.结论 广东A/Guangdong/01/2006毒株与湖南鸡和安徽鸭流感毒株具有共同的近祖先,广东A/Guangdong/02/2006毒株与香港鸟禽类流感毒株具有共同的近祖先.
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MALDI-TOF MS用于碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌同源性分析的初步研究
目的 评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKPN)同源性分析的能力.方法 收集山东大学附属省立医院儿科病房及心外科病房2011年4月至2013年10月分离的21株CRKPN菌株,分别采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)及MALDI-TOF MS技术进行回顾性同源性分析.结果 MALDI-TOF MS将21株CRKPN菌株根据亲缘关系远近分为三群,其中17例菌株为II群,同源性高于75%,从获得的17株菌的蛋白质谱图结果分析,其蛋白峰大致一致,由此推断其亲缘关系比较接近,与PFGE和MLST结果基本一致.而同源性较低(<60%)的H13与上述菌株存在差异,尤其在分子量4365、5381及6289处蛋白峰有显著差异,PFGE分析显示H13与其他菌株的同源性为61.0%,MLST分型为ST54.结论 MALDI-TOF MS技术能够准确对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌进行同源性分析,较之其他同源性分析方法,快速方便,可满足医院感染工作的需求,及时防止耐药菌株在医院感染的爆发与流行.
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洛菲不动杆菌TEM型β内酰胺酶基因研究
目的分析临床不动杆菌TEM耐药基因结构特征,比较不动杆菌与大肠埃希菌TEM基因的差异.方法自呼吸道感染的标本中分离80株洛菲不动杆菌,经药敏试验、TEM、SHV、OXA、IMP、CTX-M耐药基因的聚合酶链反应检测,筛选出2株具有多重耐药特性TEM型分离株JN18、JN70,对耐药基因进行序列测定,用DNA分析软件与大肠埃希菌TEM基因进行比较.结果 JN18和JN70洛菲不动杆菌TEM基因扩增序列分别长1 012 bp和887 bp,编码分别为832 bp和772 bp的TEM基因片段,2株菌TEM基因的同源性为98.2%,其中14个基因位点存在碱基差异.JN18与E.coli TEM同源性平均为98.72%,其中与E.coli TEM1E,17B,28,70,76,77,79,95型同源性超过99%;JN70与E.coli TEM基因同源性平均为98.93%,与E.coli TEM1D、1F、84型同源性高达99.5%.JN18和JN70与E.coli TEM基因平均离散率为1.26%和1.06%.基因种系分析结果显示,洛菲不动杆菌JN18和JN70株TEM与E.coli TEM17B、TEM76型基因关系相对密切.结论洛菲不动杆菌JN18和JN70 TEM基因与大肠埃希菌TEM76,84极为类似,但在不同位点上存在核苷酸差异.
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耐万古霉素肠球菌的基因检测
目的 调查上海华山医院2007-2009年间VRE的分离率,并对耐药菌株的分子特性进行研究,为本地区VRE的预防和控制提供有价值的信息.方法 通过琼脂平板稀释法(ADSP)从临床鉴定的890株肠球菌中筛选VRE菌株,并通过微量肉汤稀释实验测其对万古霉素及替考拉宁的MIC;采用PCR及测序方法检测万古霉素耐药基因以及可能毒力基因esp,hyl;运用MLST对VRE进行克隆分型并通过PFGE分型技术进行验证.结果 ADSP法及微量肉汤稀释实验共筛选出13株VRE菌株.其中6株VRE(2007-2008年)只对万古霉素耐药,但对于替考拉宁敏感(万古霉素MIC64～256μg/ml);耐药基因PCR产物测序结果提示这6株VRE均携带同一种可能导致万古霉素耐药的新型基因,该基因序列与已报道的耐药基因均不同;MLST及PFGE分型提示其属于不同型别.另外7株VRE(2009年1-7月)对万古霉素和替考拉宁的MIC结果分别为32～64μg/ml和16～32 μg/ml,耐药基因检测均为vanA.MLST分型结果提示13株VRE共分为4个不同的ST型,其中11株均属克隆复合型CC-17.13株VRE毒力基因esp和hyl的阳性率分别为69.2%和30.8%.结论 上海华山医院VRE克隆分型以CC17为主,同时发现上海华山医院存在一种可能导致万古霉素耐药的新型基因介导的VRE,该新基因的功能和定位尚待进一步研究.
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重症监护病房产VIM-2型金属酶绿脓假单胞菌的研究
目的分析重症监护病房产金属β内酰胺酶绿脓假单胞菌的同源性、金属酶基因型及转移机制.方法用2-巯基丙酸协同试验筛选重症监护病房分离的对亚胺培南耐药的绿脓假单胞菌中的产金属酶株,聚合酶链反应(PCR)、克隆测序确定耐药基因,整合子PCR扩增,脉冲场凝胶电脉分析同源性.结果 26株绿脓假单胞菌2-巯基丙酸协同试验阳性,酶粗提液能水解亚胺培南,活性能被EDTA抑制.VIM型金属酶引物PCR扩增阳性,经克隆测序证实为VIM-2型金属酶.整合子可变区序列分析表明,blaVIM-2位于Ⅰ类整合子上,该基因上游含有1个aacA4基因,下游为aadB基因.脉冲场凝胶电脉结果证实产酶株均来自同一克隆.结论医院重症监护病房有产VIM-2型金属酶绿脓假单胞菌的流行,耐药基因位于Ⅰ类整合子上.
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Sau-PCR法分析由洋葱伯克霍尔德菌引起的院内感染
目的 通过使用Sau-PCR方法分析一起由洋葱伯克霍尔德菌引起的院内感染,为追溯感染源和感染途径提供有效的信息.方法 Sau-PCR首先使用限制性内切酶Sau3AI对基因组DNA进行酶切,获得以GATC序列为黏性末端的酶切产物,然后使用能够识别酶切位点(GATC)的引物对酶切产物进行PCR扩增,后根据DNA琼脂糖凝胶电泳图谱分析样本之间同源性.结果 11株来自患者的菌株中,除1株以外,其余均表现出100%同源性,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对样本进行验证,结果与Sau-PCR完全一致.结论 Sau-PCR是一种实用、简便、迅速的DNA指纹图谱分析工具,在对同源性的研究当中具有广阔应用前景.
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SYBR green Ⅰ实时荧光PCR结合熔解曲线检测HBV B和C基因型的研究
国内外研究表明HBV基因型与病毒的感染途径、基因突变、疾病进程、抗病毒药物疗效有一定的关系[1-3]引,了解HBV基因型分布,追溯感染源对判断预后、监测抗病毒用药疗效、选择个体化治疗方案等具有重要应用价值.目前根据全基因序列同源性>92%或S区基因序列同源性≥96%,HBV分为A～H 8个基因型,在亚洲主要是A～F[4],国内主要基因型为B和C型.
