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丙型肝炎病毒母婴传播及羊水、乳汁和唾液的作用
目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)母婴传播及羊水、乳汁和唾液在母婴传播中的作用.方法:用酶免疫测定(EIA)检测IgG抗-HCV;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV-RNA;Taq DNA聚合酶循环测序法对PCR产物测序.结果:抗-HCV和HCV-RNA均阳性孕妇的24例婴儿中有4例血清检出HCV-RNA,阳性率为16.7%;一对HCV-RNA均阳性母、婴的HCV-cDNA序列同源性为100%;母亲羊水、乳汁和唾液HCV-RNA阳性率分别为25%、16.7%和0%;3例羊水HCV-RNA阳性母亲的婴儿有2例HCV-RNA阳性(66.7%).结论:母婴传播是婴幼儿感染HCV的重要途径,传播率为16.7%.羊水在HCV母婴传播中起重要作用.
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大鼠肝再生相关基因LRRP1的人同源基因是一种新型琥珀酸脱氢酶的亚单位编码基因
目的:应用分子生物学和生物信息学方法,寻找、克隆大鼠肝再生相关基因LRRPl的人的同源基因,阐明LRRPl基因的结构和功能,为研究肝脏再生调节的分子生物学机制奠定基础.方法:利用美国国立卫生研究院建立的核苷酸数据库(GenBank)以及相应的核苷酸序列同源性搜索分析软件(BLASTN),以大鼠的LRRPl的cDNA序列作为参照,对于人的同源性cDNA序列进行搜索分析,寻找人的LRRPl的同源基因序列.利用蛋白质一级结构序列的数据库以及相应的同源蛋白序列的搜索分析,阐明人LRRPl蛋白质一级结构与已知蛋白序列的同源性,从而根据蛋白质一级结构的相似性,对于新克隆基因进行功能方面的预测分析.应用在线软件的分析,对于人LRRPl蛋白质一级结构序列进行分析预测,分析其氨基末端序列是否具有信号肽序列,以判断人LRRPl蛋白是否是一种可以分泌表达的蛋白;同样对人LRRPl蛋白质一级结构序列进行在线软件的分析,对于人LRRPl蛋白质分子结构中的潜在的糖基化位点以及其他类型的修饰位点进行预测.结果:人的LRRPl的编码基因由480nt组成,编码产物由159aa组成.人LRRPl的蛋白质一级结构序列与人琥珀酸脱氢酶亚单位D、牛琥珀酸脱氢酶亚单位D高度同源,同源性分别为79%(126/159),78%(123/156).人LRRPl是一种分泌蛋白,在其分子结构中具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和豆蔻脂化修饰位点.结论:人LRRPl蛋白是一种新型的琥珀酸脱氢酶的亚单位编码基因.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP7的克隆
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的cDNA,克隆HBxAg反式激活相关靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次杂交消减及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了pcDNA3.1(-)的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为XTP7,在GenBank中注册,注册号为AF490256.XTP7基因的编码序列全长为588个核苷酸(nt),编码产物由196个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用SSH成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP7,为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP8的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的cDNA,克隆HBxAg反式激活相关靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了pcDNA3.1(-)的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为XTP8,在GenBank中注册,注册号为AF49257.XTP8基因的编码序列全长为1590个核苷酸(nt),编码产物由530个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP8,为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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乙型肝炎病毒基因组高变区界定的初步研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在高保守区或高变区,并探讨前-前-S基因和前-X基因的存在方式.方法:自GenBank中按血清型搜索符合要求的HBV全基因组序列,并应用Vector 6.0版软件进行核苷酸序列同源性的分析和比较.结果:GenBank中搜索出28个adr血清型和22个adw血清型HBV病毒株全基因组,比较后发现2种血清型的核苷酸序列总一致率分别为76.6%和73.9%;adr血清型病毒株存有高度变异区和高度变异区,一致率分别为54.5%和92.1%;adw血清型基因组内部含有高度保守区,一致率为85.0%,不含有高度变异区.前-前-S区的存在是较为普遍的现象,而前-X区的编码具有adr血清型特异性特点,在某些病毒基因组中,因为存在A2608→C/T和C/A2733→T替换突变,导致其前-X基因编码区起始密码子突变,因此部分HBV基因组无前-X基因结构区.结论:HBV基因组内部可能存在高度保守区,前-前-S区的存在是一个重要的现象,而前-X编码区具有adr血清型特异性的特点.
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瘦素与肝病
1994年Friedman等[1]应用定向克隆法(positional cloning)从肥胖与糖耐量异常的动物ob/ob小鼠中首次成功克隆出肥胖基因(ob gene)及人类的同源序列,人和小鼠之间的ob基因的编码序列同源性高达84%,基因的高同源性提示ob基因及其表达产物功能的高度保守性.ob基因结构和序列的改变可以导致肥胖.Halaas等[2]于1995年应用DNA重组技术,由大肠杆菌中合成出人和小鼠ob基因的表达产物,该产物是一种分泌蛋白,其前体由167个氨基酸残基组成,N末端有21个氨基酸残基信号肽,该前体的信号肽在循环血液中被切掉而成为146个氨基酸,分子量为16 000,由于其基本作用是使动物的体重降低而变瘦,故Halaas等将该蛋白命名为瘦素(leptin).现已发现,瘦素主要由白色脂肪细胞及胎盘、胃等部位表达[3,4],具有中枢性抑制摄食、免疫调节和抑制血管新生作用[5-7].
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埃博拉病毒包膜糖蛋白进化特征分析
目的 研究埃博拉病毒包膜糖蛋白的进化和变异特征.方法 从美国生物信息中心(NCBI)数据库选取1976至2014年埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列100条,通过多序列比对和蛋白进化树分析埃博拉病毒包膜糖蛋白的进化和变异特征.结果 1976至2014年,不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列间的同源性为54.00％ ～ 65.00％,同亚型包膜糖蛋白氨基酸序列同源性为95.00％ ～ 100.00％.2014年在不同地域分离到的同亚型埃博拉病毒的包膜糖蛋白氨基酸序列并不完全一致,但是变异很小,同源性达到了99.70％ ～ 100.00％.2014年来自塞拉利昂的扎伊尔-埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸同源性达到了100.00％,但是米自几内亚的三条扎伊尔-埃博拉病毒糖蛋白氨基酸序列有一定变异.不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白分别在进化树的不同分支上:2014年分离自塞拉利昂的扎伊尔-埃博拉病毒包膜糖蛋白在一大分支上;1976至2014年分离自塞拉利昂以外国家的扎伊尔-埃博拉病毒糖蛋白在另一个大分支上.结论 埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸变异具有时间性和地域性.2014年流行于不同地域的扎伊尔-埃博拉病毒可能是同一来源的两个不同变种,没有迹象表明不同亚型埃博拉病毒之间具有“混合杂交现象”发生.
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同一患者不同部位碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制和同源性分析
肺炎克雷伯菌是医院和社区获得性感染的重要肠杆菌科细菌。随着抗菌药物的广泛使用，产超广谱β-内酰胺酶和AmpC 酶等多重耐药肺炎克雷伯菌引起的感染日益增加，而碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药菌感染的有效药物之一。随着此类抗菌药物的大量和不合理使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsilla pneumoniae，CRKP）逐渐出现，近年来呈不断增加的趋势，其耐药机制主要是细菌产生的碳青霉烯酶能水解碳青霉烯类抗菌药物［1］。肺炎克雷伯菌主要产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsilla pneumoniae carbapenemase，KPC）［2］，KPC 酶是一种质粒介导的Ambler 分类中A 类丝氨酸β-内酰胺酶，能水解几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物［3］。本研究针对浙江衢化医院重症监护病房（ICU）1例患者5个部位分离得到的非重复CRKP的耐药机制和同源性进行分析。
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鲍曼不动杆菌美罗培南体外诱导后对常用抗菌药物敏感性降低及其机制研究
目的：研究美罗培南体外诱导后的鲍曼不动杆菌对药物的敏感性及相关机制。方法将临床分离的3株对碳青霉烯类敏感的鲍曼不动杆菌用美罗培南体外诱导后获得突变株（MS1、MS2和 MS3），对诱导前后的菌株，采用全自动药敏分析仪测定抗菌药物低抑菌浓度（MIC）的变化，采用肠杆菌科细菌间重复共有序列聚合酶链反应（ERIC－PCR）分析其同源性，改良 Hodge 试验和 EDTA－Na2双纸片协同法分别检测碳青霉烯酶和金属β－内酰胺酶，PCR 法检测碳青霉烯酶基因，对产物进行测序分析，荧光定量 PCR 检测外排泵基因 adeB 的表达差异，并用 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外膜蛋白表达变化。采用 t 检验分析数据。结果美罗培南对鲍曼不动杆菌突变株的 MIC 上升，除亚胺培南、阿米卡星和多黏菌素对突变株的 MIC 无变化外，其他大部分抗菌药物对突变株的 MIC 也上升，且 MS2和 MS3对美罗培南的敏感性下降可稳定传代。同源性分析显示，亲本株和突变株100％同源。亲本株和突变株碳青霉烯酶和金属酶均阴性，只检测到 OXA－51耐药基因。突变株 adeB 基因表达量为24．26±0．91，亲本株为22．81±0．38，二者差异无统计学意义（t ＝2．534， P ＞0．05）。 MS1缺失相对分子质量为54000外膜蛋白，MS2和 MS3缺失相对分子质量为47000外膜蛋白。结论美罗培南体外诱导后，鲍曼不动杆菌对美罗培南和常用抗菌药物的敏感性下降，可能与相对分子质量为47000外膜蛋白缺失有关。
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应用细菌重组系统构建小鼠Flt3配体的重组腺病毒及其在肝癌细胞中的表达
目的构建携带小鼠Flt3配体（murine flt3 ligand,mFL）的重组腺病毒载体并检测它在感染后的小鼠肝癌细胞中的表达,为肝癌基因治疗提供实验基础。方法 PCR扩增含有mFL的质粒，应用高效细菌内同源重组系统构建携带mFL的重组腺病毒，感染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6，一步法提取细胞总RNA，RT-PCR检测mFL的表达。结果构建了携带mFL的重组腺病毒，并在感染后的Hepa1-6细胞中检测到了mFL的mRNA。结论应用该细菌重组系统成功地构建了携带mFL的重组腺病毒载体，为下一步的基因治疗研究奠定了基础。
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产VIM-2型金属酶铜绿假单胞菌的研究
目的分析烧伤科病房产金属酶铜绿假单胞菌的同源性、金属酶基因型及耐药谱特点. 方法用E-test法进行药物敏感性试验;采用2-巯基乙醇纸片协同试验筛选产金属酶菌株,对金属酶基因和整合酶基因进行聚合酶链反应(PCR)和序列分析;碱裂解法提取质粒,质粒结合、电转化试验和质粒消除试验验证酶基因有无可转移性;应用随机扩增DNA多态性分析技术(RAPD)分析产金属酶菌株的同源性. 结果 48株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌2-巯基乙醇纸片协同试验阳性6株,6株菌金属酶引物VIM-2扩增阳性,经测序证实为VIM-2型金属酶,定位于质粒上;RAPD分析显示所有产酶株均来自同一克隆,都携带Ⅰ类整合酶基因. 结论烧伤科病房有产VIM-2型金属酶铜绿假单胞菌流行.
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缺氧胎盘组织中ROCK蛋白的表达及意义
子痫前期（pre-eclampsia, PE）是严重威胁孕产妇和胎儿健康的产科疾病，其发病机制至今未明。研究表明，PE孕妇胎盘组织中Rho相关蛋白激酶（rho associated protein kinase，ROCK）表达水平显著上调[1]，提示ROCK蛋白可能参与子痫前期的发病过程，ROCK蛋白属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是Rho蛋白的下游靶效应分子。ROCK蛋白具有两种亚型，即ROCKⅠ和ROCKⅡ，两种亚型的序列同源性达到64％，在激酶活性区域达到89％，两种亚型在正常及PE孕妇的胎盘组织中均有表达[2]。ROCK蛋白主要调节细胞形状以及运动、分泌、增殖、分化、凋亡等细胞功能[3]。近年来研究认为，PE发病与胎盘缺氧有关，缺氧是PE发病的关键因素，但是低氧状态下ROCK蛋白的变化及其作用目前尚不清楚。本研究通过观察低氧状态下正常孕妇胎盘组织ROCK蛋白表达的变化，进一步明确低氧对胎盘组织中ROCK蛋白表达的影响。
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脑源性神经营养因子的临床应用前景
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是哺乳类动物脑内分布广、含量高的神经营养因子,人BDNF基因位于11q13.BDNF又是一种碱性蛋白质,由119个氨基酸残基组成.在不同物种间其氨基酸序列具有高度保守性,与神经营养因子(neurotrophic factor,NTF)家族其它成员序列同源性达50%～60%[1].BDNF分布主要集中在中枢神经系统,尤以大脑皮质及海马含量高,在周围系统,如心、肺、骨骼肌也有低水平表达.
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CNE、SPC-A1 和 MCF-7 人类肿瘤细胞 Ku80 基因同源性研究
目的:研究人鼻咽鳞癌(CNE)、肺腺癌(SPC-A1)和乳腺腺癌(MCF-7)细胞 Ku80 基因功能区的保守性,探讨该基因突变与肿瘤放射和化学治疗疗效的关系.方法:采用聚合酶链式反应和克隆技术测定 3 种肿瘤细胞内与 DNA 损伤修复有关的 Ku80 基因序列,分析他们的功能区保守性变化,模拟和比较突变产物亲疏水性差异.结果:人 CNE、SPC-A1 和 MCF-7 肿瘤细胞 Ku80 基因同源性分别为99.95%、99.5%和99.7%,包括碱基转换和颠换突变.部分突变碱基导致产物氨基酸替代并影响他们的亲疏水结构.SPC-A1 细胞发生150aa Ile→Val、 470aa Asp→Gly、553aa Phe→Ile 替代和 570aa Gln→0 缺失;MCF-7 细胞发生 209aa Lys→Glu、231aa Leu→Arg 和 297aa →Ser 替代;而 CNE 细胞功能区高度保守.结论:SPC-A1 和 MCF-7 细胞 Ku80p 功能区存在氨基酸替代,影响其结构和活性变化,与肿瘤细胞 DNA 双链断裂损伤修复能力和肿瘤放化疗疗效直接相关.
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SPARC--与角膜创伤修复有关的钙调蛋白
在鼠和人体内SPARS氨基酸序列高度保守,序列同源性为92%.SPARC在眼的许多组织有较高水平表达.内皮损伤、屈光性角膜手术后,角膜上皮和内皮细胞质可见SPARC的出现.SPARC能通过细胞外基质调节细胞与基质间的相互作用,诱导细胞呈圆形;促进培养的内皮细胞和成纤维细胞重排,在损伤部位由成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞表达,这些细胞从事于基底膜的合成和重建;以Ca2+依赖方式特异性结合Ⅲ、Ⅳ型胶原,参与细胞外基质装配、更新或重建的钙依赖性的过程;指导细胞迁移或增殖,介导角膜上皮和角膜基质间相互作用过程,作为一种修复因子参与角膜创伤修复过程,包括角膜移植免疫过程、角膜物理化学损伤等过程.
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经放射线照射后口腔链球菌的分子生物学鉴定
通过生理、生化试验可对口腔及咽喉部的97.9%的口腔链球菌分离株做出鉴定.但是对一些生长缓慢的细菌,或表型特征介于两个种之间的菌株,只靠生化试验不能明确鉴定到种.而分子生物学鉴定方法如16S rDNA序列同源性分析可将细菌准确、快速地鉴定到种.我们采用16S rDNA序列同源性分析的方法对放疗后生化试验表型发生变化的菌株进行了鉴定.
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人程序化死亡分子5(PDCD5)核酸和蛋白质序列的数据发掘
目的:以程序化死亡分子5(PDCD5)为靶分子,对其核酸与蛋白质序列进行生物信息学分析,为PDCD5功能的实验研究提供基础,同时也为人类功能基因的生物信息学分析提供新的技术路线.方法:利用数据库相似性搜索、同源物结构比较、表达谱分析和查询基因"邻居"等技术进行数据发掘和数据综合分析.结果:发现人PDCD5在12号和5号染色体上分别存在返座假基因(retropseudogene),小鼠1号染色体也存在小鼠PDCD5 cDNA的返座假基因.热自养甲烷杆菌的PDCD5同源物、泛素及核糖体蛋白S13具有与人PDCD5相似的折叠方式.线虫的PDCD5同源物、泛素及IAP(inhibitor of apoptosis proteins)分子等在表达谱拓扑图上属于同一基因簇成员,该基因簇与生物合成和蛋白质合成相关.PDCD5同源物在多个基因组中与多种核糖体蛋白相邻.结论:PDCD5存在2个拷贝的假基因.PDCD5除参与细胞凋亡外,预测还与泛素有功能相关性,并可能参与蛋白质的翻译调控.
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小鼠凋亡相关新基因TFAR19 cDNA的克隆化和序列分析
目的:了解一个细胞凋亡相关新基因TFAR19在不同种属间的序列同源性.方法:利用表达序列标签(expressed sequence tag, EST)拼接技术、RT-PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术.结果:首次成功进行了小鼠TFAR19 cDNA 编码区的cDNA 克隆化和序列分析,发现小鼠和人TFAR19 在核苷酸水平上有81.4%的同源性,在氨基酸水平上有高达96%的同源性.功能区分析发现,小鼠TFAR19 cDNA序列含编码126个氨基酸的开放性读码框架,含1个可能的cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点,4个可能的PKC 磷酸化位点.其C端的"EDDADY"序列与人DNA拓扑异构酶I141-147位残基序列完全相同.结论:小鼠TFAR19是与人TFAR19高度同源的新基因, 与DNA拓扑异构酶I可能有功能相关性.
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生物信息学及其在生物医学中的应用
生物信息学(bioinformatics)是近年来发展起来的一门将分子生物学和计算机信息处理技术结合起来的交叉学科,它的基本出发点是利用数据库和软件技术对大量涌现的生物大分子序列数据和实验新测定的序列进行结构比较和统计学分析,推导出序列同源性,从而揭示生物大分子的分子结构、功能、进化等关系,是分子生物学研究的一个新领域.近年来,随着Internet网络的发展和普及,越来越多的生物信息学数据库和分析软件与Internet联结,为我们提供了巨大无比的信息资源和服务资源.
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利用DiversiLab细菌同源性分析技术分析地震伤员分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特点
目的 分析华西医院地震伤员所分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)特点,并与同期非灾区患者分离MRSA进行同源性比较.方法 使用细菌基因组重复序列PCR(Rep-PCR)技术以及DiversiLab细菌同源性分析技术对地震住院伤员所分离出的5株MRSA与同期非灾区的住院患者分离的6株MRSA进行同源性分析.结果 11株MRSA的基因图谱分为5组(A-E组),地震伤员MRSA分布为A组1株、B组2株、C组1株以及E组1株,非地震伤员的MRSA分布为A组3株、B组1株、C组1株以及D组1株.结论 地震伤员的MRSA与同期部分科室的非灾区患者的MRSA呈高度同源性.
