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钙网蛋白与凋亡细胞的清除
钙网蛋白(calreticulin,CRT)是一种分子量为46.5 Kd的可溶性Ca2+结合蛋白,属于KDEL(内质网滞留信号肽)蛋白家族,包含球状的N末端、富含Proline的中间区和富含酸性氨基酸的C末端三个结构域.
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多种缺损及突变的PrP蛋白在杆状病毒中的表达和纯化
PrP蛋白多肽序列上存在有不同的功能区域,影响着蛋白质构象、理化特性和生物学功能.为了获得不同缺损及突变的仓鼠PrP蛋白,以PCR方法获得不同大小的PrP基因片段,利用PCR大引物点诱变法获得带有突变糖基化位点PrP序列.所有PCR产物测序鉴定正确后,分别与pFASTBAC Hb质粒连接,与穿梭载体DH10BAC转座,构建各种重组病毒.Western blot证实,8种不同长度的仓鼠PrP蛋白可在昆虫细胞Sf9中表达,包括全序列的PrP1-231,信号肽缺失的PrP23-231;N端缺损的PrP90-231和PrP120-231;C端缺损的PrP1-199、PrP1-174和PrP1-160.糖基化位点突变:PrP23-231(N181Q).其中不带信号肽序列的PrP蛋白均呈HIS融合蛋白,而N端带有信号肽的PrP蛋白则不能与Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱结合,但可以同PrP特异性抗体发生免疫沉淀反应.这提示PrP信号肽序列在昆虫细胞中可能也发挥着与哺乳动物细胞相似的作用.不同缺损及突变的PrP蛋白的表达和纯化为进行蛋白生物学性状研究奠定了基础.
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白N端信号肽对其DNA免疫应答的影响
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是近年来引起世界养猪业严重经济损失的重要病原之一,可引起繁殖母猪流产和新生仔猪呼吸道疾病[1,2].该病毒属于动脉炎病毒科,有美洲型和欧洲型两种血清型.基因组为单股正链RNA,大小15kb左右,含有9个开放阅读框(ORF)[3].由ORF5、6和7编码的GP5、M和N蛋白是病毒的主要结构蛋白.
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白细胞介素-10检测及其临床意义
白细胞介素-10(简称白介素-10,interleukin-10,IL-10)是具有多种生物功能的细胞因子,它与机体自身免疫疾病、感染性疾病和肿瘤等有着密切关系.IL-10主要由单核细胞,巨噬细胞,肥大细胞,T、B淋巴细胞和激活的角质细胞产生.人的IL-10是一种单肽链的,由160个氨基酸组成的酸性蛋白,分子量为18.7kD(不包括N端18个氨基酸构成的信号肽序列),等电点为8.1,通常为二聚体(39kD).人IL-10和鼠IL-10核苷酸序列同源性达81%,氨基酸序列同源性达73%.人IL-10对人细胞和小鼠细胞均有作用,小鼠IL-10只对鼠细胞有作用,而对人细胞无作用.
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肾上腺髓质素前体中段(Prepro-ADM45~92):脓毒败血症的预测标志物
肾上腺髓质素前体肽原(Prepro-adrenomedullin, Prepro-ADM)由185个氨基酸残基组成,经剪切后形成多个片断,包括氨基端信号肽(1~21位氨基酸)、肾上腺髓质素前体N端20肽(PAMP)、肾上腺髓质素前体中段(Prepro-ADM45~92)、肾上腺髓质素(Prepro-ADM95~146)、肾上腺髓质加压素(Prepro-ADM153~185).
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细胞囊泡运输调节机制*--2013年诺贝尔生理学或医学奖工作介绍
2013年10月7日,瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝尔生理学或医学奖评审委员会将本年度诺贝尔生理学或医学奖联合授予美国耶鲁大学细胞生物学系主任James E.Rothman、加利福尼亚大学伯克利分校细胞生物学家Randy W.Schekman和德国生物学学家斯坦福大学教授Thomas C.Südhof,以表彰他们在细胞内主要运输系统方面所作的杰出贡献。这是继Günter Blobel因发现蛋白质具有特定的内在信号如信号肽等,并通过内在信号与靶位相互作用而指导蛋白质在细胞内的转运和定位而获得1999年诺贝尔生理学或医学奖后,细胞内在运输系统方面的相关研究再一次登上诺贝尔奖的舞台。这充分肯定了细胞的物质运输系统是意义重大的科学发现。
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表达干扰素-α2b重组长双歧杆菌工程菌的制备
目的 构建表达人干扰素-α2b(hIFN-α2b)蛋白的双歧杆菌工程菌,并验证靶蛋白的表达水平. 方法 人工合成hIFN-α2b基因,插入双酶切的pBAD质粒,构建重组质粒pBAD-IFN.制备双歧杆菌感受态,用pBAD-IFN电转化后PCR鉴定、筛选阳性克隆,筛选的阳性双歧杆菌克隆在L-阿拉伯糖诱导下表达靶蛋白,并进行Western blot检测.结果测序和双酶切鉴定表明成功构建重组质粒pBAD-IFN,Western blot检测证明氨苄青霉素筛选出的该质粒转化双歧杆菌阳性克隆经L-阿拉伯糖诱导表达分子质量单位为18 ku的hIFN-α2b蛋白. 结论 hIFN-α2b表达载体pBAD-IFN转化双歧杆菌后可表达hIFN-α2b蛋白.
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应用不同表达载体表达欧洲型PRRSV ORF5蛋白的研究
目的 构建多种欧洲型PRRSV GP5蛋白原核表达载体,并比较其在大肠埃希菌中的表达效率. 方法 参考GenBank发表的欧洲型PRRSV LV株(GenBank登录号:M96262)ORF5序列,通过序列分析,设计合成ORF5全基因序列扩增引物及信号肽缺失引物.构建原核表达质粒pET-28a-GP5、pET-28a-gGP5、pET-22b-GP5、pET-22b-gGP5、pET-32a-GP5、pET-32a-gGP5、pGEX-4T-GP5、pGEX-4T-gGP5,经IPTG诱导后采用SDS-PAGE电泳分析GP5蛋白在各个原核表达载体的表达情况. 结果 pET-28a-gGP5、pET-22b-gGP5、pET 32a-gGP5均没有高效的表达出缺失信号肽的GP5蛋白,缺少信号肽的GP5蛋白在pGEX-4T-1载体中高效表达,目的蛋白分子质量单位为42 ku,与理论值相符.没有缺失信号肽的GP5蛋白在pET-28a-GP5、pET-22b-GP5、pET-32a-GP5、pGEX-4T-GP5,均未得到高效表达.结论 本实验构建的重组原核表达载体pGEX-4T-gGP5能在大肠埃希菌中高效表达欧洲型PRRSV GP5蛋白,为进一步分析该蛋白的抗原性奠定了基础.
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幽门螺杆菌空泡毒素基因克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定
已发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)疫苗具有预防和治疗Hp感染的效果[1].大多数Hp菌株均能产生空泡毒素(vacuolating cytotoxin, vacA),其前体蛋白在分泌过程中只有相对分子质量(Mr)约87×103的VacA被转运到细胞外,Mr为4×103氨基末端信号肽和50×103羧基末端多肽分别留于细菌内、外膜中[2].Hp感染者血清中可出现VacA抗体,重组VacA在Hp SS1株小鼠感染模型中有80%的保护率[3].我们构建了vacA原核表达系统,所表达的重组VacA可作为Hp基因工程疫苗的候选抗原.
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人IL-2信号肽基因增强柯萨奇病毒B3型VP1 DNA疫苗诱导的中和抗体应答
目的将人白细胞介素2(hIL-2)信号肽基因与柯萨奇病毒B组3型(CVB3) 的VP1基因融合,构建分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3/sVP1;免疫小鼠后,通过测定血清特异性中和抗体效价及对致死量CVB3攻击的保护作用,评价疫苗的免疫效果. 方法采用重叠区基因扩增法,将hIL-2信号肽基因连同其下游11个氨基酸残基的基因与CVB3 VP1基因拼接,获得分泌型VP1(sVP1) 的基因;将sVP1基因克隆至真核表达载体pcDNA3,构建分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3/sVP1;肌注免疫小鼠,测定血清中CVB3特异性中和抗体的效价;第3次免疫后2周,腹腔内注射1000 TCID50的CVB3,观察小鼠生存情况. 结果成功构建了分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3/sVP1,插入的sVP1基因中含有hIL-2信号肽及其下游11个氨基酸残基的基因以及VP1基因;pcDNA3/sVP1可比对照质粒pcDNA3/VP1诱导小鼠产生更高水平的中和抗体. 结论 hIL-2信号肽基因增强了柯萨奇病毒B3型VP1 DNA疫苗诱导的中和抗体应答,为进一步研制高效的CVB3 DNA疫苗提供了实验基础.
关键词: DNA疫苗 柯萨奇病毒(CVB) 信号肽 基因克隆 中和抗体 -
人IgE Cε2-4蛋白稳定表达细胞株的建立与鉴定
目的 建立稳定高表达人IgE Cε2-4蛋白(E24)的工程细胞株,考察E24蛋白与膜受体(FceR Ⅰ)的结合.方法 从SKO-007细胞中钓取E24基因,分别克隆人真核表达载体PcDNA3.1(+)(需要在E24基因前加信号肽序列)和pCMV-L载体;瞬时转染293T细胞,利用双夹心ELISA法鉴定转染上清中的目的 蛋白;选择表达量相对高的质粒转染CHO细胞,G418筛选获得稳定细胞株;RT-PCR法在转录水平上检测E24基因,ELISA法鉴定稳定株上清中的E24蛋白,流式细胞术检测E24蛋白与FceR Ⅰ的结合.结果 成功构建了3种真核表达质粒SP-E24-P3.1、SP Ⅱ.E24-P3.1和E24-PL,瞬时转染293T细胞,上清中的目的 蛋白表达量分别为19.1、19.4和8.7μg/ml.以质粒SPⅡ-E24-P3.1转染CHO细胞,经3轮亚克隆获得了2株稳定高表达E24蛋白的细胞株,表达量均超过25 μg/ml.RT-PCR可扩增出细胞株中的E24基因;流式细胞术显示E24蛋白可以与FceR Ⅰ呈剂量依赖性的结合.结论 经筛选获得了2株表达E24蛋白的工程细胞株,且E24可以特异性的结合FceRⅠ.
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跨膜型肿瘤坏死因子信号肽氨基酸部分缺失对细胞毒作用影响
目的探讨跨膜型肿瘤坏死因子(TM-TNF)信号肽在其杀瘤中的作用.方法用PCR构建突变体及体外转录、翻译蛋白质,分别获得TM-TNF信号肽胞浆段、胞外与分泌型肿瘤坏死因子(S-TNF)连接段以及部分跨膜段缺失即信号肽第-73~-47、-73~-34、-34~-1、-21~-1位氨基酸缺失的TM-TNF体外翻译蛋白.用MTT法检测其对HL-60细胞的杀伤率.结果-34~-1、-21~-1位氨基酸缺失可提高TM-TNF对HL-60细胞的杀伤,-73~-47位氨基酸缺失对其杀瘤力无明显作用,而-73~-34位氨基酸缺失可使其杀瘤率明显下降.结论去除信号肽胞外段可提高TM-TNF-α对HL-60细胞的杀伤率,而TM-TNF-α信号肽-47~-34位氨基酸在其杀瘤过程中有重要作用.
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脂联素相关研究进展
一、脂联素的结构及受体1.脂联素基因学和蛋白质结构:人类脂联素基因的编码基因为apM1,位于染色体3q27上,由3个外显子和2个内含子组成.人类脂联素的蛋白质结构含有244个氨基酸,包括N-端信号肽、C端芳香族氨基酸球状序列、N端特异的非胶原序列,其后紧接着一段类似胶原的G-X-Y3氨基酸重复序列[1].经过翻译加工修饰可以生成8种同源蛋白.其中C端芳香族氨基酸球状序列是脂联素蛋白活性的关键部位,这一结构域与胶原Ⅷ、X、补体c1q和TNF-α家族具有结构上的同源性[2].
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单核细胞趋化蛋白-1的作用机制研究进展
趋化因子(chemokines)是一类小分子分泌性蛋白质,具有募集、活化特定白细胞的功能,并且对炎症反应的启动以及维持有着重要作用.趋化因子根据其分子氨基端两个高度保守的半胱氨酸残基位置,分为4个家族:C-X-C,CC,C和CX3C.单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/CCL2)属于CC趋化因子家族,其分子结构包括23个氨基酸组成的信号肽和76个氨基酸组成的成熟肽,可由多种细胞分泌,包括上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及单核细胞等,其能募集单核细胞、记忆型T细胞和树突状细胞到损伤组织或者感染病灶,可由血小板衍生生长因子(PDFG)、IL-1和IL-4、TNF-α、VEGF、LPS和IFN-γ刺激相关细胞而释放.
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内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒的包装与鉴定
目的:构建内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒载体并包装成重组腺病毒,为下一步基因治疗打下基础.方法:用PCR方法在hENDO基因的5'端引入IL3信号肽、3'端引入弹性蛋白连接肽序列(linker),再与sVEGI基因连接,插入到pCA13腺病毒载体中.用脂质体介导包装出重组腺病毒,PCR法对重组腺病毒进行鉴定.结果:构建完成hENDO-sVEGI融合基因重组腺病毒载体,融合基因包括IL3信号肽、hENDO全长基因、弹性蛋白连接肽序列和sVEGI基因,总长度约1114 bp,经酶切鉴定、序列分析证实克隆序列、插入方向和读码框架均正确.可包装出携带融合基因的重组腺病毒,用TCID50法测定粗制重组腺病毒滴度为2×1011 TCD50/L.结论:成功构建了hENDO-sVEGI融合基因,连接肽序列使两蛋白空间构象不受影响,IL3信号肽保证蛋白可被分泌至胞外.完成携带融合基因的重组腺病毒的包装与鉴定,为进一步开展肿瘤基因治疗研究奠定了基础.
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氨基末端脑钠肽前体与急性心肌梗死的究进展
脑钠肽(brain natriuretic peptide/B-typenatriuretic peptide,BNP)是利钠肽家族中研究为深入的一种神经激素,在心脏结构和功能的维持中起着重要作用.当心室肌细胞压力负荷增加时合成分泌含134个氨基酸残基的前脑钠肽原,其后被迅速剪切掉含有26个氨基酸残基的信号肽,形成BNP前体,随后前体在血液中分解成具有生物活性的BNP和无生物活性的氨基末端脑利钠肽前体(N-terminal pro-BNP,NT-proBNP ).
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瘦素与肝病
1994年Friedman等[1]应用定向克隆法(positional cloning)从肥胖与糖耐量异常的动物ob/ob小鼠中首次成功克隆出肥胖基因(ob gene)及人类的同源序列,人和小鼠之间的ob基因的编码序列同源性高达84%,基因的高同源性提示ob基因及其表达产物功能的高度保守性.ob基因结构和序列的改变可以导致肥胖.Halaas等[2]于1995年应用DNA重组技术,由大肠杆菌中合成出人和小鼠ob基因的表达产物,该产物是一种分泌蛋白,其前体由167个氨基酸残基组成,N末端有21个氨基酸残基信号肽,该前体的信号肽在循环血液中被切掉而成为146个氨基酸,分子量为16 000,由于其基本作用是使动物的体重降低而变瘦,故Halaas等将该蛋白命名为瘦素(leptin).现已发现,瘦素主要由白色脂肪细胞及胎盘、胃等部位表达[3,4],具有中枢性抑制摄食、免疫调节和抑制血管新生作用[5-7].
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补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白1与动脉粥样硬化风险因素
脂肪组织是机体能量的储存器官.近年研究表明脂肪细胞是重要的内分泌器官,可以分泌一系列细胞因子,参与体内的物质代谢及免疫炎症反应.补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白1(CTRP1)是新近发现的脂肪细胞因子,与高血压、糖脂代谢紊乱及肥胖有关.本文对近年有关CTRP1分子生物学特性及其与动脉粥样硬化风险因素的研究现状综述如下.一、CTRP1的分子结构CTRP是与肿瘤坏死因子α(TNF-α)具有相似空间结构的蛋白,均含C末端球形结构域和N末端信号肽.CTRP1是CTRP超家族成员之一,Wong等[1]发现它与脂联素也有高度相似的空间结构,都包括1个N末端信号肽、1个短的可变结构域、1个包含不同长度Gly-X-Y(X、Y可代表任意氨基酸)重复序列的胶原结构域和1个与补体蛋白C1q同源的C末端的球形结构域.尽管与脂联素的空间结构相似,但两者没有高度同源的核酸及氨基酸序列,仅有4个同源高度保守的氨基酸残基(Tyr-161、Gly-159、Phe-237和Leu-242)形成疏水核.
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胰腺炎相关蛋白
胰腺炎相关蛋白(pancreatitis as-sociated protein,PAP),是在1 984年由Keim等[1]在大鼠急性胰腺炎模型的胰液中发现,由于这种蛋白在急性胰腺炎时胰液中测得,而在正常胰腺测不到,因而将其命名为"胰腺炎相关蛋白".PAP属C类植物血凝素基因家族,在急性胰腺炎时过度表达,与急性胰腺炎的严重程度、临床过程密切相关.除胰腺外,PAP还广泛存在于回肠、空肠、十二指肠等处,经表达PAP的组织及肾脏迅速从血循环清除.另外,PAP还与某些消化道肿瘤等疾病有关.现就PAP的生物学特性进行简要的介绍.一、PAP的生物学特点Keim等[1]从蛙皮素或牛磺胆酸钠诱发的大鼠急性胰腺炎模型胰液中提取了PAP,用双向PAGE推测出PAP的分子量约为16 000,等电点为8.2.进一步研究发现PAP合成于胰腺组织的粗面内织网,存储于酶原颗粒中.PAP在正常胰腺细胞及胰液中几乎测不到,而在急性胰腺炎时胰腺组织中的浓度可增加至少100倍.1. PAP的蛋白及基因结构:PAP在胰腺中以前蛋白的形式存在,由175个氨基酸组成,其N端有26个氨基酸组成的信号肽,去掉信号肽后变为PAP蛋白分泌入胰液[2].
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口腔变形链球菌感受态刺激因子的蛋白合成及活性检测
目的 探讨口腔变形链球菌(S.mutans)密度感应系统信号蛋白的体外合成及其生物活性.方法 采用化学合成法口腔S.mutans密度感应感受态刺激因子(CSP)信号蛋白,通过高效液相色谱仪纯化合成蛋白,质谱分析结构,通过扫描电镜对比观察CSP信号蛋白对S.mutans生物膜形成的影响,分析CSP信号蛋白的生物活性.结果 化学合成纯化S.mutans CSP蛋白分子,加入CSP信号肽后.S.mutarts生物膜呈团状密集分布,细菌之间存在厚实的黏性胞外分泌物,细菌黏连呈链团状.结论 成功合成口腔S.mutans CSP信号蛋白,该蛋白肽具备促进S.mutans生物膜形成的生物活性.