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霍乱弧菌密度感应系统研究进展
密度感应( Quorum sensing,QS)系统在细菌中普遍存在,细菌细胞通过识别和密度依赖性应答其自身或周围环境中其他菌细胞分泌的一种或多种信号分子来影响一系列基因的转录表达,从而参与细菌多种生理功能的调节.革兰阴性菌的密度感应现象早发现于海洋弧菌中,本文主要综述了烈性肠道传染病病原体-霍乱弧菌中密度感应系统的研究进展,包括系统组成、信号传递过程、调节的生理功能及与其他全局性调控因子的相互作用.
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大肠杆菌qseC基因敲除及其缺陷株生物被膜形成的研究
目的 通过Red同源重组法构建qseC基因缺失的大肠杆菌突变株,并探讨qseC基因对大肠杆菌生物被膜形成的影响.方法 PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化人大肠杆菌MC1000,在Red同源重组酶作用下,用含同源臂的氯霉素抗性片段置换目的基因qseC,并利用FLP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除.结晶紫染色半定量法分析qseC基因缺失株生物被膜形成能力的变化.结果 PCR及DNA测序结果表明,qseC基因已被成功敲除.在LB培养基中,qseC基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异.MC1000与MC1000 △qseC基因缺失株生物被膜形成能力半定量A值的结果分别为1.00±0.15和0.47±0.10.结论 成功构建大肠杆菌qseC基因缺失突变株,且qseC基因对细菌生物被膜的形成具有调控作用.
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AiiA蛋白对铜绿假单胞菌毒力因子生成的影响
目的 构建苏云金杆菌AiiA基因的真核表达载体并转染A549细胞,观测真核细胞表达的AiiA蛋白对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,tgiaosa,Pa)密度感应(quorum sensing)系统酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)信号分子及毒力因子合成的影响.方法 质粒pET-AiiA经Nhe Ⅰ与Xho Ⅰ酶切后,将AiiA基因片段连接入真核表达质粒pEGFP-N2,脂质体转染A549细胞,提取细胞蛋白,Western blot检测AiiA蛋白表达.将蛋白提取物加入Pa培养物中,观察Pa AHL信号分子及毒力因子绿脓素、弹性蛋白酶的生成情况.结果 AiiA基因片段成功克隆入真核表达质粒pEGFP-N2,转染该质粒后的A549细胞能够表达AiiA蛋白,且该蛋白能够降低Pan培养物中AHL信号分子水平,且绿脓素和弹性蛋白酶的牛成减少.结论 本研究成功构建了真核表达质粒pEGFP-N2-AiiA,转染细胞后表达的AiiA蛋白能够水解AHL信号分子,减少Pa毒力因子的生成,故具有抗Pa感染的潜在价值.
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变异链球菌LuxS基因缺陷株的建立及其耐酸能力的研究
目的 建立LuxS基因缺失的变异链球菌突变菌株,并对突变株的耐酸能力进行研究.方法 以变异链球菌UA159为材料,运用基因重组方法将红霉素抗性基因(Eymr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到质粒载体PUC19的多克隆位点中,获得了具有红霉素抗性的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用红霉素抗性筛选出LuxS基因缺失的突变株.检测变异链球菌LuxS基因突变菌株在不同pH环境下生长情况,并以正常菌株为对照.结果 PCR基因扩增结果显示,突变株LuxS基因已被Eymr基因完全替换,不能再编码合成AI-2(autoinducer 2)信号分子,扩增产物经DNA测序证实筛选得到了LuxS基因缺失的突变株,并且突变株不能诱导V.harveyi BB170的生物发光.与变异链球菌标准菌株相比,LuxS基因突变株的生长情况随着pH的降低受到明显抑制.结论 本研究成功构建LuxS基因缺失的变异链球菌突变株,LuxS感应信号系统参与变异链球菌耐酸能力的调控,LuxS基因缺失菌株耐酸能力降低.
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密度感应对铜绿假单胞菌运动能力及其生物被膜形成调控的研究
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugu-nosa,P.a)生物被膜(BF)的形成主要受密度感应(quorum sensing,QS)系统调控,尤其在BF形成早期,QS对P.a泳动、丛集运动和颤搐运动起着非常重要的作用.因此本研究以P.a野生型中PAOI菌株及其OS相关基因缺失菌株为实验菌株,检测其泳动、丛集和颤搐运动,测量菌落生长形成的云雾状区域半径,观察菌落生长形态.以无菌1 cm×1 cm聚氯乙烯气管导管为载体,建立体外P.a静止BF模型,扫描电镜观察载体表面BF.采用SPSS13.0软件包进行分析,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义.
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金黄葡萄球菌附属基因调节子与生物被膜及耐药的研究进展
近年来由于金黄葡萄球菌(Staphylococcus au-reus)感染率的增加、产生耐药速度的加快,以及其易于从急性感染向慢性、持久性、复发性感染转变等特点,金黄葡萄球菌(简称金葡菌)导致的感染已逐渐成为人们关注的焦点.其附属基因调节子(ac-cessory gene regulator,Agr)是一种重要的密度感应(quorum sensing,QS)信号系统和毒力因子调节系统,参与金葡菌的生物被膜(biofilm)形成和毒力因子(virulence factor)表达[1].本文就国外近年来有关金葡菌Agr与生物被膜和耐药性方面的研究进行综述.
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牙髓卟啉单胞菌密度感应系统luxS基因的克隆及测序
目的 检测牙髓卟啉单胞菌模式株、临床分离株密度感应系统luxS基因.方法 选取牙髓卟啉单胞菌模式株及临床分离株作为研究对象,提取细菌基因组DNA,PCR克隆及测序,并通过基因序列比对,比较临床分离株和模式株的一致性.结果 电泳鉴定存在目的条带,克隆测序和序列比对表明,牙髓卟啉单胞菌PCR产物与目的基因完全一致(均为100％).结论 本实验引物设计合理,能较好地扩增出牙髓卟啉单胞菌的luxS基因,并对其进行测序,为进一步研究牙髓卟啉单胞菌luxS基因的功能奠定基础.
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luxS基因依赖的密度感应信号系统在口腔微生物领域的研究现状
密度感应(quorum sensing,QS)是指细菌感应周围环境菌种内或菌种间细胞的密度,分泌可溶性信号分子,又称自体诱导分子(autoinducers,AI),调控细菌生理功能和毒力以适应周围环境的变化.
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牙周致病菌密度感应信号系统luxS基因的检测
目的 检测牙周可疑致病菌密度感应信号系统luxS基因,了解其在牙周致病菌中的分布.方法 选取牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌的模式株、参考株及临床分离株作为研究对象,提取DNA,通过聚合酶链反应(PCR)、电泳鉴定和DNA测序,并利用GenBank数据库的Blast检测以上细菌luxS基因的存在情况.结果 电泳鉴定存在目的 条带,测序和Blast检测表明牙龈卟啉单胞菌PCR产物与目的 基因有高度一致性(均为99%以上),具核梭杆菌测序结果 与GenBank数据库的基因相同,伴放线放线杆菌电泳鉴定结果 显示存在目的 条带(750 bp),与参考条带大小一致.结论 本实验引物设计合理,能较好地扩增出牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌各实验菌株的luxS基因,为进一步研究luxS基因的功能奠定了基础.
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口腔变形链球菌感受态刺激因子的蛋白合成及活性检测
目的 探讨口腔变形链球菌(S.mutans)密度感应系统信号蛋白的体外合成及其生物活性.方法 采用化学合成法口腔S.mutans密度感应感受态刺激因子(CSP)信号蛋白,通过高效液相色谱仪纯化合成蛋白,质谱分析结构,通过扫描电镜对比观察CSP信号蛋白对S.mutans生物膜形成的影响,分析CSP信号蛋白的生物活性.结果 化学合成纯化S.mutans CSP蛋白分子,加入CSP信号肽后.S.mutarts生物膜呈团状密集分布,细菌之间存在厚实的黏性胞外分泌物,细菌黏连呈链团状.结论 成功合成口腔S.mutans CSP信号蛋白,该蛋白肽具备促进S.mutans生物膜形成的生物活性.
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变形链球菌ComCDE密度感应参与不同菌种的竞争
目的 研究口腔变形链球菌( S.mutans )ComCDE密度感应系统参与血链球菌(S.sanguinis)的相互竞争作用.方法 采用LIVE\DEAD BacLightTM荧光染色结合激光共聚焦显微镜,观察变形链球菌(简称变链菌)在CSP信号肽诱导下群体细菌自身死亡变化；通过荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细菌素以及细菌素免疫蛋白相关基因表达变化,分析变链菌ComCDE系统参与菌群生存竞争的调控机制.结果 在细菌竞争中,变形链球菌△comC、△comD 、△comE突变株失去不同菌种间的竞争力,无法抑制相邻Ssanguinis的正常生长；只有野生株保持竞争力,抑制相邻S.sanguinis生长,形成缺陷菌环.CSP信号肽诱导下,变链菌群体死菌/活菌率增高58.1％(P＜0.05)；细菌素及免疫蛋白相关SMU.151、SMU.423、SMU.1913c基因分别升高23.3倍(P=0.00)、15.9倍(P＜0.05)、19.3倍(P＜0.05).结论 变形链球菌ComCDE密度感应系统调控变链菌的变链素及免疫蛋白产生、参与不同菌种间竞争生存.
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密度感应系统基因lasR/rhlR对大鼠铜绿假单胞菌生物膜感染气管插管模型肺组织Foxp3、TGF-β1和IL-10表达的影响
目的 研究铜绿假单胞菌野生株(PAO1)及其密度感应(QS)系统基因lasR/rhlR缺失株(AlasR△rhlR)生物膜感染对气管插管模型鼠肺组织Foxp3、转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素10(IL-10)表达的影响.方法 21只SD大鼠随机均分为3组(n=7):PAO1组、△lasR△rhlR组及无菌对照组.体外培养生物膜(BF)并经导管置入气管,7d后行肺组织HE染色及肺部组织匀浆菌落计数(cfu),并检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-10、肺组织TGF-β1、肺组织细胞Foxp3mRNA表达情况.结果 PAO1组、△lasR△rhlR组肺组织均培养出细菌(cfu分别为10400.00±6313.70、975.00±559.97/g肺组织),显著高于无菌对照组(未培养出细菌,P＜0.05),且PAO1组肺部细菌量明显高于△lasR△rhlR组(P＜0.05);肺组织HE染色结果显示:无菌对照组局部轻微充血,无明显炎症改变;PAO1组血管及支气管周围大量炎症细胞浸润,肺泡间隔增宽,局部脓肿、坏死;△lasR△rhlR组肺组织病理改变较PAO1组减轻.PAO1组、△lasR△rhlR组IL-10含量(分别为188.07±57.01ng/ml、93.31±17.26ng/ml)明显高于无菌对照组(57.43±22.13ng/ml),且PAO1组明显高于△lasR△rhlR组(P＜0.05).PAO1组、△lasR△rhlR组TGF-β1累积光密度值明显高于无菌对照组,且PAO1组明显高于△lasR△rhlR组(P＜ 0.05).PAO1组、△lasR△rhlR组Foxp3 mRNA表达量(分别为4.62±1.07、2.15±1.43)明显高于无菌对照组(0.65±0.32),且PAO1组明显高于△lasR△rhlR组(p＜0.05).结论 铜绿假单胞菌QS系统lasR/rhlR基因可促进铜绿假单胞菌生物膜引起的气管插管模型大鼠的炎症反应,促进肺组织Foxp3表达上调,伴随TGF-β1、IL-10分泌增多,促使感染迁延化和慢性化.
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LuxS/AI-2密度感应信号及其在口腔致病菌感染中的作用
密度感应是细菌之间通过分泌和感应胞外信号分子而进行的交流活动,密度感应使细菌同时激活相关基因的表达,协调菌群生物学行为.目前认为AI-2在细菌种间交流中起通用信号分子的作用.LuxS/AI-2参与口腔细菌间的交流,并参与调控毒力因子表达和牙菌斑生物膜的稳定.
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LuxS基因缺陷对变形链球菌生物膜形成的影响
目的 观察LuxS基因缺失后变形链球菌生物膜成熟初期的变化情况.方法 通过扫描电镜观察标准菌和缺陷菌在不同营养环境中生物膜成熟初期的形成情况.结果 对不同营养环境中形成的生物膜观察,发现在富含蔗糖的环境中,缺陷菌成熟初期的生物膜形成能力较标准菌弱.结论 LuxS基因缺失后变形链球菌在蔗糖环境中生物膜形成的能力减弱.
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ComD基因缺陷对变异链球菌生物膜形成的影响
目的 观察变异链球菌密度感应信号系统相关基因ComD基因缺失前后变形链球菌生物膜成熟初期的变化情况,探讨ComD基因对变异链球菌形成菌斑生物膜的影响,从而为防治龋病提供实验依据和新方法.方法 分别构建标准菌和缺陷菡在离体模型上的培养模型,通过扫描电镜观察两个实验组在6h、12 h、24h三个不同时间点的生物膜形成情况.结果 在三个不同时间点观察生物膜形成,扫描电镜结果显示培养6h和12 h两种菌株形成生物膜无明显差异,培养24 h后发现ComD缺陷菌形成的生物膜中细菌定植较少且生物膜孔隙大而疏松.结论 与标准菌株相比,ComD基因缺陷的变异链球菌在成熟初期生物膜表型有明显缺陷,因此ComD基因可以作为防治龋病的靶点之一.
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变异链球菌LuxS缺陷株甲基循环通路的恢复构建
目的:以变异链球菌LuxS缺陷株为模型,构建其密度感应缺陷的甲基循环恢复株.方法:以LuxS为阳性表达对照,通过在变异链球菌LuxS缺陷株中异源表达SahH,实现其代谢通路的恢复构建.通过Western印迹、反转录PCR和信号分子AI-2分泌检测,验证目的蛋白的表达.采用SAS8.0软件包对数据进行统计学分析.结果:Western 印迹检测2种蛋白在大肠杆菌中均得到正确表达,验证了克隆载体的正常表达能力;反转录PCR验证了变异链球菌LuxS缺陷株中luxS及sahH mRNA的存在:发光实验证实LuxS阳性表达对照株AI-2的分泌能力恢复.结论:成功构建变异链球菌LuxS缺陷的代谢恢复株,为探讨LuxS的调控机制提供了分子生物学工具及实验对照.
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大肠杆菌密度感应缺陷株中sahH基因克隆与表达的研究
目的 利用克隆和表达sahH基因,恢复大肠杆菌密度感应缺陷株的甲基循环通路.方法 通过扩增铜绿假单胞菌sahH基因,克隆到pGEX4T-1载体上,继而转入大肠杆菌密度感应缺陷株.诱导培养后,经考马斯亮蓝染色及蛋白印迹鉴定SahH-GST融合蛋白的表达.结果 成功扩增并克隆了sahH基因,在大肠杆菌密度感应缺陷株中表达出约75 ku大小的蛋白,其大小与SahH-GST蛋白相符.结论 大肠杆菌密度感应缺陷株内可以表达外源基因sahH,恢复了甲基循环的该菌株可进一步应用于密度感应与代谢循环调节作用的实验.
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大肠杆菌密度感应缺陷株中LuxS的表达及其对生物膜形成的影响
目的:研究在大肠杆菌密度感应缺陷株中表达LuxS蛋白对于生物膜形成相关基因的影响.方法:在大肠杆菌密度感应缺陷株MDAI2中表达LuxS蛋白,继而通过Real-time PCR检测菌株间生物膜形成相关基因的表达差异.结果:野生株中生物膜形成相关基因motA、motB表达量约为MDAI2的2～5倍,而表达了LuxS蛋白的MDAI2中该基因的表达量则为6～8倍,且差异具有统计学意义.结论:大肠杆菌密度感应缺陷株内表达LuxS,可以恢复其密度感应系统继而恢复生物膜形成相关基因的表达.
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密度感应抑制剂及其在口腔微生物领域中的研究进展
密度感应即密度感知或群体感应,是细菌彼此间信号传递的一种机制.诸多的天然植物提取物和化合物皆具有抑制密度感应的作用.本文就革兰阴性菌的密度感应系统中N-酰基高丝氨酸内酯抑制剂和LuxS/AI-2信号系统拮抗剂及其在口腔领域中的应用作一综述.
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密度感应相关性变链素及其作用分析
细菌素是由某些细菌在代谢过程中产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽,变异链球菌产生的细菌素称为变链素.变链素可能与口腔生物膜中变异链球菌的致龋性及其在牙面的定植有关.目前已有多种变链素被分离、纯化并完成了基因序列和氨基酸序列的测定,变链素与密度感应调控系统的关系及在新型抗菌制剂研发中的应用价值已受到人们关注.本文就密度感应相关变链素及其作用的研究现状作一综述.
