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抵抗素样分子家族
抵抗素样分子家族(resistin-like molecules,RELM s)是一组由105~117个氨基酸残基组成的蛋白质家族,家族成员均含有3个结构域:氨基端信号肽、中间可变区、相对保守的富含半胱氨酸的羧基末端序列(CX11-C-X8-C-X-C-X3-C-X10-C-X-C-X-C-X9-CC),该家族的蛋白与家族之外的其它蛋白缺乏明显的同源性[1].2000年美国科学家Steppan等人在筛查噻唑烷二酮类(TZDs)药物下调的基因时首先发现抵抗素,随后,在人和小鼠的研究中又发现该家族中的其它成员,其成员包括RELM α(FIZZ 1),RELMβ(FIZZ 2),抵抗素(FIZZ 3,resistin)和RELM γ[2,3].目前对抵抗素样分子家族的功能及其调控机制研究还处于初步阶段,本文在此对各成员的研究进展作一综述.
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抵抗素样分子家族成员FIZZ1研究进展
抵抗素样分子家族(resistin-like molecules,RELMs)是一组由105~114个氨基酸组成的蛋白质,富含半胱氨酸(Cys),家族成员均含有3个结构域:氨基端信号肽、中间可变区、相对保守的富含半胱氨酸的羧基末端序列(CX11-C-X8-C-X-C-X3-C-X10-C-X-C-X-C-X9-CC),其成员包括FIZZ 1(RELMα),FIZZ 2(RELMβ),FIZZ 3(resistin,抵抗素)和RELMγ.本文在此对FIZZ1的结构分布特点及其在疾病中的作用作一综述.
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半胱氨酸蛋白酶在医学寄生虫学领域的研究进展
半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease)是一类在酶的活性中心含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶,该酶在生物体内初合成时常为前体物质,包括无活性的前体区和催化区.前体区提供了大量独特的功能,涉及在细胞内有助于蛋白质折叠的监护分子、内源性的蛋白抑制因子以及信号肽序列.半胱氨酸蛋白酶广泛地存在于人类、寄生虫等多种动物体内,因此生物体内的绝大多数化学反应都需要蛋白酶的催化.对人类半胱氨酸蛋白酶的研究工作主要集中在凋亡和肿瘤两个方面 [1,2],而对寄生虫半胱氨酸蛋白酶的研究,由于该酶涉及虫体的毒力、对组织和细胞的侵袭力和免疫逃避等多个方面,因此对其研究更为广泛.本文重点对寄生虫半胱氨酸蛋白酶近期研究的进展作一综述.
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雄性大鼠生殖系统中发现的一种抗菌肽基因
Li P,Chan HC,He B et al.An Antimicrobial Peptide Gene Found in the MaleReproductive System of Rats. Science,2001,291(5509):1783~1785.生殖道感染是全球性的公共卫生问题,人们对雄性生殖道天然的宿主防御机制仍然知之甚少.中科院分子生物学国家重点实验室的研究人员采用mRNA差异显示技术,从大鼠附睾中克隆出一条cDNA片段,命名为Bin1b,全长385bp,ORF为204bp,编码一条68个氨基酸的多肽(包括16个氨基酸的信号肽).Northern blot和原位杂交证实Bin1b特异性表达于大鼠的附睾头部,与精子的成熟、贮存和防御有关.这条多肽的结构和抗微生物活性与阳离子抗菌肽β-防御素类似,其表达在大鼠性成熟时高,且能被感染上调.Bin1b似乎是一种天然的附睾特异性抗菌肽,在生殖道宿主防御和雄性生育中具有重要作用.(朱培元摘译,黄宇烽审校)
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青霉素G酰化酶通用表达载体的构建方法初探
结合信号肽预测软件(Signal P)对现有的青霉素G酰化酶(PGA)的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达质粒pZ01进行信号肽的合理设计,在其C-端置换2个氨基酸,即引入NotI酶切位点序列,从而构建成PGA的通用表达载体.将粪产碱杆菌(Alcdigenesfaecdis)的PGA基因导入其中,构建成表达质粒pzfpganoti.,转入枯草杆菌进行表达,测活结果显示,表达产物具有生物活性(酶的平均活力为0.18 U/ml发酵液).为进一步应用信号肽预测软件进行表达系统的研究、设计打下了基础.
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双精氨酸转运(Tat)系统及其在大肠杆菌分泌表达重组蛋白中的应用
常见的分泌途径(Sec途径)是细菌中蛋白分泌跨膜转运的主要途径,而双精氨酸转运(Tat)则是另外一个蛋白分泌跨膜转运系统,该系统的特征是在分泌蛋白的信号肽中含有一个高度保守的双精氨酸基序.与Sec途径相比,Tat系统的显著优点是它只分泌已正确折叠的蛋白,而未正确折叠的蛋白则不能通过该系统分泌,这样就保证了分泌产物在结构上的正确性.因此,研究利用Tat信号肽牵引重组蛋白通过Tat系统进行分泌跨膜转运在重组蛋白的表达方面具有很好的应用前景.
关键词: 细菌 Sec途径 双精氨酸转运(Tat)系统 信号肽 蛋白质跨膜转运 -
改变毕赤酵母信号肽对人三叶因子3表达的影响
为了表达具有天然N-末端的人三叶因子3,构建了含两种信号肽序列的毕赤酵母表达载体,其中一种表达载体在分泌信号肽序列a-factor后保留STE13信号肽切割序列,另一种表达载体去除了该序列.将2种表达载体分别转化到毕赤酵母GS115中进行表达.经甲醇诱导后目的蛋白分泌到发酵液上清中,SDS-PAGE和Western印迹证明2种重组蛋白均以二体的形式分泌表达,分子质量约为13ku,都能被TFF3抗体所识别.N-端氨基酸测序证明其中一个重组蛋白具有天然人TFF3的N端,质谱检测分子质量与天然蛋白一致;另一重组蛋白N-端则带有2个未切割完全的信号肽序列CluAla,质谱检测该蛋白中还含有部分切割完全的蛋白.
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病毒载体介导β折叠阻断肽的表达及其对β淀粉样蛋白神经毒性的抑制作用
目的:通过病毒载体转染体外培养的海马神经元,观察后者表达分泌性的β折叠阻断肽(β-sheet breaker peptide,BSB)的生物活性。方法:采用分子克隆技术构建编码神经营养素4(neurotrophin-4,NT4)信号肽-BSB 融合基因的重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated vrius,rAAV)载体,AAV 在包装细胞系293细胞中进行包装,蔗糖梯度离心法纯化病毒颗粒,斑点杂交法测定重组病毒滴度。MTT 检测及电镜观察 BSB 的生物学效应。结果:成功构建 pSSHG/NT4-BSB 质粒载体,纯化后获得滴度为3.6×1012~1.8×1013/mL 的病毒颗粒。通过病毒感染培养的神经元分泌表达的 BSB 有效地抑制了β-淀粉样蛋白(Aβ)的纤维化聚集,明显降低了 Aβ在体外的神经元毒性。结论:采用 AAV 载体介导的 BSB 短肽的分泌表达在体外培养的海马神经元中显示了良好的生物活性。
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幽门螺杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆及序列分析
目的:克隆不同疾病来源的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)γ-谷氨酰转肽酶(Gamma-glutamyltranspeptidase,GGT)基因,并进行序列分析.方法:从人胃黏膜组织中分离培养获得Hp,提取其基因组DNA,对GGT基因进行 PCR扩增,克隆进 pMD18-T 载体,进行测序和生物信息学分析,并与基因库中公布的标准株26695和J99的GGT氨基酸序列进行比对分析.结果:成功克隆了分别来源于慢性胃炎,胃溃疡,十二指肠溃疡和胃癌的4种Hp菌株GGT片段,并进行了序列分析.4种病源的Hp GGT序列大小均为1 704 bp,编码 567 个氨基酸,理论分子质量是61 kDa,等电点是9.3,在N端具有信号肽,含有ATP蛋白激酶结合结构域和γ-谷氨酰转肽酶保守结构域.序列比对分析显示,不同来源的Hp菌株GGT具有很高的保守性.结论:GGT在Hp中高度保守,具有分泌作用,可能对宿主细胞产生影响.该基因的成功克隆为进一步研究其功能打下了基础.
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瘦素对生殖功能的影响
瘦素(Leptin)是一种新型脂源性蛋白激素,由人体的白色脂肪合成,是肥胖基因(ob)的编码产物,含167氨基酸。ob基因位于第6号染色体,基因长20Kb,由3个外显子和2个内显子组成。小鼠分泌型瘦素为18KD,循环中瘦素为16KD,含21个氨基酸的信号肽,具有调节机体能量代谢和生殖功能。肥胖患者血清瘦素浓度明显升高,瘦素的分泌具昼夜性,午夜和清晨高,中午至下午一段时间低。在循环中瘦素有游离和结合两种形式,只有游离瘦素……
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氨基末端脑钠肽前体与急性心肌梗死的研究进展
脑钠肽(BNP)是利钠肽家族中研究为深入的一种神经激素,在心脏结构和功能的维持中起着重要作用.当心室肌细胞压力负荷增加时合成分泌含134个氨基酸残基的前脑钠肽原,其后被迅速剪切掉含有26个氨基酸残基的信号肽,形成BNP前体,随后前体在血液中分解成具有生物活性的BNP和无生物活性的氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP).
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瘦素与肥胖的关系
1 前言瘦素(Leptin,LP)是由脂肪细胞分泌的一种肽类激素[1].瘦素被认为是一种饱食信号,可以通过刺激饱食中枢而降低摄食.LP主要是由白色脂肪组织分泌的,且只有在成熟的脂肪细胞中才有表达.LP原形由167个氨基酸组成,在分泌入血过程中去除由21个氨基酸组成的N-端信号肽,形成成熟的LP.其相对分子量为16KD,具有强亲水性,以单体形式存在于血浆中,通常血液浓度约为10-9g/ml.其半衰期为(9.4±3.0) min.
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不同信号肽对重组胰高血糖素样肽-1载体表达效率的影响
目的 观察不同信号肽对重组胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌的影响,筛选高效表达GLP-1的信号肽.方法 构建GFP-GCG-GLP-1、GFP-NT4-GLP-1、GFP-EX4-GLP-1重组质粒,根据信号肽不同分为阴性对照(NC)、空载、EX4、NT4和GCG组.使用Vigofect试剂盒转染HEK293T细胞;RT-PCR分析转染后HEK293T细胞GLP-1 mRNA表达水平;ELISA法测定转染后培养基上清液中GLP-1水平.结果 转染24 h后HEK293T细胞,检测EX4、NT4、GCG组GLP-1 mRNA水平差异无统计学意义,与NT4、GCG组比较,培养基上清液中EX4组GLP-1蛋白浓度升高,差异有统计学意义(P<0.01).结论 3种信号肽均能引导GLP-1分泌表达,EX-4信号肽引导效率佳.
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信号肽和辅助性T细胞表位以及GST表位增强猪带绦虫保护性抗原诱导免疫应答的初步研究
目的研究信号肽和辅助性T细胞表位以及GST表位增强猪带绦虫保护性抗原诱导的免疫应答.方法在猪绦虫融合抗原pCC27(本室从六钩蚴cDNA表达文库筛选的三个保护性抗原经拼接所得)基因片段5′末端引入人IL-2信号肽、一个通用型辅助性T淋巴细胞表位,谷胱甘肽还原酶的T和B淋巴细胞表位(TGG),经pGEX4T-2表达鉴定,序列分析后构建成DNA疫苗,通过肌肉注射途径将这种DNA疫苗免疫小鼠.结果这种含辅助表位的DNA疫苗诱导的免疫应答效果明显超过对照组,对绦虫卵攻击的保护率为90%.结论构建了含绦虫融合抗原pCC27及TGG的核酸疫苗,动物试验结果表明,TGG表位既可提高IgG、IgG1、IgG2a的水平,又进一步增强Th1和Th2细胞间的平衡关系.免疫小鼠对绦虫卵的攻击具有很好的保护作用.
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肠道病原菌的三型分泌系统与侵袭
革兰氏阴性菌细菌蛋白的分泌可通过五型分泌系统完成[1~5].根据是否依赖信号肽(signal sequences,sec)的特点,可将其分为sec依赖性和sec不依赖性的.一、三型分泌系统是sec不依赖的,二、四型是sec依赖性的.通过sec依赖性分泌系统所分泌的蛋白,其N端有一信号肽序列,主要是疏水性氨基酸,可以引导蛋白穿过细胞内膜.当蛋白到达细胞周间质后,信号肽被剪切掉.二、四型分泌系统必须在细胞周间质,切除分泌蛋白的N端部分.二者的区别在于穿过细胞外膜的方式不同.二型分泌系统分泌的蛋白质穿过外膜时还需要额外一套内膜和外膜蛋白的辅助;四型分泌系统则包括一系列的自动转运子,在外膜上形成一个孔,使蛋白通过,自溶性切割,然后释放蛋白.一、三型分泌系统均没有分泌蛋白的末端氨基酸的处理过程,似乎都也没有明显的在细胞周间质停留的过程.通过一型分泌系统分泌的蛋白质的分泌信号,位于该蛋白C端60个氨基酸左右.该分泌信号似乎是分泌系统亚家族特异性的,所分泌的蛋白不容易被蛋白水解酶切割.分泌过程需要三种蛋白成分:内膜转运ATP酶、外膜蛋白和膜融合蛋白.与一型不同,三型分泌系统(type three secretion system,TTSS)分泌的蛋白末端没有可识别的分泌信号.分泌信号可能位于5'mRNA上.三型分泌系统的分泌器大约有20多个蛋白质,大多位于内膜,需要位于细胞质的膜相关性的ATPase.大部分内膜蛋白与革兰氏阳性或阴性细菌的鞭毛合成器有同源性.分泌蛋白的分泌需要附属蛋白的协助,可直接从胞浆分泌到细胞表面.需要激活信号来启动分泌.近报道了和大分子蛋白分泌相关的五型分泌系统,可能也是sec依赖性的.
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小鼠去信号肽AFP/DC疫苗体外抗肝癌免疫活性的检测
目的构建Balb/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突状细胞(DCs)中表达,观察其抗肝癌的免疫活性.方法构建AFP1cDNA和AFP2cDNA,真核表达载体,体外转染DC,制备AFP1-DC和AFP2-DC疫苗,以ELISA、MTT方法等检测其免疫活性.TUNEL法检测肝癌细胞凋亡情况.结果所构建的真核表达质粒PcDNA3.1(+)/AFP1和PCDNA3.1(+)/AFP2在小鼠树突状细胞中获得稳定高效表达,其中PcDNA3.1(+)/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)明显高于空质粒组,AFP2/DC疫苗诱导出肿瘤特异性杀伤肝癌细胞活性明显高于空质粒组.结论成功地构建了真核表达载体PcDNA3.1(+)/AFP1和PcDNA3.1(+)/AFP2,AFP2/DCS能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应,其机制可能与诱导肝癌细胞凋亡有关.
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分泌型人IL-1β表达载体的构建及在H7402细胞中的表达
目的 构建经典途径分泌型人白细胞介素1β(shIL-1β)重组表达载体,检测其在H7402肝癌细胞中的表达.方法 采用SOE方法将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和编码人白细胞介素(hIL-1β)成熟蛋白的基因序列拼接形成融合基因,与plRES2-EGFP质粒重组构建shIL-1β真核表达裁体plRES2-EGFP-shIL-1β,利用jetPEI方法将其稳定转染H7402细胞(H7402/shIL-1β),荧光显微镜及RT-PCR检测融合基因的表达水平,间接EIJSA方法测定培养上清hIL-1β分泌水平.结果 荧光显微镜下观察可见H7402/shIL-1β细胞发出明亮绿色荧光,RT-PCR检测显示pIRES2-EGFP-shIL-1β能够在H7402细胞中稳定表达融合基因mRNA,同时细胞培养上清中hIL-1β表达水平明显上升.结论 成功构建了经典途径分泌的hIL-1β重组表达栽体,该载体可在H7402细胞中稳定分泌生物活性的hIL-1β.
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血管内皮生长因子与骨肿瘤
血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor VEGF)作为一种人属二聚蛋白信号肽,能特异作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成,并可增加血管通透性[1、2].其他促血管生成因子的血管生成作用是通过增强VEGF的表达及生成来实现的[3].其作用的发挥贯穿于人类生殖、发育、组织再生和修复以及肿瘤发生等生理、病理过程,恶性肿瘤的无限制侵袭性生长,依赖持续和广泛的血管新生以保证其生长和转移,如果能抑制和破坏肿瘤及周边血管新生,就有可能阻止肿瘤的生长和转移.
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猪圆环病毒2型ORF2编码基因真核表达载体的构建及表达
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从含有PCV-2的PK-15细胞中扩增出ORF2基因,将其克隆入pSecTag2载体中,构建了pSecORF2载体.又设计一条含信号肽序列的上游引物,以pSecORF2为模板,扩增出含信号肽序列的ORF2基因,将其克隆到plREShyg载体上,构建了plRESiORF2真核表达载体.然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞,进行表达.间接免疫荧光实验(IFA)成功检测到plRESiORF2在CHO细胞中的表达.这为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.
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恶性肿瘤与Lumican的关系研究进展
基膜聚糖(Lumican)是一种蛋白聚糖,隶属于富含亮氨酸低分子蛋白聚糖(SLRP)家族[1],早在牛角膜基质中发现[2].和其他SLRP蛋白一样,Lumican在结构上主要由4个结构域组成:(1)16个氨基酸残基构成的信号肽;(2)N端结构域,包含硫化酪氨酸及二硫键;(3)用于蛋白质相互作用的亮氨酸高度重复的分子结构;(4)羧基端结构域,包含两个保守半胱氨酸残基.根据其聚糖修饰形式的不同,Lumican以核心蛋白共价连接未硫酸化的聚乙酰氨基乳糖的糖蛋白形式和核心蛋白共价连接硫酸化的硫酸角质素侧链的蛋白聚糖形式存在[3].