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可溶性CD40分子与EGFP融合基因的构建及在树突状细胞中的表达及功能鉴定
CD40与T细胞表面对应的配体CD154(CD40L)相互作用后,可以进一步刺激抗原提呈细胞,上调其CD80/CD86的表达,促进T细胞的活化[1].可溶性CD40蛋白(soluble CD40,sCD40)由CD40信号肽和胞外功能区构成,能够与膜表面CD40竞争性结合CD40L的功能区域.采用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)方法,成功地克隆了cDNA,并与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合,构建了真核表达载体pEGFP-N1/sCD40,并用脂质体法将其导入树突状细胞(DC)中进行表达,为有效利用树突状细胞诱导移植免疫耐受奠定了基础.
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人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定
目的构建人结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)重组卡介苗(BCG)疫苗.方法用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽DNA序列,从pCMV-MTHSP 65质粒中扩增出HSP65全长基因.利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG-2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65.利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中,经热诱导后,用SDS-PAG电泳来观察其表达水平.利用Western blot来检验HSP65的生物学活性.结果酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白65 DNA片段与报道结果完全一致,重组体的连接方向正确,阅读框与预期完全一致.热诱导后,重组BCG表达的65 kD(1 kD=0.992 1 ku)蛋白占菌体总蛋白的35.67 %,占裂解物上清总蛋白的74.09 %,表明重组的HSP65基因能在BCG中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在.通过Western blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合.结论成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65,重组的HSP65基因能在BCG中高效表达,表达的HSP65具有生物学活性,重组BCG疫苗构建成功.
关键词： 信号肽 人结核杆菌 热休克蛋白65 分泌型原核穿梭表达质粒 重组卡介苗 -
结核分枝杆菌ESAT-6基因重组卡介苗的构建与鉴定
目的:ESAT-6是结核分枝杆菌的一种分泌性蛋白质,具有免疫保护作用,可作为抗结核病新疫苗的候选分子.而卡介苗由于缺失ESAT-6基因,不能产生该抗原蛋白.本研究旨在构建ESAT-6基因重组卡介苗,使其表达ESAT-6抗原,从而增强其免疫原性和免疫保护性,探索将该重组卡介苗用作新型结核病疫苗的可行性.方法:分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到BCGα-抗原(α-Ag)信号肽序列和结核杆菌ESAT-6基因,将ESAT-6基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组,得到重组质粒pME.再将BCGα-Ag信号肽序列克隆至pME中,得到重组质粒pSME.后通过电穿孔法将pSME导入卡介苗中,并用抗性筛选、PCR扩增及打点杂交进行鉴定.结果:电转化后的卡介苗能在含10 mg/L卡那霉素的培养基上生长.以重组卡介苗总DNA为模板的PCR扩增得到阳性扩增带,大小与α-Ag信号肽序列加上ESAT-6基因的长度一致.打点杂交中探针与重组卡介苗显示阳性信号.结论:基因重组卡介苗构建成功,并有望分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT-6.该重组卡介苗既保留了卡介苗中原有的抗原,又增添了新的保护性抗原,且这种抗原可被广泛识别,能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆,因此ESAT-6重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力.本研究为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础.
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PTP抑制剂对VacA空泡活性的影响
近期在VacA的研究中发现,该毒素对多种生长因子(尤其是EGF)作用于胃粘膜上皮细胞的信号转导通路有显著影响,VacA对EGF诱导的受体蛋白酪氨酸激酶(receptor protin-tyrosine kinase,RPTK)自身磷酸化及随后一系列的信号转导过程有明显的抑制作用.国外学者已初步分离并克隆出胃癌细胞株膜表面的VacA受体,分子量大小约250kDa,氨基酸序列同源性分析显示该受体属于受体蛋白酪酸磷酸酶家族(receptor protin-tyrosine phosphatase,RPTP),RPTPT是细胞信号转导过程中与RPTK相拮抗的一类具有酶活性的受体,可导致多种信号肽的去磷酸化,从而减弱EGF等生长因子对胃粘膜上皮细胞增殖、修复的促进作用.
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分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri对小鼠B16黑色素瘤生长的抑制作用
背景与目的:已有研究表明从人胎盘中提取纯化的人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor,hRI)对小鼠某些实体肿瘤的生长具有明显的抑制作用.本研究的目的是构建分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri,并观察其对小鼠B16黑色素瘤生长的抑制作用.方法:将合成的小鼠IgG信号肽碱基序列与hRl基因序列连接后,重组到逆转录病毒载体V-pLNCX 上构建分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri.将PA137细胞用于病毒包装,NIH3T3细胞用于测定病毒滴度.采用RT-PCR和Western blot法检测hRI基因的表达.构建小鼠荷B16黑色素瘤模型,注射V-pLNCX-s-hri,同时用生理盐水、V-pLNCX和V-pLNCX-hri作为对照.用肿瘤组织重和微血管密度来评价V-pLNCX-s-hri对小鼠B16黑素瘤生长的抑制作用.采用ELISA方法测定B16细胞培养上清和小鼠血清中RI含量.结果:V-pLNCX-s-hri对培养的B16细胞的感染效率为38.5%.在感染V-pLNCX-s-hri后的B16细胞中检测到RI mRNA和蛋白的表达.感染后的B16细胞的培养上清中hRl的含量为0.228μg/mL.V-pLNCX-s-hri组小鼠外周血中RI的含量为0.249 μg/mL.明显高于生理盐水组、V-pLNCX组和V-pLNCX-hri组的0.035 μg/mL、0.028 μg/mL和0.169 μg/mL(P值均<0.01).生理盐水组、V-pLNCX组和V-pLNCX-hri组小鼠的瘤组织重分别为(1.90±1.12)g、(1.77±0.21)g和(1.10±0.46)g,显微镜下每10个视野的微血管平均数分别为89±6、87±7和41±8;而V-pLNCX-s-hri组的瘤组织重为(0.82±0.34)g.血管平均数为34±4.V-pLNCX-s-hri组与各对照组相比,其瘤组织重和血管数量的差异都有统计学意义(P值均<0.01).结论:构建的分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri能对B16细胞进行有效的感染,且在感染的B16细胞中分泌性高表达.V-pLNCX-s-hri对小鼠B16黑色素瘤的生长有明显的抑制作用,且效果优于V-pLNCX-hri.
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小鼠AFPcDNA真核表达载体的构建、表达及体外抗肝癌免疫活性的检测
背景与目的:探索肝癌细胞的突变基因产物--具有潜在抗原性的异常蛋白质而无法形成有效免疫原的机理,寻找肝癌的特异性抗原,并在此基础上研制出治疗肝癌的DNA疫苗将对肝癌的免疫学治疗产生积极的影响.本实验构建BALB/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突细胞(dendritic cells,DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用.方法:采用RT-PCR方法自小鼠肝癌细胞株H22中扩增出具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA,将该基因定向插入真核表达载体PEGF-N3中;同时培养经rmGM-CSF、rmIL-4诱导的小鼠骨髓细胞,体外获取大量DCs,脂质体转染PEGF-N3/AFPi、PEGF-N3/AFP2至DCs进行表达、鉴定.将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,ELISA方法测定脾细胞γ-干扰素(IFN-γ)分泌活性,51Cr释放法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤活性.结果:从H22中克隆到AFP1cDNA和AFP2 cDNA,经测序完全正确,所构建的真核表达质粒PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2在小鼠DCs中获得稳定高效表达,其中PEGF-N3/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)为5.12±1.46,明显高于空质粒组(1.42±0.73).AFP2/DC疫苗对H22细胞的特异性杀伤活性[(88.15±16.47)%]明显高于空质粒组[(12.72±5.45)%].结论:成功地构建了真核表达载体PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的PEGF-N3/AFP2转染的DC,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应.其机制可能为诱导肝癌细胞凋亡.
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C99引导淀粉样蛋白前体裂解过程的活体细胞研究
目的 构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统,研究淀粉样蛋白前体(APP)酶解过程.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)得到编码Flemish突变的APP后300个碱基片段(C99)、蓝色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白碱基序列(YFP),生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54 bp),利用基因工程技术将CFP、54 bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切、PCR、测序鉴定终得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54 bp-YFP-C99,并将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达;检测荧光共振能量转移(FRET),以及进行β淀粉样蛋白(Aβ)免疫细胞化学染色.结果 (1)基因序列分析证明重组质粒构建成功.(2)利用激光共聚焦显微镜观察转染细胞,发现融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光.(3)FRET检测发现CFP-54bp-YFP-C99可以发生β和γ裂解产生Aβ,沉积在细胞内、胞膜上以及细胞间隙;CFP-54bp-YFP不能发生β裂解.(4)免疫细胞化学染色证实Aβ在细胞膜、胞浆内以及细胞间隙聚集沉积.结论 (1)重组质粒能够完成APP的有序裂解产生Aβ.(2)成功实现在活体细胞中观察APP裂解.(3)Aβ有可能产生于APP由胞浆至胞膜的运输过程中.(4)C99对于APP被裂解有重要意义,可能起到信号肽样的引导定位作用.
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信号肽生物信息学分析在Neurospora crassa phyA基因鉴定中的应用
目的 对Neurospom crassa基因组中与黑曲霉phyA具有46.85%相似性的EAA33149.1蛋白基因进行鉴定并确定其功能.方法 利片j信号肽预测软件SignalP 3.0 Server,真核蛋白序列中精氨酸和赖氮酸前导肽切割位点以及信号肽切割位点预测软件PmP 1.0 server,跨膜结构域预测软件Tmpred和TMHMM Server v.2.0,GP I锚定位点预测软件big-P I Predictot以及哑细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1.01对EAA33149.1蛋白基因进行预测分析,根据分析结果将该基冈克隆到酿酒酵母中表达.结果 确定了该蛋白的信号肽、信号肽切割位点以及分泌途径.重组酿酒酵母表达的54 000重组蛋白,显示了植酸酶活性.结论 初步确定该蛋白基因为N.crassaphyA基因.
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信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达
目的构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体,为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据.方法采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体,用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞,观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达.结果DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确;酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确,TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上.结论所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的,pECFP-Cl-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上,可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究.
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bFGF在原代培养人皮肤成纤维细胞中的高效分泌表达
目的:提高碱性成纤维细胞生长因子在原代培养的成纤维细胞中的分泌表达.方法:bFGF缺乏典型的分泌信号肽,将鼠抗体轻链基因Igκ的信号肽序列引入该基因的5′端得到新的Igκ-bFGF重组体基因.同时考虑到人源细胞氨基酸编码密码子的偏好性,对整个基因序列密码子的第3位摇摆碱基作了偏好性调整,并克隆入真核表达载体中.得到的重组质粒用酶切的方法线性化,尽量去除质粒载体上大肠杆菌起源的基因序列,然后通过电穿孔的方法将线性质粒转导入原代培养的人皮肤成纤维细胞.结果:与野生型的bFGF基因相比,嵌合体bFGF被大量分泌到培养基中,同时对于成纤维细胞的增殖有明显的促进作用.结论:这种嵌合体基因的构建可以明显提高成纤维细胞对bFGF的分泌表达.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 成纤维细胞 信号肽 -
优化重组人C-反应蛋白在酵母中的分泌表达
目的:通过优化引导蛋白分泌的信号肽(signal peptide,SP),构建高效分泌表达具有免疫活性的重组人C-反应蛋白(recombinant human C-reactive protein,rhCRP)的毕赤酵母菌株.方法:通过重叠PCR和DNA重组技术,分别将信号肽MFα SP、CRN SP、SUC2 SP和MFα-op SP的基因重组到rhCRP基因的5’端后克隆到毕赤酵母表达载体上,获得的4种重组质粒分别重组到毕赤酵母菌X-33中进行甲醇诱导分泌表达,Western blot法鉴定蛋白分泌情况;利用HisTrap HP柱纯化rhCRP后用间接ELISA法鉴定其免疫反应性.结果:成功构建了4种重组质粒.4种SP能引导表达出大小约为23 kD的rhCRP,其中MFα SP引导rhCRP分泌的量约为另外3种信号肽的3～12倍.间接ELISA检测表明,纯化的rhCRP具有特异的免疫反应性.结论:成功筛选出了高效分泌表达rhCRP的重组毕赤酵母菌株并表达、纯化得到具有免疫反应性的rhCRP,为rhCRP相关的进一步临床及基础研究奠定了基础.
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将大肠杆菌OmpA信号肽改造成为抗菌肽的研究
目的 探讨将大肠杆菌OmpA信号肽改造成抗菌肽的方法以及衍生肽的杀菌活性.方法 以由21个氨基酸残基组成的大肠杆菌OmpA信号肽(P-AQA)为模板,通过改变其C末端的氨基酸组成,分别合成衍生多肽:(MKKTAIAIAVALAGFARVRQK,P-RQK)、(MKKTAIAIAVALAGFARRKKK,P-KKK)、(MKKTAIAIAVALAGFAD VDQD,P-DQD) .采用琼脂铺板计数法测定以上3条衍生多肽及肠杆菌OmpA信号肽对革兰阳性菌(G+)(金黄色葡萄球菌)和革兰阴性菌(G-)(大肠杆菌)的杀菌活性.结果 天然信号肽P-AQA不溶解水,无杀菌活性;在信号肽C末端加入酸性氨基酸的衍生肽P-DQD 对G+菌和G-菌均无杀菌作用;其余两条在末端加入碱性氨基酸的多肽对G+菌和G-菌均有较强的杀菌作用,其中末端带有5个碱性氨基酸的多肽(P-KKK)其杀菌活性强于有3个碱性氨基酸的多肽(P-RQK)5倍.结论 将大肠杆菌OmpA信号肽C末端中的中性氨基酸替换为碱性氨基酸后,具有明显的杀菌活性,其杀菌活性可能与碱性氨基酸的数量有关.
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哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽预测及保守性分析
目的 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)由一紧密连锁、高度多态的基因座组成,在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答和免疫调控等方面发挥极其重要的作用.MHCⅠ类分子由α链和β微球蛋白以非共价键结合组成,其中α链直接参与抗原肽的呈递,显示极为丰富的多态性.本研究旨在分析哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽是否呈现出多态性,并明确其分子生物学特征.方法 利用NCBI网站收集人等8种哺乳动物编码MHC Ⅰ类分子α链的mRNA序列,采用信号肽在线预测软件SignalP 4.1和LipoP1.0分析α链信号肽存在的概率、长度及信号肽酶切位点;利用Mega4.1软件进行信号肽氨基酸序列比对,分析其保守性.结果 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链N端的前24个氨基酸均为其信号肽区,信号肽酶切位点全部属于信号肽酶Ⅰ型,且信号肽酶切位点的-3、-1、1、2、3位置上的氨基酸非常保守,是信号肽酶识别的关键位点.氨基酸序列比对分析发现α链信号肽24个氨基酸中有13个位点的氨基酸相同,占信号肽氨基酸总数的54.17％.结论 8种哺乳动物MHC Ⅰ类分子α链的信号肽具有较强的保守性,这可能与信号肽指导蛋白质分选和蛋白质定位的功能相关.
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基质金属蛋白酶与左室重构
心肌胶原基质对维持心肌细胞的排列、协调心肌收缩性及维持左室几何形态起重要作用。左室胶原基质的变化是引起慢性充血性心力衰竭(CHF)左室扩大及心肌重构的主要因素之一。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组能特异地降解细胞外基质(ECM)成分的锌(Zn2＋)依赖的酶家族，在组织重构中起重要作用。近，研究发现在许多心血管疾病中存在MMPs表达谱的改变。CHF左室重构也存在MMPs表达及活性的改变。 MMPs的分子结构主要包括三个区域：前肽、催化区及C-末端区。MMP前肽序列包含一个小信号肽，直接引导合成的MMP到细胞膜分泌至ECM。催化区包含三个组氨酸，是Zn2＋结合部位，对维持酶活性具有重要意义。另外，MMP抑制剂发挥作用必须与催化区相结合。各种MMPs的C-末端有所不同，与酶的特异性有关。
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人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体的构建
目的:构建人肥大细胞羧肽酶(hMC-CP)分泌型真核表达载体pcDNA3.1/CP.方法:用免疫球蛋白k链的信号肽序列置换hMC-CP自身的信号肽序列,设计并合成引物,以hMC-CP基因为模板,扩增带有分泌信号肽的hMC-CP基因,DNA测序鉴定正确后,将PCR扩增产物定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过酶切和DNA测序进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增出一条特异条带,酶切鉴定和序列测定结果表明大小为1269bp的DNA片段插入表达载体.结论:成功构建了hMC-CP分泌型真核表达载体,为进一步制备真核表达的重组hMC-CP奠定了基础.
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金属蛋白酶多抗原表位DNA疫苗诱导免疫应答的研究
目的:研究信号肽在真核表达系统中对金属蛋白酶多抗原表位DNA疫苗诱导小鼠免疫应答影响.方法:人工合成含有金属蛋白酶多个抗原表位的DNA序列,将连接信号肽与不连接信号肽的该序列分别连接plRESneo表达载体,构建的2种质粒免疫小鼠,ELISA法、出血中和法检测免疫后效价.结果:2种质粒诱导小鼠产生的抗体效价10(-2)为阳性,均能有效减轻金属蛋白酶,引起的出血.结论:信号肽的有无对金属蛋白酶DNA疫苗在小鼠体内表达没有影响.
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信号肽与猪链球菌GDH融合的DNA疫苗构建及体液免疫研究
目的 设计、构建猪链球菌GDH真核表达载体并研究DNA疫苗免疫小鼠的体液免疫.方法 在猪链球菌保护性抗原GDH基因5'末端引入人IL-2信号肽序列,通过PCR进行拼接,得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3.0,构建核酸疫苗重组质粒pcDNA3.0-gdh.通过肌肉注射途径将重组质粒pcDNA3.0-gdh免疫小鼠,经ELASA实验和Western blot进行检验.结果 构建的表达载体在小鼠体内表达出正确的目的 蛋白,能诱导体液免疫.结论 构建的DNA疫苗能够引起体液免疫,为研究猪链球菌核酸疫苗提供分子工具.
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核定位信号肽偶联核激酶底物短肽修饰壳聚糖介导微小RNA-140对兔关节软骨细胞作用的研究
目的 探讨核定位信号肽偶联核激酶底物短肽(nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide,NNS)修饰壳聚糖(chitosan,CS) (NNSCS),介导人微小RNA-140 (microRNA-140,miR-140)基因转染,对体外培养的兔关节软骨细胞的作用.方法将重组质粒GV268-miR-140和空质粒GV268分别与NNSCS复合形成NNSCS/pDNA纳米复合物.取新生新西兰大耳白兔膝关节软骨,采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法分离培养原代软骨细胞.取第2代软骨细胞分为3组:正常细胞对照组(A组)、NNSCS/GV268空质粒转染组(B组)、NNSCS/GV268-miR-140转染组(C组),B、C组细胞分别以NNSCS/GV268及NNSCS/GV268-miR-140纳米复合物瞬时转染.转染后,实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)检测外源miR-140的表达;Annexin V-FITC/PI双染色法及MTT法分别检测外源miR-140对软骨细胞凋亡及增殖活力的影响;RT-qPCR检测软骨细胞中Sox9、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase4,Hdac4)基因表达.结果RT-qPCR检测示,C组外源miR-140表达水平较A、B组明显上调(P＜0.05).与A、B组比较,C组软骨细胞凋亡率明显降低,细胞增殖活力明显增加,细胞内Sox9、Aggrecan基因相对表达量明显上调、Hdac4基因相对表达量明显下调(P＜0.05);A、B组间以上指标比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论NNSCS可携带外源基因进入软骨细胞并高效表达,高表达的miR-140能提高体外培养软骨细胞的生物活性,为其用于治疗软骨损伤性疾病提供了实验依据.
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TRAIL选择性诱导细胞凋亡的作用机理及意义
TNF为一庞大的家族，到目前为止发现的TNF家族成员主要有：TNFα、TNFβ、LTα、LTβ、CD30L、CD27L、CD40L Fas、OX-40L、4-IBBL，以及TRANCE(TNF-Related Activation-Induced Cytokine)和TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)等。其中TRANCE和TRAIL是新近发现的TNF家族成员。大多数TNF家族成员为II型跨膜蛋白质，即C末端在胞外区，且C末端有一同源三聚体。TNF家族成员具有多种多样的生物学功能，如具有细胞毒性及抗病毒活性，并参与免疫应答和免疫调节等。在这些功能中，有的是通过TNF成员诱导凋亡来实现的，如TNF就是通过诱导B细胞、CD＋４T细胞、CD＋８T细胞的凋亡来发挥其免疫应答和免疫调节作用的。TRAIL是新近几年发现的TNF家族成员之一。它也可以引起细胞凋亡，而且它引起的凋亡具有选择性，主要引起肿瘤细胞的凋亡，而不影响正常体细胞的生长分化。本文拟就其在诱导细胞凋亡中的作用机制和意义作一综述。1 通过受体途径实现其选择性诱导细胞凋亡的作用1.1 TFAIL［1］ TRAIL又称Apo-2L(Apoptosis-2 Ligand)，1996年由Pitti RM等人首先分离和鉴定。它含有281个氨基酸残基，分子量为32.5KD，等电点为7.63，在传染的细胞株中以II型跨膜蛋白的形式表达在细胞的表面，其胞外区(C末端)有一同源三聚体的亚单位结构，可水解形成可溶性TRAIL，可溶性的TRAIL缺少跨膜区和胞内区，N末端无信号肽结构。TRAIL与其它TNF家族成员具有较高的同源性，其同源性为：Fas23%、CD40L 20.8%、TLα 20.2%、LTβ 19.6%、TNF 10%、CD30L、CD27L各15.5%、OX-40L 14.3%、4-IBBL 13.7%)，并在许多正常组织中均有表达。体外实验表明，TRAIL在体外可存在各种来源的细胞株，如婴儿的肝、肾、肺；成人的脾、淋巴结、小肠、结肠、前列腺等。另外在T淋巴细胞、NK细胞等表面都存在着TRAIL。当然，在不同的肿瘤组织中均有TRAIL表达。但为什么TRAIL可以诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞的生长分化却没有影响呢?［2］这与TRAIL的受体分布有关。1.2 TRAILR(TRAIL Receptor) 目前发现的TRAILR共有四种：TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3和TRAILR4。其中TRAILR1和TRAILR2因含有死亡结构域(Death Domain DD)而分别被称为死亡受体4(Death Receptor4)和死亡受体5(Death Receptor5)，目前研究比较清楚的死亡受体还有DR3为一细胞因子受体，分布于富含淋巴细胞的组织和器官中，表现出诱导细胞凋亡和激活转录因子NFkB两种生物活性。TRAILR3又称诱捕受体1(Decoy Receptor1)，TRAILR4又称诱捕受体2(Decoy Receptor2)。 TRAILR1［3］由468个aa组成，其N端具有信号肽结构。胞外区含有两个半胱氨酸丰富的重复区，胞内区含有死亡结构域，这是一个由77个aa组成的功能区，与TNFR1、DR3和FAS的死亡功能区具有较高的同源性。TRAILR1中死亡功能区的氨基酸序列相对保守。它在正常组织如脾，外周血白细胞、小肠、甲状腺、活化的T细胞等以及肿瘤组织中均有表达。TRAILR1可以选择性地结合TRAIL，同时有实验表明，过度表达的TRAILR1能够不依赖相应配体而直接诱导细胞的凋亡。 TRAILR2［4-7］含有411个氨基酸，为I型跨膜糖蛋白结构。与TRAILR1相似，其N端为信号肽，胞外区也存在两个富含半胱氨酸的重复区，胞内为死亡结构域，与TRAIL-R1有很高的同源性，它在MCF7细胞和Hela细胞中过度表达能诱导这些细胞凋亡。其诱导凋亡作用可以被Caspase的抑制剂CrmA和2-VAD-fmk抑制，提示它可能通过激活Caspase家族引起凋亡。 TRAILR3［6］由259个aa组成，其显著的结构特点是没有胞内区即不含有死亡功能区，而只有信号肽、含有两个半胱氨酸丰富的重复区的胞外区以及跨膜区，实验表明它与TRAIL的亲合力与TRAILR1和TRAILR2相近，可溶性的TRAILR3能够抑制TRAIL诱导的凋亡，当其过度表达时则不能在体外诱导细胞的凋亡。该受体在人的正常组织分布广泛，常分布于心脏、肺、肝、肾、骨髓、脾、胎盘中而多数癌细胞上则不存在该受体。 TRAILR4［8，9］由386个氨基酸组成，胞外功能区与其它3个TRAIL受体具有高度同源性，可达58%左右。其C末端的胞内仅含有死亡功能区的1/3，故与TRAIL结合之后不能介导凋亡，而有实验表明其有抑制TRAILR1和TRAILR2介导的凋亡的作用。TRAILR4在许多正常组织具有表达而在许多肿瘤组织中表达缺如。1.3 TNF受体结合蛋白FADD(TNFR1 Associated Death Domain Protein)［10］ FADD又称MORT-1，它含有208个氨基酸残基，分子量23kD，其C端含有一个死亡结构域，它可以通过这一死亡结构域与TRAILR1和TRAIL受体的死亡结构域相互识别和结合。在其N端含有一个特异的结构域，该结构域称为MORT结构域或死亡效应结构域，通过它可以和ICE/CED3蛋白酶家族的新成员——MACH/FLICE(caspase 8)［11-13］结合，从而诱导细胞凋亡。研究表明MORT结构域具有转导细胞凋亡信号的作用。1.4 TRAIL受体途径诱导肿瘤细胞凋亡的机理 TRAIL的生物学效应是通过与结合于细胞膜上的相应受体而产生的。TRAILR与TRAIL结合后常形成形成寡聚体(多为三聚体)，这种寡聚体可使胞浆内的死亡功能区彼此靠近、聚集，从而诱使胞浆内的Caspase级联式反应发生。Walczak henning等人的实验表明：TRAILR是通过FADD来传递信号的，其可能机制是：被激活的TRAILR通过死亡结构域之间的相互识别和作用与FADD结合，FADD再通过它的MORT结构域同MACH/FLICE(caspase8)结合，从而激活caspase8的ICE/CED3蛋白活性，后者再激活其它的ICE/CED3蛋白酶。此外，FADD的表达尚可引起神经酰胺［14］浓度的升高，后者可以作为第二信使传递信号，起到激活CED-3/ICE样蛋白激酶CPP32的作用。 对正常的组织细胞而言，在表达TRAILR1和TRAILR2的同时也表达TRAIL3和TRAILR4，由于RAILR3没有死亡功能区所以不能诱导细胞凋亡；TRAILR4的死亡功能区不完整，所以也不能诱导细胞凋亡，实验表明二者还能抑制TRAILR1和TRAILR2诱导的凋亡，因而TRAIL对正常的组织细胞没有明显的损伤作用。而在肿瘤细胞中，TRAILR3和TRAILR4则常常缺乏表达，所以容易出现凋亡。这种死亡受体和诱捕受体表达上的差异性正是导致肿瘤细胞凋亡，而正常细胞受诱捕受体的保护免遭凋亡的原因。
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一种基于OmpA的分泌型原核表达载体的构建及应用
目的 构建大肠杆菌周质分泌型表达载体并验证其表达效果.方法 以pUC18-lpp为基础载体,构建含有核糖体结合元件(RBS)、信号肽(OmpA)、多克隆位点(MCS)的分泌型表达载体pUC-OmpA;通过分子克隆获得含有密码子优化的人生长激素(hGH)编码序列的pUC-OmpA-hGH,转化大肠杆菌JM109菌株并验证周质分泌性质.结果 经IPTG诱导后,SDS-PAGE、Western印迹分析结果显示周质空间有hGH重组表达产物,分子量约为22 kD,大小与预期一致,周质hGH约占菌体总hGH的43％.结论 成功构建了基于OmpA信号肽的周质分泌型表达系统,为实现生物活性蛋白的原核表达奠定了基础.
