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肠道病原菌的三型分泌系统与侵袭
革兰氏阴性菌细菌蛋白的分泌可通过五型分泌系统完成[1～5].根据是否依赖信号肽(signal sequences,sec)的特点,可将其分为sec依赖性和sec不依赖性的.一、三型分泌系统是sec不依赖的,二、四型是sec依赖性的.通过sec依赖性分泌系统所分泌的蛋白,其N端有一信号肽序列,主要是疏水性氨基酸,可以引导蛋白穿过细胞内膜.当蛋白到达细胞周间质后,信号肽被剪切掉.二、四型分泌系统必须在细胞周间质,切除分泌蛋白的N端部分.二者的区别在于穿过细胞外膜的方式不同.二型分泌系统分泌的蛋白质穿过外膜时还需要额外一套内膜和外膜蛋白的辅助;四型分泌系统则包括一系列的自动转运子,在外膜上形成一个孔,使蛋白通过,自溶性切割,然后释放蛋白.一、三型分泌系统均没有分泌蛋白的末端氨基酸的处理过程,似乎都也没有明显的在细胞周间质停留的过程.通过一型分泌系统分泌的蛋白质的分泌信号,位于该蛋白C端60个氨基酸左右.该分泌信号似乎是分泌系统亚家族特异性的,所分泌的蛋白不容易被蛋白水解酶切割.分泌过程需要三种蛋白成分:内膜转运ATP酶、外膜蛋白和膜融合蛋白.与一型不同,三型分泌系统(type three secretion system,TTSS)分泌的蛋白末端没有可识别的分泌信号.分泌信号可能位于5'mRNA上.三型分泌系统的分泌器大约有20多个蛋白质,大多位于内膜,需要位于细胞质的膜相关性的ATPase.大部分内膜蛋白与革兰氏阳性或阴性细菌的鞭毛合成器有同源性.分泌蛋白的分泌需要附属蛋白的协助,可直接从胞浆分泌到细胞表面.需要激活信号来启动分泌.近报道了和大分子蛋白分泌相关的五型分泌系统,可能也是sec依赖性的.
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GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定
目的 获得融合TAT短肽的融合蛋白GS-TA-GFP,以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理.方法 以质粒pGEX-GFP为模板,扩增目的 基因TAT-GFP,将其克隆至质粒pGEX-2T,用所构建的质粒pGEXTAT-GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达,利用GS-4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot 及细胞跨膜实验鉴定.结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54.3 kD的蛋白,其相对分子质量与GST-TAT-GFP融合蛋白相符;Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别;细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402.结论 在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GS-TAT-GFP融合蛋白.
关键词： 膜融合蛋白 GST-TAT-GFP 基因表达 -
表达GP64的重组HaSNPV的构建研究
杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白,组Ⅰ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64,而组Ⅱ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F.本文以组Ⅱ类型的HaSNPV为研究对象,研究组Ⅰ类病毒的GP64能否在组Ⅱ类病毒中正确表达和包装.利用Bac-to-Bac系统,构建了带有AcMNPV膜融合蛋白GP64和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64+egfp+,同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒HaSNPVegfp+,通过对HaSNPVgp64+egfp+感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测,证明GP64可在HzAM1中表达,并被包装入子代BV.
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杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展
杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.
