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猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列,设计两对特异性引物,用PCR方法从接种疑似PMWS仔猪病料的细胞中分段扩增2个分离毒株全基因组.将扩增片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒.对质粒中的插入片段进行测序拼接,获得2株均为1 768bp的全基因组序列.应用DNA star序列分析软件,对所测PCV-2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行同源性比较,并绘制系统发生树,结果发现:所测两毒株之间的核苷酸序列同源性极高,可达99.8%,亲缘关系密切;与PCV-2参考毒株的同源性介于95.3%～99.7%之间,其中与美国的一株PCV-2同源性高,分别为99.5%和99.7%,亲缘关系很近;与国内两分离株同源性分别为96.4%和98.8%～98.9%;与PCV-1参考毒株同源性仅为77.1%～77.5%.
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288株猪圆环病毒的序列比较及遗传进化分析
目的 为进一步了解猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)的遗传进化规律,为该病的预防和控制奠定基础.方法 对来自世界各国的26株PCV1和262株PCV2的全序列用生物软件进行了核苷酸的同源性比较,并对其ORF1和ORF2进行了核苷酸和推导氨基酸的比较.结果 从核苷酸水平来看,PCV1与PCV2明显分为两支,PCV1间分布没有规律,而PCV2间又分为以来自美国、加拿大、澳大利亚的序列为代表的亚型Ⅰ和以来自法国和新西兰的序列为代表的亚型Ⅱ;但从氨基酸水平来看,其分型并没有规律可循.从遗传进化树可以看出,PCV2的分布并没有地域性和时限性.数据统计显示,尽管相隔近十年之久,但其同源性并没有发生太大的改变,可见PCV2相当保守.另外对PCV2的碱基和氨基酸突变位点进行统计发现,PCV2序列间更倾向于碱基的颠换,但并无单个碱基和氨基酸的偏好性.结论 PCV2相对保守,地域性和时限性分布不明显.
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猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白的原核表达、纯化和鉴定
目的 对猪圆环病毒 (Porcine circovirus, PCV) Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析, 构建Cap表达多表位的原核表达系统, 并对表达的目的蛋白进行分析, 为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础.方法 设计并合成PCV2Cap基因, 与PET-28a (+) 载体连接后并转入大肠杆菌BL21 (DE3) 中构建重组质粒PET-28 (a) -Cap, 对重组质粒进行诱导表达获得重组蛋白, 通过His亲和层析柱对重组蛋白进行纯化.结果 重组质粒在大肠杆菌中成功表达, 蛋白质分子量约为17.4 k Da, 与预期相符;Western blot结果显示, 重组蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清发生特异性结合.结论 PCV2 Cap蛋白的表达纯化为圆环病毒血清抗体诊断方法的建立, 进而为养殖场有效监控猪圆环病毒的免疫保护情况奠定基础.
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猪圆环病毒2型Cap基因的原核表达及ELISA检测方法的建立
目的:方法:为建立PCV-2 ELISA检测方法.利用PCR技术从PCV-2基因组中克隆Cap抗原表位基因,并将其插入到载体pET-22b(+)中,构建成原核表达质粒pET-22b(+)-Cap,使其在E.coli BL21(DE3)中以IPTG诱导表达并进行纯化,以表达的蛋白进行包被,建立ELISA检测方法.结果:表达产物分子质量约30 kD,经Western blot表明具有良好的免疫活性,对643份猪血清进行检测,阳性率为73.1%,阴性率为26.9%.结论:该检测方法能在临床中进行应用.
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人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证
目的 建立人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证.方法 参照GenBank中登录的PCV1(KC447455)和PCV2(AY578327)序列,全基因组合成PCV1和PCV2基因序列,以合成的PCV1和PCV2全基因组序列DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR反应中的退火温度进行优化.对优化后的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测疫苗生产用细胞KMB17、Vero工作种子批、脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)收获液、冻干甲型肝炎减毒活疫苗(freeze-dried hepatitis A vaccine,fHAV)成品、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗收获液及成品、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine prepared with Sabin strain,SIPV)收获液及成品的PCV1和PCV2.结果 优化后的退火温度为63℃,建立的PCR方法低可检测出10-1 fg/μL的目的基因,仅对PCV基因组DNA能扩增出特异性条带.用该方法检测生产用细胞KMB17及Vero工作种子批、OPV收获液、fHAV成品、EV71灭活疫苗收获液及成品、SIPV收获液及成品,均未检出PCV1和PCV2.结论 成功建立了生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够用于本所生物制品生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV污染的检测,从而提高生物制品的安全性.
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PRRSV人工单独感染及其与PCV2人工联合感染的病理学比较
目的比较猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和断奶仔猪多系统萎缩综合征(PMWS)的病理学变化.方法用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染了2头3周龄仔猪,同时设立了3头健康对照猪.在攻毒前后分别于耳缘静脉采血,用HerdChek IDEXX Kit测其血清抗体.PRRSV和PCV2联合感染猪分别在感染后1周、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1周、2周和3周剖杀.剖杀后采集肺、脾、扁桃体和腹股沟淋巴结,用甲醛溶液固定,组织石蜡切片以观察显微病理变化.结果剖检结果和石蜡切片结果均显示了试验猪在攻毒后发生程度不一的间质性肺炎及相应的显微病变.结论 PRRSV和PCV2联合感染引起的病变比PRRSV单独感染要严重.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒 病理变化 -
猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达
为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.
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猪圆环病毒2型ORF2编码基因真核表达载体的构建及表达
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从含有PCV-2的PK-15细胞中扩增出ORF2基因,将其克隆入pSecTag2载体中,构建了pSecORF2载体.又设计一条含信号肽序列的上游引物,以pSecORF2为模板,扩增出含信号肽序列的ORF2基因,将其克隆到plREShyg载体上,构建了plRESiORF2真核表达载体.然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞,进行表达.间接免疫荧光实验(IFA)成功检测到plRESiORF2在CHO细胞中的表达.这为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.
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猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2全基因(702bp).将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%～98 6%和92.3%～96.6%.重组质粒pTORF2经BamH I、EcoR V双酶切,回收ORF2基因,转移入真核表达载体pSec-Tag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2.此重组表达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.
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猪圆环病毒研究进展
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为无囊膜的单股环状负链DNA病毒,病毒粒子直径约17～20nm,是迄今已知小的动物病毒之一.PCV属圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员[1].
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异种移植中预防传染性病原体传播的研究进展
异种移植中采用猪的细胞、组织和器官可能导致猪传染性病原体的转移,进而感染人受体,甚至引发人畜共患的疾病.为防止此情况发生,应对供体动物进行广泛的微生物筛选,包括细菌、病毒、真菌和其他微生物.在进行移植之前,供体猪可进行长时间的筛选,故异种移植将比同种异体移植变得更为安全.通过实施剖腹产、接种疫苗等策略可以筛选出不转移不传播微生物的供体动物.猪内源性逆转录病毒(PERV),整合于所有猪的基因组中,上述方法不能清除PERV,因此需选择病毒低表达的猪或构建PERV表达抑制的基因修饰猪.
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猪圆环病毒疫苗研究进展
猪圆环病毒主要侵害断奶仔猪和育肥猪,可以引起多种猪圆环病毒相关性疾病,养猪业的健康发展带来巨大威胁.本文结合国内外对猪圆环病毒疫苗的研究结果,对其研究进展进行了综合论述,并对新型猪圆环病毒疫苗的研究作了展望,为有效防控该病提供参考.
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猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立
设计合成2对PCV型特异性引物,其中C1、C2扩增PCV1和PCV2共有的938bp特异性片段,C3、C4只扩增PCV2特异性的490bp片段.在对该多重PCR的反应条件进行优化后,建立了猪圆环病毒多重PCR诊断方法,既可对PCV进行定性检测,又可对PCV1和PCV2进行定型,便于口岸检疫和养殖场的临床诊断.
