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幽门螺杆菌空泡毒素基因克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定
已发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)疫苗具有预防和治疗Hp感染的效果[1].大多数Hp菌株均能产生空泡毒素(vacuolating cytotoxin, vacA),其前体蛋白在分泌过程中只有相对分子质量(Mr)约87×103的VacA被转运到细胞外,Mr为4×103氨基末端信号肽和50×103羧基末端多肽分别留于细菌内、外膜中[2].Hp感染者血清中可出现VacA抗体,重组VacA在Hp SS1株小鼠感染模型中有80%的保护率[3].我们构建了vacA原核表达系统,所表达的重组VacA可作为Hp基因工程疫苗的候选抗原.
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日本血吸虫感染小鼠脾细胞IFN-γ、IL-4和IL-10动态变化
血吸虫病在世界范围内影响广泛,随病程迁延,虫卵沉积会导致组织病变,主要表现为肉芽肿形成,进而纤维化.曼氏血吸虫感染早期主要是Th1为主的细胞免疫,IL-2和IFN-γ水平升高,临床表现为急性期反应;产卵后宿主体内的免疫反应由Th1型转变为Th2型为主的体液免疫,以IL-4、IL-5等细胞因子升高为特点[1],在肉芽肿形成和纤维化过程中起着重要作用[2].IL-10虽然被视为Th2效应因子,但研究发现IL-10对Th1和Th2反应都有重要的调控作用,影响疾病的发展和转归[3].本实验通过建立小鼠感染模型,研究在我国主要流行的日本血吸虫感染不同阶段小鼠脾细胞中Th1/Th2以及IL-10的变化.
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沿海某地霍利斯弧菌伤口感染能力研究
由于人们对海洋资源越来越关注,因此有必要对海洋中优势菌的致病能力进行研究.本研究通过建立小鼠感染模型,探讨沿海某地海水中霍利斯弧菌毒力的强弱,以及对伤口感染的能力.
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表达ureB/hlyE融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌预防幽门螺旋杆菌感染
目的:建立表达幽门螺杆菌(H pylorr)尿素酶B亚单位(UreB)与血溶素E(hlyE)融合蛋白的减毒沙门疫苗菌,并利用H pylori小鼠感染模型,研究该疫苗菌对H pylori感染的免疫保护作用.方法:利用分子克隆技术构建携带ureB/hlyE融合基因的重组原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GeneBank中相关序列进行同源性比较.pTrc99A-ureB/hlyE转化减毒伤寒沙门菌SL3261,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定.表达的UreB/hlyE融合蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blotting进行鉴定,薄层扫描分析蛋白含量.实验小鼠随机分成4组,分别灌胃给予生理盐水组、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261组、携带pTrc99A-ureB的SL3261组、携带pTrc99A-ureB/hlyE的SL3261组.免疫后4 wk,予Hpylori107CFU/只进行攻击(生理盐水组不攻击).攻击4 wk后处死动物,取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养,观察H pylori定植情况.结果:核苷酸序列测定及同源性分析证实,原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE中所含的H pylori-ureB及hlyE基因与GeneBank中的H pylori-ureB和hlyE基因同源性分别为97.42%(1 663/1 707)、99.78%(910/912).重组减毒沙门氏菌可表达约100ku的融合蛋白UreB/hlyE,含量占全菌体蛋白含量的15%;表达的融合蛋白能与小鼠抗H pylori血清特异性反应,具有良好的免疫原性.动物实验证实,疫苗组同空白对照组和SL3261组相比,H pylori定植密度明显下降,有显著性差异(P<0.05).表达UreB/hly蛋白的疫苗株组同表达UreB蛋白的疫苗株相比,H pylori定植密度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论:重组疫苗菌对小鼠H pylori感染具有一定免疫预防作用,hlyE可以增强疫苗株的免疫保护效果.
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C57BL/6小鼠幽门螺杆菌感染动物模型的建立
目的:建立幽门螺杆菌(Hpylori)小鼠感染模型.方法:以C57BL/6小鼠为实验动物,经口感染接种Hpylori悉尼株(SS1),置层流柜中饲养.用HE染色、石碳酸-碱性品红染色、免疫组织化学染色、尿素酶实验、细菌培养等方法检测接种小鼠,并用PCR、基因测序方法对胃组织细菌、胃组织分离培养细菌DNA进行分析.结果:小鼠胃组织分离培养的细菌与接种细菌形态及特性相同.胃窦隐窝可观察到细菌定植,胃黏膜下层可见炎症细胞浸润.胃组织DNA中成功扩增出H pylori 16SrRNA及cagA基因的目的片段,基因测序结果显示与接种菌株序列完全一致.结论:H pylori SS1经口接种C57BL/6小鼠2 mo后可成功在胃内定植并导致成慢性胃炎.
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钩端螺旋体感染的ICR小鼠模型与豚鼠模型的比较分析
[目的]通过比较钩端螺旋体感染的ICR小鼠模型与豚鼠模型,分别探讨慢性非致死性感染与急性致死性钩体感染的病理及免疫应答特点.[方法]分别于小鼠和豚鼠腹股沟皮下注射致病性钩端螺旋体赖型有毒株Lai株,观察感染后不同阶段此各组织脏器的病理改变;用免疫组化法检测钩端螺旋体在各脏器中的分布;应用ELISA法检测ICR小鼠血清与豚鼠血清中抗体水平的动态变化.[结果]钩端螺旋体Lai株感染豚鼠后引发典型的钩体病病变并可致死,但在藤染的ICR小鼠中仅见局限性病变,免疫组化显示小鼠组织中的钩体抗原阳性反应程度较豚鼠轻.两种动物感染后均未见明显炎症反应.二者血清中抗体IgG水平的动态变化相似.[结论]小鼠感染钩体后发病轻微呈慢性带菌状态,而豚鼠作为钩体感染敏感动物表现为急性发病且可死亡,可能与二者的天然免疫机制的差异有关.小鼠感染模型在钩体感染的天然免疫机制、致病机制研究及流行病学研究中可能发挥更多作用.两种动物模型可互补共同用于钩体感染的相关研究中.
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DEN-2NGC株感染Balb/c小鼠TH1/TH2类细胞因子产生的差异
目的:通过观察2型登革病毒(DEN2)NGC株初次感染和再次感染Balb/c小鼠后,小鼠血浆中TH1和TH2类细胞因子的产生及其动态变化,研究DEN2感染的免疫机制.方法:用不同量的DEN2 NGC株经皮下多点注射,建立Balb/c小鼠感染模型,用间接ELISA法测定感染后不同时间点小鼠血浆IL-2、IL-5、IL-6、IL-10的含量.结果:1.在初次或再次感染阶段,DEN2 NGC株各感染组产生IL-4、IFN-Y、IL-5、IL-6、IL-10与正常对照比较有显著差异(p<0.05).(1)在初次感染阶段,NGC株各感染组血浆IL-2、IL-5、IL-6于第4,6,8天出现;在再次感染阶段,各感染组产生IL-2、IL-5、IL-6均于第1天迅速升高;IL-2水平于第4天达高峰(104448.46+13314.1)ng/L,维持5-7天后迅速下降;IL-5于第48h达到高峰(135.125+46.75)ng/L;各组小鼠IL-6产生的动态相似,在再次感染后第1天达高峰(555.823+44.639)ng/L后逐渐下降.(2)初次早期,IL-4水平明显升高,而IFN-Y处于较低水平;再次较高后第1天,IL-4水平达高峰(4294.668+349.038)ng/L,IFN-y则于第4天和第11天达较高水平,两者的产生彼消此长,其水平与感染病毒量有关. 2.在初次或再次感染阶段,用不同量KEN2 NGC株感染Balb/c小鼠产生的细胞因子水平有差异.结论:DEN2 NGC株初次和再次感染Balb/c小鼠后,TH1和TH2应答均可发挥一定作用,二者相互影响,TH细胞及其产生的CK在DEN感染的发病机制中起重要作用.
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登革病毒2型感染BALB/c小鼠的IL-4、IFN-γ产生动态观察
目的: 探讨登革病毒2型(DEN2)临床分离株感染BALB/c小鼠后其血浆中IL-4、IFN-γ产生动态及相关关系.方法: 用不同剂量DEN2临床分离株经皮下多点注射,建立BALB/c小鼠感染模型,并用双抗体夹心ELISA法检测感染后不同时间各组动物血浆中IL-4、IFN-γ浓度.结果: DEN2感染可使BALB/c小鼠产生IL-4、IFN-γ增加(P<0.05),且细胞因子浓度与病毒感染剂量有关.初次感染阶段两者水平均有升高,而再次感染阶段以IL-4升高为主.结论: 在初次感染阶段TH1/TH2应答均发挥重要作用;而再次感染阶段以TH2应答为主.