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几种不同方式诱导Jurkat细胞凋亡过程中TFAR19的表达
为探讨一个新的细胞凋亡相关基因--TFAR19所参与的凋亡途径,我们研究了几种不同方式诱导白血病细胞株Jurkat细胞凋亡过程中TFAR19表达的变化.采用去除血清,VP-16作用及Fas单抗活化受体等方法诱导Jurkat细胞凋亡后,以RT-PCR方法检测mRNA水平TFAR19的表达,用流式细胞术及Western印迹检测蛋白水平TFAR19的表达.实验结果显示,Jurkat细胞在去除血清12小时,VP-16作用2小时,以及Fas单抗诱导细胞凋亡2小时后,在mRNA及蛋白水平TFAR19的表达都呈增高趋势.结论提示,TFAR19参与了去除血清、DNA损伤及死亡受体激活所诱导的细胞凋亡过程,它在细胞凋亡过程的早期开始发挥作用,TFAR19是细胞凋亡途径中的"终末共同通路"的参与者.
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TFAR19蛋白在卵巢上皮性癌中的表达
目的探讨TFAR19蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达情况及关系.方法应用免疫组化方法检测TFAR19蛋白在79例卵巢上皮性癌组织(其中浆液性腺癌33例,粘液性腺癌13例,子宫内膜样腺癌11例,其他类型卵巢上皮性癌22例),33例卵巢良性肿瘤组织(其中浆液性腺瘤18例,粘液性腺瘤13例,其他良性肿瘤2例)及11例正常卵巢组织中的表达.结果39.24%的卵巢上皮性癌、81.82%的正常卵巢上皮、75.76%的卵巢良性肿瘤组织中TFAR19蛋白呈强阳性表达,卵巢上皮性癌与卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢上皮相比差异有显著性(P＜0.05).不同FIGO分期(1986年)卵巢上皮性癌中强阳性表达比例分别为FIGO Ⅰ期:80%,FIGOⅡ期45.45%,FIGOⅢ期31.25%,FIGOⅣ期30%;不同组织学分级卵巢上皮性癌中TFAR19的强阳性表达分别为G1期62.5%,G2期50%,G3期29.79%;卵巢粘液性癌组织中TFAR19蛋白的强阳性表达明显高于浆液性腺癌与子宫内膜样癌.结论TFAR19蛋白的表达与卵巢上皮性癌的FIGO分期、组织学分级、病理类型相关.随FIGO分期与组织学分级升高,TFAR19蛋白的表达下调.TFAR19蛋白可能是卵巢上皮性癌细胞细胞凋亡的重要调控因子.
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凋亡促进分子TFAR19在成人慢性髓性白血病骨髓细胞的异常表达
目的:研究成人慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia ,CML)骨髓细胞凋亡促进分子--TFAR19的表达,以探讨TFAR19在CML发病及疾病进展中的作用.方法:利用15种不同荧光标记的单克隆抗体标记骨髓细胞,通过流式细胞术检测未治CML慢性期病人、CML加速/急变期病人、及正常人骨髓不同细胞群细胞内TFAR19的表达.结果:20例未治CML慢性期及13例加速/急变期病人骨髓总的有核细胞内TFAR19平均荧光强度明显低于10例正常人组骨髓总的有核细胞,分别为5 793±1 536,7 260±781,P＜0.01及4 293±1 082,7 260±781,P＜0.01,其中未治CML慢性期及加速/急变期病人骨髓粒细胞内TFAR19平均荧光强度低于正常人组骨髓粒细胞,分别为6 240±1 734,8 317±726,P＜0.01,及5 759±1 487,8 317±726,P＜0.01;未治CML慢性期及加速/急变期病人骨髓淋巴细胞内TFAR19平均荧光强度低于正常人组骨髓淋巴细胞,分别为1 292±639,2 271±820,P＜0.01,及1 231±281,2 271±820,P＜0.01.CML加速/急变期病人总的有核细胞与未治CML慢性期病人相比,TFAR19表达进一步降低,分别为4 293±1 082,5 793±1 536,P＜0.01.结论:未治CML慢性期病人、CML加速/急变期病人骨髓总的有核细胞与正常人相比TFAR19表达降低,未治CML慢性期病人、加速/急变期病人骨髓粒细胞及淋巴细胞TFAR19表达均低于正常人组骨髓,CML加速/急变期病人总的有核细胞与未治CML慢性期病人相比,TFAR19表达进一步降低.TFAR19的异常表达可能在CML疾病进展中起一定作用.
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人程序化死亡分子5(PDCD5)核酸和蛋白质序列的数据发掘
目的:以程序化死亡分子5(PDCD5)为靶分子,对其核酸与蛋白质序列进行生物信息学分析,为PDCD5功能的实验研究提供基础,同时也为人类功能基因的生物信息学分析提供新的技术路线.方法:利用数据库相似性搜索、同源物结构比较、表达谱分析和查询基因"邻居"等技术进行数据发掘和数据综合分析.结果:发现人PDCD5在12号和5号染色体上分别存在返座假基因(retropseudogene),小鼠1号染色体也存在小鼠PDCD5 cDNA的返座假基因.热自养甲烷杆菌的PDCD5同源物、泛素及核糖体蛋白S13具有与人PDCD5相似的折叠方式.线虫的PDCD5同源物、泛素及IAP(inhibitor of apoptosis proteins)分子等在表达谱拓扑图上属于同一基因簇成员,该基因簇与生物合成和蛋白质合成相关.PDCD5同源物在多个基因组中与多种核糖体蛋白相邻.结论:PDCD5存在2个拷贝的假基因.PDCD5除参与细胞凋亡外,预测还与泛素有功能相关性,并可能参与蛋白质的翻译调控.
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小鼠凋亡相关新基因TFAR19 cDNA的克隆化和序列分析
目的:了解一个细胞凋亡相关新基因TFAR19在不同种属间的序列同源性.方法:利用表达序列标签(expressed sequence tag, EST)拼接技术、RT-PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术.结果:首次成功进行了小鼠TFAR19 cDNA 编码区的cDNA 克隆化和序列分析,发现小鼠和人TFAR19 在核苷酸水平上有81.4%的同源性,在氨基酸水平上有高达96%的同源性.功能区分析发现,小鼠TFAR19 cDNA序列含编码126个氨基酸的开放性读码框架,含1个可能的cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点,4个可能的PKC 磷酸化位点.其C端的"EDDADY"序列与人DNA拓扑异构酶I141-147位残基序列完全相同.结论:小鼠TFAR19是与人TFAR19高度同源的新基因, 与DNA拓扑异构酶I可能有功能相关性.
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新细胞因子及细胞凋亡基因的发现与功能研究
在人类基因组完成工作框架图以后,人类功能基因组学成为重要的任务之一.我们目前正在重点研究编码细胞因子和凋亡相关分子的人类功能基因.本综述介绍其中的2个首先由我们实验室克隆的分子,即趋化素样因子1(CKLF1)和程序化细胞死亡分子5(PDCD5,过去命名为TFAR19).CKLF1是属于一个新的基因超家族的成员,具有体内外对不同白细胞的趋化活性、刺激骨骼肌增殖活性和刺激骨髓细胞增殖活性.在临床应用上,重组CKLF1蛋白质有可能用于肌萎缩的治疗,CKLF1抑制剂有可能用于变态反应和自身免疫病的治疗.PDCD5是凋亡的正调节分子,能够结合胱天蛋白酶-3,并在体外延长其半衰期.较多证据表明,PDCD5在肿瘤组织的表达低于正常组织.PDCD5有可能成为肿瘤、自身免疫病的标志或作为一种治疗靶点.
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人TFAR19的定点突变及其重组蛋白的表达、纯化和功能分析
目的:了解凋亡相关新基因TFAR19编码蛋白分子中潜在的Ser100磷酸化位点与其促凋亡效应的关系.方法:利用重叠延伸PCR定点突变技术构建TFAR19 Ser100→Ala100突变体,用DNA测序技术验证,大肠杆菌表达,离子交换技术纯化重组突变蛋白,将其加入培养的白血病细胞株HL-60,通过PI染色,流式细胞仪分析,观察突变重组蛋白的促凋亡效应.结果:构建成TFAR19 Ala100突变体,并经DNA测序所证实,在大肠杆菌中获得了高水平表达,Western blot表明突变型重组蛋白与野生型具有相同的免疫学活性,流式细胞仪分析发现突变蛋白对撤除血清的HL-60细胞具有与野生蛋白相似的剂量依赖性促凋亡效应. 结论:TFAR19 分子中潜在的Ser100磷酸化位点对其促凋亡效应无影响,提示TFAR19发挥其生物学活性时无需cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶活化.
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凋亡相关蛋白TFAR19在TF-1细胞凋亡中出现细胞核转位
目的：探讨凋亡相关分子TFAR19 在TF-1细胞凋亡过程中的表达及定位。方法：以TFAR19的单克隆抗体为工具，采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞仪等研究手段，观察细胞凋亡过程中TFAR19分子的表达水平和细胞内定位，分析其与细胞膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)以及细胞核DNA片段化的关系。结果：TFAR19蛋白在撤除GM-CSF的TF-1细胞中表达水平显著增高，伴有明显的核转位现象，且早于PS外翻和细胞DNA片段化。结论：TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一, 这一新发现为进一步探讨TFAR19蛋白的生物学效应，以及对细胞凋亡的多方位研究提供了新的线索和思路。
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四种凋亡促进因子与腰椎结核关系的研究
目的 探讨凋亡促进因子TFAR19、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9与腰椎结核的关系.方法 选择首都医科大学附属北京潞河医院及广西医科大学第一附属医院脊柱外科就诊的新发腰椎结核患者40例(A组),同时选取健康体检者40例作为对照组(B组),采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测腰椎结核患者血清TFAR19、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9浓度.结果 A组、B组血清TFAR19浓度分别为(2.11±0.23)和(1.30±0.09)ng/ml,Apaf-1浓度分别为(388.00±54.44)和(107.52±11.58) pg/ml,Caspase-3浓度分别为(16.98±1.90)和(11.24±0.41)pmol/L,Caspase-9浓度分别为(25.76±2.74)和(18.54±2.19)pmol/L;两组比较,TFAR19(t 3.24,P=0.001),Apaf-1(t=5.04,P=0.000),Caspase-3(t=2.96,P=0.005),Caspase-9(t=2.06,P=0.043)浓度差异均有统计学意义.结论 TFAR19、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9与腰椎结核的发生及发展相关,其机制可能通过TFAR 19、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9的表达上调促进细胞凋亡,参与机体抗结核的免疫过程.
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细胞凋亡相关基因TFAR19研究进展
细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡,故又称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD),其在机体的发育和维持内环境的稳定中起着至关重要的作用[1,2].
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TF-1细胞凋亡相关基因19在桥本病甲状腺细胞中的表达
探讨新的凋亡相关蛋白TFAR19在桥本病(HT)甲状腺组织中是否表达.结果显示TFAR19在正常甲状腺组织中几乎未见表达,而在HT患者甲状腺细胞中阳性表达,提示TFAR19凋亡通路激活可能在HT的发病机制中发挥重要作用.
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TFAR19蛋白协同米非司酮对前列腺癌PC-3M细胞凋亡的影响
目的 初步探讨TFAR19协同米非司酮(MIF)对前列腺癌PC-3M细胞凋亡的影响.方法 构建TFAR19真核表达载体,用脂质体介导的方法转染PC-3M细胞.MTT法检测5、10、20、50和100 μmol·L-1 MIF作用于前列腺癌PC-3M细胞24～96 h的吸光度(A)值.在转染TFAR19的细胞中加入20 mol·L-1 MIF培养24、48 h,MTT比色法检测细胞增殖,原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡率,透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变.结果 构建了PCI-neo-TFAR19真核表达载体并在转染的PC-3M细胞中得到了瞬时表达.MTT实验表明,与对照组相比,5、10 μmol·L-1 MIF组的A 值差异无统计学意义(P>0.05),20、50和100 μmol·L-1 MIF组的A值差异有统计学意义(P<0.01),MIF对前列腺癌PC-3M细胞的抑制作用呈时间、剂量依赖性;转染PCI-neo-TFAR19并加入20 mol·L-1 MIF后,与对照组及单独应用MIF组相比,细胞生长明显受到抑制(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征(细胞体积缩小,核皱缩、碎裂,染色质呈块状边集等).结论 TFAR19蛋白能够协同米非司酮促进前列腺癌PC-3M细胞凋亡,有望成为前列腺癌的辅助治疗药物.
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非洲爪蟾卵非细胞翻译体系的建立及应用
目的当前人类基因组研究的重心正在由"结构"向"功能"转移.而基因功能的研究离不开基因的表达,这就迫切需要一种操作简便,适用范围广的表达工具来表达有功能的蛋白质.方法非洲爪蟾注射HCG催卵,2%半胱氨酸去胶膜,高速离心制备卵提取物,即为非洲爪蟾卵非细胞翻译体系.通过亚克隆技术将TFAR19基因克隆到体外转录质粒中,通过酶切线性化模板,体外转录,加帽合成cRNA,将其加入到制备的蛙卵提取物中进行体外翻译.结果用Western blot鉴定,获得了高效翻译,并且加入亚精胺和ATP再生系统可以提高翻译的效率.结论非洲爪蟾卵非细胞翻译体系为表达有功能的蛋白提供了一种极有应用前景的表达工具.
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非酒精性脂肪肝患者血清TFAR19变化及其与中医证型的关系
目的 探讨非酒精性脂肪肝患者血清TFAR19变化及其与中医证型的关系.方法 选取非酒精性脂肪肝患者60例为病例组,根据脂肪肝中医临床辨证分为3型；健康体检者20例为对照者,用ELISA法测定所有血清标本的TFAR19吸光度值.结果 非酒精性脂肪肝血清TFAR19吸光度为(0.338±0.062),健康对照组为(0.330 ±0.045),2组比较无显著性差异(P＞0.05),但根据B超分度亚组分析提示轻度非酒精性脂肪肝患者血清TFAR19吸光度(0.360±0.046),与对照组和中度非酒精性脂肪肝相比升高,比较有显著性差异(P＜0.01)；非酒精性脂肪肝证型分布上,以肝郁气滞和痰湿蕴结两型占多数,分别为40％(24/60例)、41.67％(25/60例)；而脾虚湿蕴型占18.33％(11/60例)；其血清TFAR19含量以肝郁气滞型升高(0.370±0.056),与对照组和痰湿蕴结型和脾虚湿蕴型比较,差异显著(P＜0.05)；痰湿蕴结型和脾虚湿蕴型之间比较,差异无显著性(P＞0.05).结论 非酒精性脂肪肝以实证为主,或见虚实夹杂.轻度非酒精性脂肪肝患者血清TFAR19升高,对应的中医证型为肝郁气滞型,提示此类患者存在活跃的细胞凋亡代谢,为早期干预提供参考.
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PDCD5蛋白在人类正常前列腺、良性前列腺增生及前列腺癌组织中的表达
目的:探讨PDCD5在正常前列腺、良性前列腺增生(BPH)及前列腺癌(PCa)组织中的表达特点及其临床意义.方法:通过EnVision法对12例正常前列腺、22例前列腺增生及22例不同病理分级的PCa组织切片进行PDCD5免疫组织化学染色,采用人工阅片评分及计算机辅助染色强度判定2种方法对PDCD5在相应组织中的表达进行定性及定量分析.结果:PDCD5定性及定量检测结果分析显示:正常前列腺与BPH组织中PD-CD5表达无显著性差异(P>0.05),中低危组PCa(Glesaon评分≤7)及高危组PCa(Glesaon评分>7)组织中PD-CD5表达与正常前列腺与BPH均存在显著性差异(P<0.01),并且两组间PDCD5表达亦存在显著性差异(P<0.05).结论:PDCD5在正常前列腺及BPH组织中近似地呈现较强的阳性表达.PDCD5在PCa组织中的表达较正常组织及BPH均有显著下降,并且随着PCa恶性程度上升,PDCD5的表达进一步下调,提示PDCD5可能在不同程度上参与了PCa发生、发展过程中腺细胞凋亡的调控.
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PDCD5在肝癌组织中的表达及其临床意义
目的 探讨PDCD5在肝癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化染色法检测10例正常肝组织和30例肝癌组织中PDCD5的表达.结果 PDCD5在肝癌组织中低表达,与肝癌大小、病理分级及有无门静脉癌栓无明显相关性(依次为t=0.365,P=0.718;r=0.097,P=0.611;t=0.136,P=0.893).结论 PDCD5在肝癌中低表达可能与肝癌的发生有关,也可能是导致肝癌多药耐药的原因之一.
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肾透明细胞癌PDCD5表达及与预后的关系
目的 探讨PDCD5在肾透明细胞癌发生、发展中的作用及与预后关系.方法 采用免疫组织化学方法,对46例肾透明细胞癌组织中PDCD5表达进行研究,对患者存活率进行回顾性随访.结果 癌旁肾组织中PDCD5阳性表达率显著高于肾癌组织.PDCD5阳性表达率随肾透明细胞癌病理分级和临床分期的上升而下降,染色强度也减弱.PDCD5阳性表达组3年及5年存活率高于阴性表达组.结论 PDCD5为肾透明细胞癌的负性调节因子,对抑制肾透明细胞癌的恶性转化和进展可能有重要的意义.
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TFAR19(PDCD5)蛋白在正常肾、肾透明细胞癌组织及正常膀胱、膀胱癌组织中的表达
目的了解凋亡基因PDCD5在正常肾、肾透明细胞癌组织及正常膀胱、膀胱癌组织中的表达,分析PDCD5在肾透明细胞癌、膀胱癌的发病中所起的作用.方法采用免疫组织化学的方法,对63例肾组织切片和42例膀胱组织切片进行PDCD5的免疫组化染色.采用人工阅片评分及计算机辅助染色强度判定2种方法判断肾组织PDCD5的染色阳性率及染色强度,用单因素方差分析法及列联表的卡方检验和关联度测量判断PDCD5的表达与正常肾、肾透明细胞癌组织的相关性;采用人工阅片判断膀胱组织PDCD5的染色阳性率.结果免疫组织化学的结果显示,在正常肾组织肾小管区中,PDCD5表达多呈强阳性,肾透明细胞癌组织表达随着分期的增加呈递减趋势.正常肾组织及各期肾透明细胞癌组织中PDCD5表达的差异有统计学意义.正常膀胱、膀胱癌组织中PDCD5无显著表达.结论 PDCD5可能在不同程度上参与了肾透明细胞癌进程中的调控;PDCD5在正常膀胱、膀胱癌组织中表达程度极低.
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FTIR对TFAR19基因促红白血病MEL细胞凋亡作用的研究
采用FTIR方法,研究了TFAR19基因转染前后,小鼠红白血病MEL细胞内重要组分的变化.经脂质体介导基因转染,获得了稳定携带TFAR19基因的MEL-TF19细胞,RT-PCR检测表明,该基因在mRNA水平有表达;撤除血清诱导凋亡,在此过程中进行了FTIR检测,结果显示:转染TFAR19基因后,细胞内蛋白质相对核酸的含量增高,细胞转录活性增强,细胞内磷脂的相对含量降低.所有这些变化都反映了TFAR19基因的促凋亡作用,并可能是前期工作中发现的细胞流变学特性发生变化的基础.
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凋亡促进因子TFAR19,Apaf-1与腰椎间盘突出症的关系研究
目的 探究凋亡促进因子TFAR19,Apaf-1与腰椎间盘突出症关系.方法 随机选择广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科住院接受手术的腰椎间盘突出症患者99例,其中设单个节段突出的患者70例为A组,多个节段突出(腰椎间盘突出节段数量≥2个)的患者29例为B组,于入院次日收集外周静脉血.同时随机选取健康体检者40例作为对照组(C组).采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测腰椎间盘突出症患者血清中TFAR19,Apaf-1浓度.结果 C组、B组及A组血清中TFAR19浓度分别为1.30±0.09,1.85±0.14和2.33±0.25 ng/ml,各组之间TFAR19浓度差异具有统计学意义(F=7.979,P＜0.01).与C组相比,A组(q=3.60,P=0.012)、B组(q=5.59,P＜0.01)TFAR19浓度差异具有统计学意义.A组、B组之间TFAR19浓度差异有统计学意义(q=2.93,P=0.012).C组、B组及A组血清中Apaf-1浓度分别为107.52±11.58,159.22±11.87,203.20±20.21 pg/ml,各组之间Apaf-1浓度差异具有统计学意义(F=8.828,P＜0.01).与C组相比,A组(q=3.89,P=0.007)、B组(q=5.86,P＜0.01) Apaf-1浓度差异具有统计学意义.A组、B组之间Apaf-1浓度差异有统计学意义(q=2.97,P=0.037).各组间性别构成比差异无统计学意义(x2 =0.229,P=0.892).各组之间年龄差异无统计学意义(F=0.091,P=0.91).结论 腰椎间盘突出症患者血清TFAR19,Apaf-1表达上调加速了腰椎间盘退变过程,参与了腰椎间盘突出症的发生,并且与椎间盘突出节段数量相关,突出节段数量越多,TFAR19,Apaf-1表达量越高.
