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TFPI-2/KD1的克隆表达及其生物学性质研究
目的 克隆表达人组织因子途径抑制物-2(hTFPI-2)Kunitz结构域1(KD1)基因.方法 提取健康女性正常分娩胎盘中总RNA,采用RT-PCR法合成hTFPI-2全长cDNA后行PCR扩增,以扩增得到的hTFPI-2/KD1基因片段与原核表达载体pET22b进行连接并转化E.coli DH5α,获得重组质粒pET22bhTFPI-2/KD1.将重组质粒pET22b-hTFPI-2/KD1转化至E.coli BL21,获得重组菌株E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1].以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,并利用Ni2+-NTA柱进行亲和层析纯化,采用发色底物法和明胶酶谱法分别检测hTFPI-2/KD1抑制胰蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMP)的活性.结果 核酸序列测定显示克隆的hTFPI-2/KD1基因序列与理论序列相符.SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1]诱导表达产物相对分子质量与预期相符,经纯化后获得了完整的hTFPI-2/KD1蛋白,发色底物法和明胶酶谱法检测显示其具有抑制胰蛋白酶、MMP-2和MMP-9的活性.结论 通过原核表达系统成功获得高效表达并具有生物活性的hTFPI-2/KD1,为进一步研究其功能奠定了基础.
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以人血清白蛋白为载体的长效蛋白质药物的研究进展
基因工程和蛋白质工程的发展极人地促进了以胰岛素、干扰素、白介素和单克隆抗体等为代表的多肽和蛋白质类药物的研究与开发,使之成为现代医药产品研究发展的方向.
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催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展
甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素 P450（CYP450）氧化酶 BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用，基于细胞色素 P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干 P450 BM3突变酶的基础上，通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法，筛选出催化甾体羟基化的相关 CYP450。根据易错 PCR等定向进化技术获得了突变位点信息，进一步采用（饱和）定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析，再经过筛选获得既高于亲本酶也高于易错 PCR技术得到的突变酶活力的新突变酶，并对突变体进行功能验证，进一步阐明甾体羟基化的可行性和重要性。此外，P450 BM3催化底物和生成产物的选择性可以通过迭代的组合活性位点突变而改变。本文旨在探究近年来科研人员在 P450氧化酶 BM3蛋白质工程催化甾体羟基化的改良领域中所做的尝试、获得的成果以及存在的问题，为 P450 BM3羟基化疏水性甾体的深入研究提供理论依据。
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基于SM 蛋白的CHO细胞分泌工程化改造和抗体表达的研究
目的：通过构建基于 SM 基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM 细胞株，探讨在悬浮培养条件下，过表达转运蛋白 SM 基因对分泌蛋白表达的影响。方法首先从人 HEK293FT 细胞中克隆出 sly1和munc18c 基因，然后构建含有 SM 基因的真核表达载体 pBSM；随后将 pBSM 质粒稳定转染入 CHO-AV 细胞并鉴定，获得了基于 SM 基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM 细胞株；在此基础上对 CHO-AV-SM 细胞株进行悬浮培养适应，并测定了 CHO-AV 和 CHO-AV-SM细胞株的生长和蛋白表达参数。结果过表达转运蛋白 SM 基因，CHO-AV-SM 细胞株的抗体表达量较 CHO-AV 抗体表达量提高约75%，且测得第6天细胞数达到大值，此时 CHO-AV 的表达量约为45.4μg/ml，CHO-AV-SM 的表达量为79.5μg/ml。结论通过构建全抗稳定表达细胞，在细胞中过表达 SM基因，并悬浮培养适应，建立了悬浮培养条件下基于转运蛋白过表达的分泌工程改造方法，为转运蛋白改造 CHO 细胞，提升全抗表达能力提供了有力支持。
关键词： CHO 细胞 蛋白质工程 SLY1 蛋白质类 MUNC18c 蛋白质类 贝伐单抗 -
EMCV3C蛋白酶抑制真核细胞蛋白质合成的研究
目的 探讨脑心肌炎病毒(EMCV)的3C蛋白酶对真核细胞转录及翻译机制的影响.方法 构建真核表达载体pcDNA3.1-3C,将表达载体分别与帽样依赖的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP-N1和萤火虫荧光素酶(Fluc)载体pGL3载体共转染细胞后,检测GFP和Fluc的表达.Western Blot检测EMCV病毒和pcDNA3.1-3C对真核生物翻译起始因子4GI(eIF4GI)及多聚A尾结合蛋白(PABP)的影响.RT-PCR检测pcDNA3.1-3C对GFP mRNA转录水平的影响.结果 EMCV-3C可以抑制帽样依赖的GFP和Fluc的表达.EMCV 3C和EMCV病毒感染均导致细胞内PABP发生切割,而对eIF4GI均无明显作用.EMCV-3C也可导致GFP基因mRNA转录水平下降.结论 EMCV的蛋白酶3C通过mRNA转录水平的抑制和PABP的切割而抑制真核细胞帽样结构依赖途径的蛋白翻译,从而抑制蛋白质的合成.
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PrP106-126多肽抑制14-3-3β蛋白二聚体形成的研究
目的 探讨PrP蛋白和PrP106-126多肽对14-3-3蛋白二聚体形成的影响 方法 将重组表达纯化的0.25 μg、0.5 μg和1μg PrP蛋白、人工合成的PrP06-126肽分别与重组的14-3-3β共孵育,分别通过非变性聚丙烯酰胺凝胶的Western Blott检测PrP蛋白和PrP106-126肽对14-3-3β二聚体和多聚体的形成影响.将不同浓度的PrP与250 μmol/L的PrP106-126肽和14-3-3蛋白共孵育,检测PrP蛋白对PrP106-126肽对14-3-3β二聚体和多聚体的形成影响.随后,将200μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L的PrP106-126多肽分别作用于HeLa细胞8h后,检测细胞内的14-3-3二聚体形成.结果 PrP蛋白与14-3-3蛋白共孵育后,14-3-3二聚体和多聚体的信号随着PrP浓度的增加明显增强；PrP106-126多肽共孵育时,14-3-3二聚体和多聚体的信号随着PrP浓度的增加而减弱；不同浓度的PrP蛋白可以拮抗PrP106-126多肽对14-3-3β二聚体的形成.而且PrP106-126多肽可以干扰HeLa细胞中的二聚体形成.结论 PrP蛋白促进14-3-3二聚体的形成,而PrP106-126多肽干扰二聚体的形成,且PrP蛋白具有拮抗PrP106-126肽干扰14-3-3二聚体形成的作用.
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RSV毛细支气管炎SP-D基因多态性与甲强龙疗效的关系
目的 探讨汉族儿童呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)毛细支气管炎肺表面活性蛋白D(surfactant protein D,SP-D)基因多态性与甲强龙治疗疗效的关系.方法 采用MGB测序法检测150例RSV毛细支气管炎和150例健康对照组SP-D-11位点、160位点基因多态性,并进行基因型、等位基因型频率分析,分析基因多态性和毛细支气管炎发病的关系,采用(x2)检验.150例患儿在常规治疗基础上加用甲强龙静脉滴注,连用3d.分析SP-D基因多态性对甲强龙治疗疗效的影响,采用方差(F)分析.结果 病例组SP-D Met11Thr位点TT、CT、CC三种基因型频率分别为7.3％、44.0％、48.7％,T、C等位基因频率分别为29.3％、70.7％.三种基因型及等位基因频率与对照组比较差异有统计学意义(x2 =6.751、5.823,P＜0.05).SP-D Ala160Thr位点AA、GA、GG三种基因型频率分别为4.0％、29.3％、66.7％,A、G等位基因频率分别为18.7％、71.3％,两组基因型及等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(x2 =0.182、0.181,P＞0.05).不同基因型在平均住院天数、临床症状改善差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 杭州地区汉族儿童存在SP-D基因多态性,SP-DMet1 1Thr位点与RSV毛细支气管炎疾病易感性存在关联,SP-D Met11Thr C等位基因可能易感基因;而SP-D Ala160Thr位点与RSV毛细支气管炎疾病易感性无关联.SP-DMet1 1Thr、SP-D Ala160Thr的多态性并不影响甲强龙治疗的疗效.
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甲型流感病毒NP和M2e融合蛋白高效表达和纯化
目的 探索甲型流感病毒NP-M2e融合蛋白在大肠埃希菌中可溶性高效表达和纯化的条件.方法 将NP-M2e融合基因(NM2e)经密码子优化后插入pET30a后获得pET30a-NM2e原核表达质粒,通过转化BL21(DE3)后的克隆筛选、诱导温度与诱导时间等条件的优化实现NM2e蛋白在大肠埃希菌中的可溶性高效表达;表达产物经离子交换层析与分子筛层析纯化并通过Western-Blot鉴定其抗原性.结果 NM2e基因正确插入pET30a中并能在大肠埃希菌中表达;25℃温度诱导下NM2e蛋白出现可溶性表达,诱导时间由4h延长至10 h可明显提高蛋白表达量;可溶性NM2e蛋白经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化后的纯度可达90％,纯化产物能特异性结合NP鼠多抗及M2e鼠单抗.结论 甲型流感病毒NM2e融合蛋白能在大肠埃希菌中高效表达和纯化并保持良好的免疫反应活性.
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戊型肝炎病毒ORF2的构建表达和纯化
目的 获取有免疫原性的戊肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值.方法 经密码了优化后人工合成戊型肝炎病毒(HEV) HEV-ORF2(aa 368-607)基因,克隆入表达载体pET43a中,构建重组表达质粒pET43a-HEV并进行原核表达;经阴离子交换纯化后通过Western Blotting和ELISA鉴定该蛋白.结果 酶切鉴定及测序结果均显示表达质粒构建正确;SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白与预期相对分子质量大小一致;Western Blotting和ELISA结果显示该蛋白能与戊肝抗体特异性结合.结论 成功获取了纯度很高且有生物活性的戊肝抗原蛋白,为研制新型检测试剂盒提供理论基础和方案.
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通过改造工程细胞提高重组蛋白类药物产量的研究进展
哺乳动物细胞是表达蛋白类生物产品的理想宿主细胞.但是,表达水平常较低.通过对工程细胞进行改造,如抑制细胞凋亡、对细胞周期进行调控、提高翻译后加工能力、改变细胞新陈代谢的特性、实现基因组热点整合等,可有效地提高重组蛋白类药物的产量,为生物药品的规模化生产奠定基础.
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蛋白质组学技术用于功能性胃肠病研究
目的:探讨将蛋白质组学方法用于功能性胃肠病发病机制研究的可行性.方法:选择发病率较高的肠易激综合征(imtable bowel syndrome,IBS)亚型患者作为研究对象,运用蛋白质组学方法,双向凝胶电泳后应用不同染色方法进行染色,Image Master 2D Elite分析软件对图像进行分析.结果:考马斯亮蓝法染色用于腹泻型IBS患者,平均得到蛋白质点426个;硝酸银染色法用于便秘型IBS患者,平均得到蛋白点581个.结论:双向凝胶电泳法可得到IBS患者结肠黏膜组织的蛋白质组图谱;硝酸银染色法的分辨率明显高于考马斯亮蓝法.
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寻找曾经拥有的世界——传统中药的生物技术研究进展
生物技术是一门应用生物科学研究成果以及工程手段增加数量和提高质量从而满足人类日益增长的对生物制品需求的技术,它的具体内容包括细胞工程、发酵工程、酶和蛋白质工程、基因工程四个方面.
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体外循环前后患者血浆基质金属蛋白酶-9浓度及激活程度的变化
目的研究体外循环前后患者血浆基质金属蛋白酶-9(MMP-9)浓度和激活程度的变化.方法拟行心内直视手术的成年患者20例为体外组,同期行其他开胸手术的成年患者8例为对照组.所有患者均采用芬太尼静脉复合麻醉.体外组患者在肝素化后常规建立体外循环,以2.2～2.4 L/(m2·min)恒流灌注,体外循环期间维持鼻温27℃～29℃.分别在手术开始前、转流开始前和停机成功后取血液标本2 ml,肝素抗凝,分离出血浆,分装并置于-20℃冰箱中保存.对照组患者的采血时间为手术开始前、进胸后和关胸时,标本处理和保存方法同体外组.全部标本均测定血浆总MMP-9浓度和活性MMP-9浓度,计算MMP-9激活程度.结果体外组患者血浆总MMP-9、活性MMP-9浓度及其激活程度于停机成功后高于对照组(对照组为关胸时)(P＜0.01);与手术开始前比较,体外组患者上述指标于停机成功后显著升高(P＜0.01),而对照组各时点间差异无统计学意义(P＞0.05).结论体外循环可导致患者血浆MMP-9浓度和激活程度显著升高.
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重组类胰岛素研究进展
自从1920年Banting和Best发现胰岛素后,胰岛素就成为治疗糖尿病的特效药物.初临床上应用的胰岛素全部是从动物的胰脏(主要是猪与牛)中提取的.由于动物胰岛素与人胰岛素结构上的差异(牛胰岛素与人胰岛素相差3个氨基酸,猪胰岛素与人胰岛素相差1个氨基酸)造成不少患者发生不良反应,并且这种提取方法产率低,胰脏的来源不足,所以制备充足的人胰岛素以满足临床的需要,一直是人们关注的重要研究课题.
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生物技术专业发展趋势及设想
目的 综述国内外生物技术专业的新进展及发展趋势,为我军生物技术专业发展寻求突破方向和理论依据.方法 分别通过Pubmed及CHKD进行近5年来相关专业英文及中文文献检索,结合文献对国内外生物技术专业的现状和发展趋势进行分析、归纳及总结.结果 生物技术在医疗卫生、农业、环保、轻化工、食品保健等重要领域对改善人类健康状况及生存环境、提高农牧业以及工业的产量与质量都正在发挥着越来越重要的作用.目前生物技术已经成为现代科技研究和开发的重点.生物技术在包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等领域取得巨大进展.我军在基因工程疫苗和基因工程制药方面取得成果,获得10余种新药证书.结论 随着生物科学及相关学科的发展,生物技术将会在越来越多的领域发挥重要作用.我军应抓住机遇,转变思路,改进方法,在生物技术领域取得更高成果.
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生物技术是食品工业发展的脊梁
生物技术又称生物工程.现代生物技术主要包括基因工程(含蛋白质工程)、细胞工程、酶工程和现代发酵工程.生物技术在其自身发展过程中,始终与食品的加工和制造有着密不可分的联系.现代生物技术的飞速发展为解决人类的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题,开辟了一条崭新途径.
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生物技术在环境卫生学的应用
生物技术是以生命科学为基础,利用生物体系(组织、细胞及其组分)及工程原理,提供商品或社会服务的一门综合型技术.主要包括基因工程(含蛋白质工程)、细胞工程、酶工程和发酵工程4个方面.生物技术的应用领域十分广泛,涉及到农业、医药卫生、能源、环境等方面,其中环境卫生学也是现代生物技术应用的重点领域之一.
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杂合酶的研究现状与发展前景
近年来,随着人们对环境和能源问题的关注,以酶为催化剂的绿色生物催化技术越来越受到重视,而酶的催化能力是影响酶能否进行工业化应用的重要因素,同时,因催化不同反应的需要,新酶开发显得十分迫切.杂合酶技术是基于已有酶资源来进行新酶的设计和开发的技术,其具有独特的优点,尤其是目前酶的表达克隆、分子筛选、人工进化、DNA序列改组和体外突变等技术已成为常规技术,为杂合酶的开发及生产奠定了基础.本文对杂合酶的构建策略、构建方法及发展前景作一综述,为其应用和开发提供参考.
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生物制品的国家批签发
生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备,用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品.包括疫苗、血清、血液制品、细胞因子、单克隆抗体体外免疫诊断制品等.
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生物工程技术及其进展
生物工程技术,包括基因工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程、细胞工程.基因工程,是在分子水平上对DNA进行操作的技术.根据人类的意愿在实验室进行DNA片段的重组,改造或生产新的DNA分子,然后使其在某种细胞中进行扩增和表达,从而生产出所需的产品.现在人们已经利用基因工程技术生产出干扰素、胰岛素、集落刺激因子、乙肝疫苗等有重要医用价值的生物工程产品.
