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以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用
目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型，筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂，获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。
方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组为模板，pET28a表达质粒为载体，将 alr 基因克隆至 pET28a ，构建pET28a：alr 重组表达质粒，表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶；通过测定反应产物 NADH 在340 nm处光密度变化速率，检测酶反应活性，构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型；应用该模型对化合物库进行筛选；测定活性化合物 IC50以及对结核分枝杆菌的 MIC。
结果成功构建了结核分枝杆菌 alr 基因的表达载体；得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶，测得该酶的比活力为13.53 kU/mg；所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高，符合高通量筛选的要求；通过对70000个化合物进行筛选，得到了5个活性较高的化合物，其中，IMB-XZ5对结核分枝杆菌的 MIC 为4~8μg/ml，且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。
结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型，应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。 -
变异链球菌丙氨酸消旋酶基因表达纯化及活性测定
变异链球菌是口腔主要的龋病病原菌.丙氨酸消旋酶通过合成右旋丙氨酸(D-alanine,D-ala)参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成过程,与细菌性疾病密切相关,近年来成为抗菌药物的又一理想靶位.D-环丝氨酸(D-cycloserine,DCS)是丙氨酸消旋酶不可逆性抑制剂.本研究通过聚合酶链反应克隆变异链球菌UA159的smu.1834c基因,经过酶切、连接,构建重组表达质粒pET-smu.1834c,诱导表达重组,纯化蛋白.测定DCS对丙氨酸消旋酶活性的抑制作用.成功诱导表达纯化smu.1834c基因编码蛋白,具有体外催化L-丙氨酸生成D-丙氨酸的活性.发现DCS能够抑制该蛋白的活性.本研究证实变异链球菌smu.1834c基因编码丙氨酸消旋酶.DCS能够抑制其活性,并且呈现一定的剂量相关性.
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丙氨酸消旋酶的研究进展
丙氨酸消旋酶(ALR)是以吡哆醛磷酸为辅酶,催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一类酶,广泛分布于低等生物,与由细菌引起的疾病密切相关.近年来ALR已成为设计抗菌药物的又一理想靶位.变异链球菌是口腔龋病主要致病菌,产酸耐酸、黏附能力和合成细胞内外多糖能力是其主要的致龋毒力.本文对ALR的分类、结构特征、生理功能及实际应用等方面进行系统阐述,为进一步研究ALR与变异链球菌致病毒力的关系,发展龋病抗菌药物候选靶标提供理论基础.
