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电化学ELISA法测定牙本质涎磷蛋白含量的研究
目的 对比2种电化学酶联免疫检测体系检测人牙本质涎磷蛋白含量的差异性.方法 选取人牙本质涎磷蛋白标准品以辣根过氧化物酶为标记酶,分别以邻联茴香胺（ODA）、邻苯二胺（OPD）为酶催化反应的底物,检测酶催化产物,对比两种检测体系下DSPP检测的线性范围及检测限的差异.结果 ODA-H2O2-HRP电化学酶联免疫检测体系与辣根过氧化物酶标记的双抗体夹心ELISA法相偶联,检测牙本质涎磷蛋白的线性范围为2.5～200.0 pg/ml,检测限为2.5 pg/ml,传统光度ELISA的检测限为5.0 pg/ml,灵敏度提高2倍；OPD-H2O2-HRP电化学酶联免疫检测体系检测DSPP的线性范围为1.0～200.0pg/ml,检测限为1.0pg/ml,比传统ELISA法的灵敏度提高5倍.结论 OPD-H2O2-HRP电化学酶联免疫检测体系较ODA-H2O2-HRP体系能更加精确地检测牙本质涎磷蛋白含量.
关键词： 正畸 牙根吸收 电化学酶联免疫检测方法 牙本质涎磷蛋白 -
牙本质涎磷蛋白电化学酶联免疫检测方法初探
目的 初探一种检测正畸牙根吸收特异性蛋白的新型电化学酶联免疫分析(ELISA)方法.方法 选取人牙本质涎磷蛋白(DSPP)标准品以辣根过氧化物酶(HRP)为标记酶、四邻联甲苯胺(OT)为酶催化反应的底物,分别用电化学ELISA法及传统光学ELISA法检测酶催化产物.对比研究两种检测方法下DSPP检测的线性范围及检测限的差异.结果 用电化学ELISA法检测酶催化产物,产物在-0.63 V(vs.Ag/AgCl)有一个灵敏的还原峰,进而可以用于游离HRP的检测.应用于DSPP标准品的检测,线性范围为0.5-800.0 pg/mL,检出限为0.5 pg/mL,是传统光度ELISA检测限的1/10.结论 电化学ELISA法可能成为检测牙根吸收特异性蛋白的新型生化检测方法.
关键词： 正畸 牙根吸收 电化学酶联免疫分析法 牙本质涎磷蛋白 -
Nfic在牙根发育中作用的研究
目的 探讨核因子I-C (Nfic)在牙根发育中的作用,进一步从分子水平探讨影响牙根发育的机制,为牙根再生提供发育阶段的研究基础.方法 选取出生后第7.5和21.5天的野生型和Nfic基因敲除(Nfic-/-)小鼠下颌第一磨牙,通过组织学HE染色观察牙根的形态学变化及应用原位杂交技术观察牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨钙素(OCN)在二者中的表达.结果 相对于野生型小鼠,Nfic.-小鼠下颌第一磨牙可以形成正常的牙冠和上皮根鞘,但是没有牙根的形成.出生后7.5天时,Nfic-/-小鼠下颌第一磨牙牙根部分的牙本质形成异常,到第21.5天牙本质异常更加明显,没有牙根发育.出生后7.5天时DSPP和OCN在野生型牙根成牙本质细胞内均有表达,而Nfic--小鼠没有表达.结论 Nfic的缺失导致小鼠磨牙牙根部成牙本质细胞的分化以及DSPP和OCN的表达异常,以致影响牙本质的形成,不能形成牙根.
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小鼠牙本质涎磷蛋白基因重组腺病毒载体的构建
目的 应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠牙本质涎磷蛋白编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-DSPP.方法 将质粒pTRE2-DSPP中的小鼠DSPP编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-DSPP,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组.筛得的病毒质粒pAd-DSPP经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒.荧光显微镜观察绿色荧光表达.扩增并纯化病毒,测定病毒滴度.结果 重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带DSPP基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,DSPP基因测序鉴定与genebank中公布序列一致.重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/ml.结论 应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-DSPP,通过该系统携带的标记基因GFP可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究牙本质涎磷蛋白在牙齿发育中的作用奠定了基础.
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龈沟液中牙本质涎磷蛋白的电化学酶联免疫吸附测定
目的 探讨电化学酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测正畸患者龈沟液中牙根吸收标志性蛋白牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)含量的可行性.方法 使用线性回归方程建立电化学ELISA和分光光度ELISA检测标准DSPP的曲线图.选取于首都医科大学口腔医学院正畸科就诊的患者20例,提取上颌双侧中切牙龈沟液,分别使用电化学ELISA、分光光度ELISA检测DSPP含量,并使用配对秩和检验比较两种方法精确性的差异.结果 电化学ELISA检测标准DSPP,线性范围为0.25～ 800.00 ng/L,检测下限为0.25 ng/L,灵敏度明显优于分光光度ELISA(线性范围为5～1 500 ng/L,检测下限为5 ng/L).两种方法检测的正畸患者龈沟液DSPP质量浓度差异无统计学意义(P=0.063).结论 电化学ELISA能更灵敏地检测龈沟液中DSPP含量.
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遗传性乳光牙本质致病基因DSPP的突变分析
遗传性乳光牙本质又名牙本质发育不全Ⅱ型(dentinogenesis imperfecta type Ⅱ,DGI-Ⅱ或DGI1)(MIM 125490)是一种常染色体显性遗传病,表现为牙齿结构异常.我们拟就新发现的一个DGI-Ⅱ家系进行牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)致病基因的突变检测,以证实是否有新的突变位点,从而进一步阐明该病基因型和表型间的相互关系.
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三氧化矿物凝聚体对人乳牙牙髓细胞增殖和分化影响的实验研究
目的 对比三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)和氢氧化钙对人乳牙牙髓细胞增殖和分化的影响,为MTA应用于乳牙活髓保存治疗提供实验依据.方法 培养原代人乳牙牙髓细胞,采用噻唑蓝比色法检测乳牙牙髓细胞生长增殖的变化;von Kossa染色观察牙髓细胞钙结节形成情况,并计数分析;使用实时荧光定量聚合酶链反应法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因的表达.结果 氢氧化钙组牙髓细胞增殖率显著低于对照组和MTA组(F=1792.301,P<0.01),大增殖率为89.7%;MTA组牙髓细胞增殖率显著高于氢氧化钙组和对照组(F=1835.065,P<0.01),大增殖率为118.4%.氢氧化钙组和MTA组牙髓细胞von Kossa染色均呈阳性,两组间钙结节计数分析差异无统计学意义(P>0.05).三组间ALP基因表达量差异有统计学意义(F=349.651,P<0.01),氢氧化钙组显著低于对照组和MTA组,MTA组显著高于氢氧化钙组和对照组;三组间DSPP基因表达量差异也有统计学意义(F=1653.001,P<0.01),氢氧化钙组显著低于对照组和MTA组,MTA组显著高于氢氧化钙组和对照组.结论 从促进乳牙牙髓细胞的增殖和分化来看,MTA比氢氧化钙更适合作为乳牙的盖髓剂.
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TGF-β1/Smad3信号途径对牙本质涎磷蛋白基因表达的调控
目的: 研究小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中TGF-β1及其信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)基因表达中的调控作用.方法: PCR法制备DSPP引物、构建带有DSPP启动子片段的萤火虫荧光素酶基因报告载体,通过瞬时转染入MDPC-23细胞后,检测报告基因活性.结果:在TGF-β1的作用下,Smad3可以发生转位表达,由细胞浆转入细胞核内.同时,过表达野生型Smad3可以显著增强TGF-β1对DSPP启动子活性的下调作用.结论: TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控;在DSPP启动子-2525～+54bp之问,存在TGF-β1/Smad3信号途径的结合位点,从而发挥对DSPP基因的调控作用.
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人牙髓细胞骨基质蛋白表达的研究进展
骨基质蛋白在骨骼和牙齿形成,以及损伤修复过程中起着重要作用.本文对骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质磷蛋白(DPP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达,以及在牙齿形成、损伤修复,对组织工程中成骨组织作用等研究进展进行了概述.
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小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子的克隆与序列分析
目的克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子片段.方法培养MDPC-23细胞,从培养的细胞中提取基因组DNA,利用设计的上下游引物,进行PCR反应.将扩增得到的DSPP基因启动子片段克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后,进一步进行DNA序列测定.结果酶切结果表明成功构建重组质粒,序列分析结果与国外报道一致.结论成功克隆获得小鼠DSPP基因的启动子片段.
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人和小鼠Dspp基因的克隆及其在成牙本质细胞中的表达检测
目的 克隆人和小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因片断,建立一种从分子水平检测成牙本质细胞分化的方法.方法 制备特异性的人和小鼠Dspp基因片断的mRNA反义探针,再将其分别与人和小鼠具有成牙本质细胞的牙胚组织进行原位杂交,检测Dspp基因表达情况.结果 本实验制备出的人和小鼠Dspp基因的mRNA反义探针在特定条件下能对各自的成牙本质细胞中Dspp基因的表达进行检测.结论 本方法可以作为一种从分子水平检测人或小鼠成牙本质细胞分化的工具.
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小鼠成牙本质样细胞的原代培养及鉴定
目的:原代培养小鼠成牙本质细胞,为诱导胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质细胞分化提供基础.方法:取材于出生1周昆明小鼠的下颌切牙牙胚,分离牙乳头组织,采用消化法对小鼠牙乳头细胞进行分离培养;用细胞平板克隆技术,挑选具有成牙本质细胞形态特征的细胞克隆,扩大培养;并从光镜观察、电镜观察和小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophoprotein,DSPP)在mRNA水平上的表达等方面进行鉴定.结果:培养细胞胞质丰富,形态呈梭形,具有较 长的细胞突起.超微结构观察,细胞富含高尔基复合体、核糖体和粗面内质网,并特异性表达DSPP mRNA.结论:该研究成功培养出小鼠成牙本质样细胞,该方法可用于成牙本质细胞的体外研究.
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dspp-LacZ转基因小鼠G0代的制备和鉴定
目的:构建小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)特异性启动子启动LacZ表达的转基因小鼠G0代.方法:用PCR方法获得DSPP编码序列上游约1.6kb的启动子序列,测序确认后,通过亚克隆方法将其与LacZ编码序列连接到同一个质粒中,构建转基因载体pTN-DPM-LacZ;将线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,移植到假孕母鼠的输卵管;仔鼠出生后4周,用PCR检测阳性小鼠.结果:注射的受精卵共503个,移卵后产仔89只,阳性12只,阳性鼠分别传代开始建系.结论:通过显微注射方法获得12只G0代dspp-LacZ转基因小鼠,正在建立中的转基因小鼠系将来可以用作研究DSPP确切表达谱的工具.
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成牙本质细胞的基本特征及其研究进展
成牙本质细胞作为牙髓细胞的主要成分,具有在牙发育期间和成熟牙内生成牙本质的功能.目前的研究多基于牙髓细胞的二维体外培养,随着对牙髓组织研究的不断深入,牙髓细胞体外三维立体模型的建立将是未来研究的热点.作者回顾了近年来对成牙本质细胞的研究情况,主要阐述了成牙本质细胞的形态、超微结构、功能、蛋白表达的特征及其研究进展和今后的研究方向.
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牙胚组织原位杂交方法学探讨
目的 探讨牙胚组织原位杂交的佳方法.方法 用牙本质涎磷蛋白DSPP特异性寡核苷酸探针,检测不同时期牙胚DSPP mRNA的表达.结果 各种牙胚的成牙本质细胞和前成釉细胞均检测到DSPP mRNA的表达,各阴性对照组均未检测到信号.结论 所用的牙胚组织原位杂交方法敏感性高,特异性高.
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核心结合因子α1对牙本质涎磷蛋白基因启动子不同片段启动活性的影响
目的:观察核心结合因子α1(cbfα1)对牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因启动子不同片段启动活性的影响. 方法:选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察cbfα1对DSPP基因启动子不同片段启动活性的影响. 结果:在MDPC-23细胞中,pcDNA3-cbfα1共转染组相对于pcDNA3共转染组,Pgl3-Enhancer-1 (-4 496～-3 499 bp)、Pgl3-Enhancer-2 (-3 519～-2 515 bp)、Pgl3-Enhancer-2-3、Pgl3-Enhancer-95 (-95～54 bp) 活性增强(P<0.05);Pgl3-Enhancer-1-3、Pgl3-Enhancer-2.6 K (-2 475～53 bp) 活性降低(P<0.05). 结论:cbfα1可以调控DSPP基因的表达,cbfα1对DSPP基因启动子不同片段的启动活性有不同的调节作用.
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正畸牙移动致牙根吸收对龈沟液中牙本质涎磷蛋白及涎蛋白表达的影响
目的 探讨正畸牙移动致牙根吸收对龈沟液中牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质涎蛋白(DSP)表达的影响.方法 将67例正畸患者按照不同力值将其分为观察组与对照组,观察组为过大力值(300 g)组,对照组为正常力值(30 g)组,对两组患者1～12周龈沟液中DSPP、DSP表达情况进行检测.结果 观察组DSPP、DSP表达明显高于对照组,两组均在7～9周表达增加,观察组灰阶分别为(232 315±5437)、(487 876±4374)、(287 673±5642),对照组灰阶为(212 147±2346)、(176 565±5327)、(134 323±2315)；并在10周后出现降低,观察组10周以及11周灰阶为(394532±4326)、(287 674±3235)；对照组分别为(87 876±4323)、(76 534±3564),11周均较10周有明显降低.结论 在牙根吸收过程中龈沟液中DSPP、DSP表达变化可能早于X线结果以及临床表现,可能作为正畸牙移动致牙根吸收检测的早期指标.
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遗传性牙本质发育不全Ⅱ型致病基因的突变检测
目的:对遗传性牙本质发育不全II型家系的牙本质涎磷蛋白基因启动子和非高度重复序列编码区进行突变分析,试图在基因水平说明其致病原因.方法:使用PCR技术扩增牙本质涎磷蛋白基因启动子区和非高度重复序列编码区,通过DNA直接测序方法对基因序列进行分析.结果:在牙本质涎磷蛋白启动子区和非高度重复序列编码区未检测到与疾病表型相关的特异性改变.但在牙本质涎蛋白编码区检测到不同个体之间具有多态性.结论:该遗传性牙本质发育不全II型家系的牙本质涎磷蛋白基因启动子和非高度重复序列编码区序列未发现导致疾病的突变.
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Smad在牙本质涎磷蛋白基因表达中的作用
目的:研究Smad蛋白在牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)基因表达中的作用.方法:细胞培养,瞬时转染和报告基因检测.结果:转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抑制DSPP基因启动子活性.过表达野生型Smad3蛋白显著增强了TGF-β1对DSPP基因表达的转录抑制,而过表达Smad3突变型蛋白则显著抑制了TGF-β1对DSPP基因启动子活性的影响.过表达Smad2野生型或突变型蛋白对TGF-β1抑制DSPP基因启动子活性无明显影响.结论:Smad3在介导TGF-b1对DSPP基因的转录调控中发挥重要的作用.
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成牙本质细胞系MDPC-23的生物学特性
目的:观察成牙本质细胞系MDPC-23的生物学特性.方法:细胞培养,细胞计数和逆转录多聚酶链反应.结果:MDPC-23为上皮样细胞形态,有多个细胞膜突起,易形成细胞结节,细胞倍增时间少于24 h.在mRNA水平证实MDPC-23表达Ⅰ型原胶原a2、碱性磷酸酶和牙本质涎磷蛋白.结论:MDPC-23保持其成牙本质细胞系的生物学特性.
