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酶标方法检测食品中O157大肠杆菌
[目的]O_(157)大肠杆菌是污染食品引起食物中毒的主要病原菌,针对进出口食品卫生监测的需要,研究1种简便、快速、准确的实验方法.[方法]采用辣根过氧化物酶标记在特异性的O_(157)大肠杆菌单克隆抗体上(1gM型),利用抗原-抗体的特异性结合反应,后通过反应的颜色来判断阴、阳性结果.[结果]本方法检出率高,每克样品中有5个细菌即可检出,48h即可报告结果.[结论]酶标方法检测食品中O_(157)大肠杆菌快速、准确检测周期短,既可提高检出率,又可节省检测时间.
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抗微囊藻毒素单克隆抗体的研制
为研制抗微囊藻毒素(Microcystins,简称MC)的特异性单克隆抗体,用MC-KLH偶联物免疫6～8周龄雌性BalB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立稳定分泌抗MC的杂交瘤细胞株.将杂交瘤细胞注射入BalB/c小鼠腹腔,生产出抗MC的单克隆抗体.得到了抗微囊藻毒素单克隆抗体细胞株,命名为G5,抗体亚类为IgG2a,亲和力常数2.9×10-11 mol/L,分子量150 KD,加标回收率在81.5%～125.0%之间,与其他结构类似物的交叉反应率＜1%.筛选出的抗微囊藻毒素单克隆抗体具有较好的特异性.
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抗玉米赤霉烯酮单克隆杂交瘤细胞系的建立及单抗生产
为快速检测食品中的玉米赤霉烯酮(Zearalenone以下简称ZEN),建立了抗ZEN的单克隆杂交瘤细胞株.用ZEN-BSA偶联物免疫8～10周龄雌性BalB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过4～5次亚克隆建立了稳定分泌抗ZEN抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Z2A4、Z8D6.将上述2种杂交瘤细胞分别注入BalB/c小鼠腹腔,获得含抗ZEN单克隆抗体的腹水.将腹水用饱和硫酸铵盐析法纯化,得到Z2A4、Z8D6单克隆抗体.经鉴定,其亚类为IgG,抗体腹水效价Z2A4和Z8D6分别为1:1.6×106和1:3.2×106;分子量均为150000(150kD);参考工作浓度分别为1:40000和1:100000;纯化后抗体IgG含量分别为34和39 mg/ml;抗体与其它霉菌毒素无交叉反应(交叉反应率＜1%),具有较高特异性;抗体亲和力常数Z2A4和Z8D6分别为5.52×108和4.68×109 mol/L.
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总黄曲霉毒素ELISA定量检测方法的研制
为敏感、特异和快速地检测食品中总黄曲霉毒素的污染水平,在抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的基础上,研制了间接竞争ELISA检测方法,包被抗原为AFB1-BSA,包被量为0.0625μg/ml,抗体工作浓度为1:1.6×106.该方法对黄曲霉毒素B+G标准品的低检出浓度为0.13 ng/ml,对样品的低检出量为1.50μg/kg.校正曲线的线性范围为0.26～20.00ng/ml,线性方程y=-0.4463x+0.353 2(R2=0.9915);对黄曲霉毒素B+G 50%的抑制浓度为2.08 ng/ml;对玉米2个加标水平的平均回收率分别为94.56%和112.05%,对花生2个加标水平的平均回收率分别为87.50%和85.60%.该方法所用抗总黄曲霉毒素单克隆抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应率分别为100%、57.5%、104%和19%,与其它真菌毒素无交叉反应.
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(鱼屯)毒鱼类中河(鱼屯)毒素直接竞争抑制性酶联免疫吸附试验测定方法的研究
为检测(鱼屯)毒鱼类中的河(鱼屯)毒素,建立了用抗河(鱼屯)毒素单克隆抗体检测河(鱼屯)样品中河(鱼屯)毒素的直接竞争抑制性酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.结果表明,直接ELISA法较间接ELISA法灵敏,低检出浓度为0.1 ng/mL(每检测孔0.01 ng),线性范围为5～500 ng/mL,方法的加标回收率为73.0%～118.0%.本法与传统的小鼠生物试验相比,两种方法的测定结果之间在统计学上差异无显著性(配对t检验,P>0.1),并具有良好的相关性(r=0.944).对来自江苏省东海和长江水域的河(鱼屯)样品的毒力进行了测定,结果表明本方法简单、快速、灵敏,完全可以满足实际工作的需要.
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苏丹红Ⅰ胶体金检测试纸条的研制
目的 研制苏丹红Ⅰ胶体金快速检测试纸条.方法 用柠檬酸三钠法制备20 nm胶体金颗粒,以抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体进行标记,组装胶体金试纸条,并进行测试.结果 实验室条件下,试纸条能够快速检测到食品中的苏丹红Ⅰ,低检测浓度为50ng/L.结论 与其他检测方法相比,该检测方法快速、简便.
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唾液酸粘蛋白单抗5E2、6C10的制备、鉴定及对胃肠癌糖链表达规律的初步探讨
目的寻找识别新的肿瘤相关粘蛋白抗原的单抗,为阐明胃肠癌粘液糖蛋白的表达规律进而为胃肠肿瘤的预后、分型等提供参考依据.方法以牛颌下腺粘蛋白(BSM)为免疫原免疫小鼠,以免疫脾细胞与Sp2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株,用有限稀释法克隆化,间接ELISA及间接ELISA结合神经氨酸酶消化筛选克隆.以聚丙烯酰胺凝胶电泳,免疫印记(Western-Blot),间接ELISA结合热处理、胰蛋白酶消化、过碘酸氧化以及稀碱处理去除O-乙酰基等方法进行抗体的鉴定.以免疫组化LSAB法观察两株抗体对68例胃癌和55例肠癌粘蛋白糖链抗原的标记情况.结果两株抗体分别命名为5E2和6C10,Western-Blot显示两株抗体均只与分子量大于220kDa的PAS染色阳性条带反应.两株单抗与BSM的反应都对热处理、胰蛋白酶消化、过碘酸氧化、神经氨酸酶消化等处理敏感.5E2还对稀碱去除O-乙酰基敏感,6C10可以部分吸收sialyl-lewisa.单抗6C10在早期胃癌及癌旁的阳性率分别为5.5%和52.9%,进展癌及其癌旁的阳性率分别为14.0%和22.9%;在结肠癌及其癌旁的阳性率分别为30.9%和83.8%.单抗5E2在胃早期癌及其癌旁的阳性率分别为16.7%和41.2%,在进展癌及其癌旁的阳性率分别为42.0%和37.5%;在肠癌及其癌旁的阳性率分别为69.1%和91.9%.结论初步认为单抗5E2和6C10是两株以不同的唾液酸化多糖为抗原表位的单抗,单抗5E2可以用于研究肠癌O-乙酰化唾液酸的组织分布,单抗6C10有望成为研究胃自然史中粘蛋白表达规律及其应用的新工具.
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单克隆抗体生物素-亲和素系统诊断日本血吸虫病的研究
目的探讨TM5.28单克隆抗体-生物素-亲和素系统检测日本血吸虫循环抗原及其诊断效果.方法制备TM5.28抗日本血吸虫肠相关抗原单克隆抗体,建立单抗-生物素-链霉亲和素检测系统,对各类血清(50份急性血吸虫病人、224份慢性血吸虫病人、49份晚期血吸虫病人;46份血吸虫病治疗前、治疗后6个月和治疗后1年的连续追踪病人;19份华支睾吸虫病人;31份肺吸虫病人;23份乙型肝炎病人;100份正常人)进行检测.结果检测系统对慢性血吸虫病人和正常人检测的敏感性和特异性分别为83.1%和94.0%,Youden指数为0.771;对急性血吸虫病人的检出率94.0%;对肺吸虫、华支睾吸虫和肝炎病人的交叉反应为12.9、15.8和13.0%.血吸虫病人治疗后6个月和1年的阴转率分别为43.9%和62.1%,其OD值几何均数从治疗前的0.172下降到治疗后6个月的0.081和1年的0.068,下降了60.30%.轻、中感染度慢性血吸虫病人的检出率相近,分别为83.9%和82.1%,重感染度病人的检出率高达90.00%.结论该系统对血吸虫病人检测显示了较高的诊断效能和化疗后阴转率,对人群感染状况的判定和个体诊断有一定的应用价值,为日本血吸虫病的免疫诊断和疗效考核提供了一种可行方法.
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多发性骨髓瘤高钙血症的护理
多发性骨髓瘤是一种浆细胞恶性增殖性疾病,临床表现多种多样,可出现骨痛、病理性骨折、贫血,以及因骨髓瘤细胞产生大量单克隆免疫球蛋白而出现感染、高钙血症、肾脏病变等.据报道多发性骨髓瘤患者病程中合并高钙血症的发生率达20%～40%[1].
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恶性淋巴瘤单克隆抗体的制备和初步鉴定
采用人恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞作为免疫原免疫BALB/C小鼠, 按常规方法融合并经间接ELISA法筛选, 成功地制备了1株抗Raji细胞单克隆抗体(MAb), 命名为SZ138.用琼脂糖双扩散鉴定其为IgG1类, ELISA法测定其腹水效价为1:3.2×104.MAb流式细胞仪检测表明, 该抗体与Raji和Daudi呈阳性反应;与外周红细胞、白细胞(包括淋巴细胞和中性粒细胞)、未活化血小板、内皮细胞株ECV呈阴性反应.免疫组化SP法显示, MAb SZ138识别的抗原在胃肠道的腺体和肝脏有所表达, 而在心、脑、扁桃体、脾、脂肪组织、动脉血管壁、神经节、横纹肌、平滑肌等组织不表达或表达很低.Western blotting分析显示, MAb SZ138可特异识别还原条件下相对分子量为170kD的蛋白多肽.结果提示: MA SZ138对恶性淋巴瘤的诊断和治疗可能具有一定的临床意义.
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尿胰蛋白酶原-2在急性胰腺炎检测中的意义C
临床上诊断急性胰腺炎常常检测血/尿淀粉酶，但该检测的敏感性和特异性不尽人意。近来，芬兰Medix Biochemica公司推出层析法尿胰蛋白酶原-2快速检测试纸，被许多专家推荐为急性胰腺炎筛选试验［1，2］。我们将层析法尿胰蛋白酶原-2快速检测试纸用于急性胰腺炎诊断，并与血/尿淀粉酶检测进行比较。1 材料和方法 69例患者(46例男性，23例女性)为1999年10月～2000年10月因急性腹痛于邮电总医院急诊室就诊患者，平均年龄42岁(18～67岁)。尿胰蛋白酶原-2测定：采用芬兰Medix Biochemica公司生产的actim胰腺炎检测试纸(cat: 32702 ETAC)。根据说明操作，将试纸浸入尿标本中，胰蛋白酶原-2即与胰蛋白酶原-2单克隆抗体标记的蓝色乳胶粒子结合，然后沿硝酸纤维膜向上移动，与膜上包被的另一胰蛋白酶原-2单克隆抗体结合，会出现一条蓝色线，同时出现一条蓝色参照线，则判为阳性。血/尿淀粉酶测定使用a-Amylase-EPS Fluid(5+1)试剂盒(Centronic Gmbh)。血/尿淀粉酶正常参考值分别为220和1000U/L。结果进行χ2检测。2 结果 69例患者中有21例(男性13例，女8例，年龄范围18～67岁，平均43岁)诊断为急性胰腺炎，其中19例尿胰蛋白酶原-2检测阳性(敏感性95.2%)。48例非急性胰腺炎患者中有2例尿胰蛋白酶原-2检测阳性(特异性95.8%)，其中1例为急性胆囊炎，另一例为慢性胰腺炎；血/尿淀粉酶分别有15及17例超过正常参考值，测定的敏感性分别为62.0%及71.1%，显著低于尿胰蛋白酶原-2检测(χ2分别为4.73，4.47，皆P＜0.05)。特异性分别为83.3%及81.3%(χ2分别为4.02，5.03，皆P＜0.05)。
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单克隆人胰腺干细胞的形态和蛋白表达特征
目的 研究1例单克隆人胰腺干细胞系的细胞形态和表达特性.方法 10例4～5月龄流产胎儿胰腺组织,胶原酶消化.原代细胞DMEM培养,胰蛋白酶消化传代.在传代中逐渐纯化胰腺干细胞.克隆环筛选单克隆人胰腺干细胞,扩增培养.活力较好的细胞液氮冷冻保存.采用HE和Giemsa染色,观察单克隆人胰腺干细胞的形态特征;通过透射电镜分析其超微结构.用免疫组织化学反应和RT-PCR方法,检测其蛋白水平和mRNA水平的表达特征.结果 1例来源于4月龄男性胎儿的单克隆人胰腺干细胞建系,传50代.液氮保存细胞1×109个以上.单克隆人胰腺干细胞完全贴璧时呈多角形上皮样,单核,圆形或椭圆形,单、双或多核仁.细胞核质比大.线粒体、内质网等细胞器均不发达,胞质内无分泌颗粒,属于发育早期的胰腺上皮样细胞.共表达胰肠同源域因子1(pdx1)、胰高血糖素、巢蛋白及角蛋白19(CK19),不表达胰岛素、周期蛋白34(CD34)、CD44及CD45.转录表达pdx1、胰高血糖素及巢蛋白的mRNA,不转录表达胰岛素.结论首次证实1例共表达pdx1、胰高血糖素、巢蛋白及CK19蛋白的单克隆人胰腺干细胞系.
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稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体GluA1亚基单克隆细胞株的构建
目的 构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体GluA1亚基的细胞株.方法 PCR扩增GluA1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV.0-绿色荧光蛋白(GFP),采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒.嘌呤霉素抗性筛选细胞,挑选单克隆细胞株用Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光和全细胞膜片钳鉴定GluA1的表达与功能.结果 菌落PCR鉴定扩增产物与GluA1分子量(2724 bp)一致,经测序插入慢病毒载体序列与GluA1序列一致;慢病毒感染并抗性筛选的HEK293T细胞经Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光实验证明,GluA1在过表达GluA1组的HEK293T细胞正确表达,空载体组不表达.单克隆挑选的稳定细胞株免疫荧光染色显示,各细胞膜表面GluA1蛋白表达相对一致.单克隆细胞在电压钳模式下,细胞外液加10 mmol/L谷氨酸诱导,空载体组检测不到电信号,而过表达GluA1组可记录5～ 40 pA电信号.结论 成功构建了稳定表达AMPA受体GluA1亚基的HEK293T细胞株.
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抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备高特异性和高亲和力的抗人肝细胞肝癌(HCC)的单克隆抗体(MAb),为肝癌的靶向诊断及治疗提供依据.方法 用人肝细胞肝癌细胞株HepG-2经"尾静脉.脾脏联合方法"免疫BALB/c小鼠.取其脾脏细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合,经ABC免疫组化初筛抗体、有限稀释法亚克隆化、染色体分析、免疫组化鉴定抗体特异性、共聚焦显微镜扫描技术(LSCM)进行组织定位、ELISA分析鉴定抗体的亚型及荷人肝癌裸鼠牛物分布等进一步鉴定其生物学特性.结果 (1)获得一株分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤;该抗体与肝癌组织结合的特异性高达98.5%(67/68);(2)注射131I-MAb后瘤部位放射性分布有逐渐增加的趋势,血液、肝脏、肾脏和肺脏放射性有逐渐减低的趋势,72 h肿瘤/血液和肿瘤,肝脏比值分别为15.76±3.28和7.23±1.70.结论 成功制备抗人肝细胞肝癌的单克隆抗体,具有较好的肝癌特异性、靶向性,对原发性肝癌有潜在的诊断及治疗作用.
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兔单克隆Idl抗体在人类乳腺癌中的表达
Id1蛋白是具有"螺旋-环-螺旋"结构的转录因子起负调节作用的一组家庭蛋白,目前已知它可以调控不同组织中不同细胞的分化.
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疟疾检测技术研究概况及其评价
疟疾检测技术主要包括病原形态学检查、血清免疫学检查、DNA探针检测和PCR检测.以形态学检测为主要内容的血涂片显微镜检查,是一种传统的检测技术,迄今仍是多数基层医疗单位主要或唯一的诊断手段,其检测敏感度可达到10～20个原虫/μl血[1],方法简便、经济,适于基层应用;缺点是结果判断受检验人员镜检水平和视力疲劳程度等因素的影响,对于低原虫血症或混合感染病例容易漏诊或误诊,且检查效率不高.一个镜检员每天多只能检查70～80张血片[2].免疫学诊断技术和单克隆抗体检测技术的发展,特别是20世纪80年代以后分子生物学技术的研究,为疟疾诊断提供了良好的技术手段.
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腹水型单克隆抗体纯化方法的研究
目的：比较不同纯化方法对腹水型抗体的纯化效果，探索出适合实验室抗体生产的纯化方法。方法制备的 IgG1单克隆抗体腹水（4-D10）分别利用两步硫酸铵沉淀法（AS 法）、辛酸-硫酸铵沉淀法（CA-AS法）、辛酸-硫酸铵沉淀法联合 DEAE 阴离子交换层析法与辛酸-硫酸铵沉淀法联合蛋白 G 亲和层析法纯化处理后，经蛋白纯度、回收率、抗体免疫活性鉴定分析后，比较不同的纯化方法对腹水型抗体的纯化效果。结果① AS 法的蛋白纯度为25%，低于 CA-AS 法（44%）；AS 法回收率为63%，高于 CA-AS 法（41.8%）；比较抗体效价表明，AS 法（1.024×106）与 CA-AS 法（1.024×106）两者相当。②粗提后纯化效果表明，蛋白 G亲和层析法回收率明显降低，DEAE 纯品虽纯度略低，但回收率较高，且效价（5.12×105）高于蛋白 G 亲和层析法（1.28×105）。结论 CA-AS 联合 DEAE 离子交换法是适合实验室生产单抗的低成本、纯化效果和回收效果较佳的方法。
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从人源全合成抗体库中筛选到抗人干扰素α1b单链抗体
目的 研究开发人源抗huIFN-α的基因工程抗体,为系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)的治疗提供有效的抗体药物.方法 本研究利用噬菌体表面展示技术,以纯化的人干扰素α1b(huIFN-αlb)和人干扰素α2b(huIFN-α2b)蛋白为抗原从人源全合成抗体库中筛选抗huIFN-α的基因工程单链(single chain variable fragment,scFv)抗体,通过phage-ELISA对噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证.将单链抗体基因克隆到原核分泌表达载体pET22b上在大肠杆菌BL21(DE 3)中表达,通过Westem blot检测单链抗体的分泌表达,并通过ELISA对单链抗体的结合特异性进行验证.通过金属螯合亲和层析纯化单链抗体,并用Western Blot对单链抗体的结合特异性进行鉴定.结果 经过3轮富集筛选,获得100株对huIFN-α1b有特异性结合的噬菌体单链抗体.对得到的86株克隆的测序分析表明,共有9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体,有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族.获得了5株稳定且特异针对huIFN-α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗.这5株抗体在BL21(DE3)中分泌表达,有3株单链抗体能特异性结合huIFN-α1b而与无关抗原无交叉反应.结论 通过噬菌体表面展示技术,从人源全合成抗体库中筛选得到3株稳定且特异结合huIFN-α1b的人源治疗用基因工程单克隆抗体.
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抗人CD30单克隆抗体的制备和活性研究
目的 制备抗人CD30单克隆抗体并进行活性研究,为其作为抗体偶联药物的靶向运输载体提供研究依据.方法 通过基因工程技术构建真核表达载体pIZDHL-CD30-IgG,将质粒稳定转染CHO/dhFr-细胞并筛选,获得稳定表达anti-CD30-IgG抗体的细胞株并纯化抗体,通过HPLC检测其纯度.ELISA、Biacore和流式细胞术实验检测anti-CD30-IgG的亲和活性;免疫荧光共聚焦实验观察其在肿瘤细胞的内吞情况;利用小动物活体成像技术研究抗体在NOD/SCID鼠移植瘤模型中的靶向性.结果 成功构建了anti-CD30-IgG抗体的表达载体,并筛选出稳定表达的单克隆细胞株CHO-CD30-IgG,纯化后的抗体anti-CD30-IgG纯度达到98％以上.Anti-CD30-IgG与重组人CD30抗原具有很好的亲和活性,亲和常数为4.15×108 L/mol,其可通过肿瘤细胞表面CD30受体介导的内吞进入细胞.在NOD/SCID小鼠L540和Karpas299移植瘤模型中,anti-CD30-IgG可以选择性地富集并滞留在肿瘤部位.结论 Anti-CD30-IgG对抗原和肿瘤细胞具有高亲和性和特异性,并且可被内吞进入肿瘤细胞内部,在小鼠体内可选择性靶向并且长时间滞留在肿瘤部位,可作为抗体偶联药物中"弹头"部分的靶向输送载体.
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临床样品中不同蚀斑表型单克隆轮状病毒VP8基因序列分析
轮状病毒属于呼肠孤病毒属，为没有包膜的双链 RNA病毒，人畜禽共患，其感染每年引起约50万婴幼儿死亡[1]。宿主细胞表面的寡糖分子是一个重要的因子，它们与轮状病毒和细胞的相互识别及吸附有关，同时还影响了病毒的宿主特异性[2]。研究表明，轮状病毒外壳蛋白 VP4的糖类结合区域位于 VP4的亚基 VP8，其与细胞表面寡糖分子的相互作用使病毒识别并吸附到细胞表面。轮状病毒对细胞的感染是通过 VP8与细胞表面多糖，尤其是与内部唾液酸（N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids，Sia）的结合完成的[3]。人株、猴株以及猪轮状病毒 VP8基因序列在识别细胞表面唾液酸或其衍生物甲基-α二氮乙酰神经氨酸的位点有显著的差异[1]，影响病毒在细胞培养上的敏感性和适应性。
