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结核分支杆菌抗原ESAT-6基因真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定
目的:用结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6基因构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-ESAT-6,并鉴定其在真核细胞(COS-7)中表达的蛋白.
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SARS冠状病毒S蛋白高保守性C区重组核酸疫苗肌肉免疫和黏膜免疫的研究
构建含SARS冠状病毒S蛋白基因高保守性C区基因的真核表达重组质粒pCDNA-Sc作为DNA疫苗,其中C区位于SARS冠状病毒S蛋白S1亚基基因片段的811~1221bp区域的病毒外部羧酸端多肽肽段.
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端粒酶核酶真核表达质粒pBBS212Rz的构建与鉴定
目的:构建含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达质粒pBBS212Rz,为以端粒酶为靶点的基因治疗消化系肿瘤研究奠定基础.方法:将人工合成的端粒酶核酶基因通过基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体pBBS212中.根据260nm的紫外光吸收值计算重组质粒pBBS212Rz浓度.结果:端粒酶核酶基因成功地定向插入了载体pBBS212,经酶切后用聚丙烯凝胶电泳鉴定确认.重组质粒浓度为1.77 g/L.结论:成功构建了含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达重组质粒pBBS212Rz.
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周期型马来丝虫 M29表位基因原核及真核表达载体的构建
淋巴丝虫病是一种严重危害人类健康的虫媒传染病,流行于81个国家和地区[1-2]。全球超过7600万人隐性感染,并伴有内部淋巴系统和肾脏系统的隐性损伤;约4400万人反复感染,并伴有肾功能异常[3-4]。虽然淋巴丝虫病的防治在全球范围内已取得巨大成绩,但由于全球气候变暖,传播媒介广泛存在,人口流动加快、大量外来流动人口的涌入,尤其是沿海经济发达地区,外来务工者中有较多微丝蚴阳性者,外源输入的可能性及丝虫病流行的危险因素始终存在。在丝虫病传播阻断后,残存传染源的微丝蚴血症可持续20年以上,中等密度和较高密度微丝蚴血症者仍可传播丝虫病[5-6]。马来丝虫(Bm)生活史复杂,筛选有效的保护性抗原并有机结合以获得佳保护效应是抗丝虫疫苗研究中的重要内容[7-8]。肌球蛋白是一种广泛存在于真核生物中的功能蛋白,是一种早期免疫显性分子,具有较显著的免疫原性,在丝虫整个生活史中起重要作用[9]。本研究以我国流行的周期型 Bm 为研究对象,通过免疫信息学方法,预测分析周期型 Bm 肌球蛋白的 T 淋巴细胞表位和 B 淋巴细胞表位,构建周期型 Bm M29表位基因原核和真核表达重组质粒,为进一步的免疫学实验打下基础。
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弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究
用pVAC-GRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护性作用.大量制备pVAC-GRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠三次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照.于末次免疫4周后每组各取5只作免疫指标测定(包括MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群数目、双夹心ELISA法测定细胞因子IFN-γ及IL-4的含量、间接ELISA法测定IgG抗体滴度),其余的作攻毒试验后观察小鼠存活情况.脾淋巴细胞增殖各组间无显著差异(P>0.05);T细胞亚群分析,pVAC-GRA4组CD3+CD4+T细胞无明显改变(P>0.05),CD3+CD8+T细胞数明显增加(与pVAC对照组比P<0.05,与空白对照组比P<0.01),其CD3+CD4+/CD3+CD8+比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);免疫鼠细胞因子IFN-γ及IL-4检测,pVAC-GRA4免疫组IFN-γ比对照组略高,但差异不显著(P>0.05),而IL-4的检测值各组间无明显变化(P>0.05);pVAC-GRA4组虽可诱导产生GRA4蛋白抗原特异性的IgG抗体,但抗体滴度不高;抗攻击感染结果,pVAC-GRA4免疫组小鼠的存活率明显高于两个对照组,其死亡小鼠的平均存活天数与空白对照组相比,差异显著(P<0.05).用pVAC-GRA4重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导产生以细胞免疫为主的免疫应答及对弓形虫RH强毒株攻击感染的部分保护性作用.
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弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达
构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在HEK-293细胞中的表达情况.采用PCR方法自弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-GRA4重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入HEK-293细胞,RT-PCR法检测mRNA表达情况,Western-blot法鉴定表达产物.从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段,成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4;转染GRA4的HEK-293细胞,RT-PCR检测可见一条约987bp的目的条带,表达产物经Western-blot鉴定,其分子量约为41kD,能被pET-GRA4重组蛋白免疫血清所识别.构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中表达,为弓形虫疫苗的进一步研究打下基础.
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Eg95基因疫苗不同免疫途径的体液免疫应答比较
目的:用构建的细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-Eg95,直接免疫小鼠,观察其所诱导的体液免疫反应。方法:碱裂解法大量提取重组质粒,采用肌肉注射、静脉注射、皮下注射3种免疫途径和不同剂量的重组质粒免疫小鼠,用ELISA法测定小鼠血清抗体滴度。结果:在相同剂量下,重组质粒免疫小鼠刺激机体产生抗体反应强度的免疫途径依次为肌肉、皮下和静脉注射,阳性反应率由高到低依次为皮下、肌肉和静脉注射。以肌肉注射方式免疫小鼠的抗体反应维持时间较长,主要产生IgG2a为主的抗体.结论:用pcDNA3-Eg95重组质粒DNA免疫小鼠可以产生体液免疫应答。