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肿瘤标志在良恶性胸水鉴定的应用
目的:探讨胸腔积液肿瘤标志CEA、CA19-9、CA12-5、NSE、CYFRA21-1的检测在鉴别结核性胸积液与癌性胸积液的意义.方法:应用生物素-链霉亲和素双抗夹心法测定.
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人血清生长激素化学发光免疫分析方法的建立
建立链霉亲和素-生物素双抗体夹心化学发光免疫分析法(CLIA)测量人血清生长激素(GH),并进行临床应用检测.以链霉亲和素包被微孔板,生物素化一株GH单克隆抗体(McAb),辣根过氧化物酶标记另一株McAb,校准品与国家标准品进行溯源,建立GH CLIA法,进行性能参数测试,与国外试剂盒比对.结果表明本法线性范围为2.0～150.0μIU/mL,回收率为95.5%,灵敏度0.02μIU/mL,批内、批间CV分别为3.2%～7.2%和3.8%～8.2%,与hPRL、hLH和hTSH叉反应率分别为3.6%、0.05%和0.02%,与hFSH、hCG无交叉反应.本方法与国外同类试剂盒检测187份血清,相关系数为0.9837.37℃,7天热稳定性良好.本方法各项指标均满足临床检测要求,达到国外同类水平,便于临床检验应用.
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链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化
目的 构建链霉亲和素(streptavidin,SA)和自噬相关基因(Beclin 1)重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白(含His标签)在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.
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结核病患者外周血T细胞亚群、mIL-2R与sIL-2R的测定
采用生物素-链霉亲和素(BSA)系统检测85例结核病患者T细胞亚群及经PHA诱导前后其mIL-2R表达水平,用ELISA法测定其血清sIL-2R水平,同时选取健康献血员25名为正常对照,操作按说明书进行.资料分析采用t检验.
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链霉亲和素化载紫杉醇相变型PLGA纳米粒的制备及体外超声显影
目的 制备链霉亲和素化载紫杉醇相变型PLGA纳米粒(PTX-PLGA-SA/PFPs),并观察其体外低强度聚焦超声(LIFU)致相变后超声增强显影特性.方法 采用单乳化法(O/W)制备载紫杉醇相变型PLGA纳米粒,高效液相色谱法检测紫杉醇包封率;碳二亚胺法连接链霉亲和素(SA),共聚焦激光显微镜观察二者连接情况,流式细胞术检测二者链接率;体外LIFU致相变观察超声增强显影情况.结果 制备的纳米粒粒径为(322.2±85.6)nm,表面电位(-5.66±3.46)mV.紫杉醇的包封率及载药量分别为(71.56±6.51)％、(6.57±0.61)％,与链霉亲和素的连接率为(97.16±1.20)％.LIFU功率7.5W作用3 min时可明显增强该纳米粒在体外的B-mode及造影模式下的超声显影.结论 成功制备了PTX-PLGA-SA/PFPs纳米粒,其紫杉醇包封率高、链霉亲和素连接率高,体外声致相变后可显著增强超声显影.
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结合链霉亲和素的高分子造影剂的制备及其初步应用
目的 制备一种结合链霉亲和素的高分子超声造影剂,并与生物素化抗体结合,考察其体外寻靶能力.方法 采用双乳化法制备高分子材料PLGA-COOH超声造影剂;并用碳二亚胺法将造影剂与亲和素耦联,制备出结合链霉亲和素的高分子超声造影剂.检测该造影剂一般特性;采用红外与免疫荧光检测亲和素与PLGA-COOH超声造影剂连接的情况.检测生物素-亲和素技术使该造影剂与生物素化抗体结合后其体外寻靶能力.结果 红外检测与免疫荧光检测显示亲和素被成功地连接在高分子造影剂上,并存在活性.体外寻靶实验显示,与生物素化单抗结合后的靶向高分子造影剂较多并牢固地聚集到肝癌细胞表面.结论 成功制备了结合链霉亲和素的高分子超声造影剂,该造影剂与生物素化抗体结合后于体外对肝癌细胞具有较强的亲和力.
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应用链霉亲和素-生物素偶联FITC法检测肠道病毒71型方法学实验探讨
手足口病是由多种肠道毒引起的传染病,多发生于婴幼儿.由于其主要临床表现是发热和手、足、口腔等部位出现疱疹,因此被称为手足口病.
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可溶性白细胞分化抗原137检测法及初步临床应用
白细胞分化抗原137(CD137)是活化淋巴细胞的膜表面共刺激分子,与配体结合后,能促进T淋巴细胞进一步活化与增殖[1].近来Michel等[2]发现一种分子量为16 000的人可溶性CD137(sCD137)分子,由活化淋巴细胞分泌.本研究建立了一种检测sCD137链霉亲和素-酶联免疫吸附试验(SA-ELISA),用以检测类风湿性关节炎(RA)患者血清中的sCD137含量,并探讨其在RA中的临床应用.一、材料和方法
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细胞周期蛋白D1 RT-PCR ELISA的建立及其初步应用
目的:建立一种灵敏、特异和简便实用的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA表达水平的检测手段.方法:生物素标记Cyclin D1 5'端引物,PCR DIG Labeling Mix取代dNTP,RT-PCR终产物置于链霉亲和素包被的ELISA板中孵育,洗涤、显色后,自动酶联检测仪测A45onm值.常规RT-PCR方法作对照.检测对象包括Cyclin D1表达细胞系SGC7901,转染反义Cyclin D1基因的SGC7901D1AS细胞及转染空载体的SGC7901neo细胞,原发性胃癌组织30例、胃癌旁和正常胃黏膜组织20例,胃良性病变组织22例.结果:RT-PCR ELISA与RT-PCR琼脂糖电泳检测结果吻合,所测得的A450nm值与Cyclin D1特异性基因片段的丰度和检测细胞数量有一很好的对应关系.SGC7901胃癌细胞转染Cyclin D1反义基因后,Cyclin D1mRNA表达显著降低(P＜0.05).Cyclin D1 mRNA在胃良性疾病起即开始明显升高(P＜0.05).在胃癌各组中,进展期胃癌伴转移组的Cyclin D1 mRNA表达水平显著高于其他两组(P＜0.05).结论:本文建立的Cyclin D1 RT-PCR ELISA可作为一种侯选的、较为简便和半定量的cyclin D1 mRNA检测方法.致谢:第三军医大学数学教研室罗明奎主任在本课题结果统计分析的工作中给予了无私的指导和帮助.
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上皮型钙粘附因子在子宫内膜的表达及其与不孕的关系
子宫内膜对胚泡的容受性，在胚泡着床中起关键作用。有关研究发现，属于钙依赖性粘附分子家族的钙粘附因子(cadherin)，在子宫内膜月经周期各阶段都有表达［1-4］。本研究旨在探讨上皮型钙粘附因子(E-cadherin)在子宫内膜的表达及其与不孕的关系。 一、资料与方法 1．研究对象：本研究病例为第一军医大学南方医院妇产科1999年门诊病例，共72例：（1）正常妇女37例（正常组），22～35岁，月经周期规律，近3个月内未服用任何激素类药物。（2）不孕妇女35例（不孕组），25～35岁。按不孕原因分为输卵管性不孕9例，黄体功能不全性不孕15例，不明原因不孕11例。均行诊断性刮宫术获取子宫内膜。 2．方法：（1）获取标本：获取的子宫内膜标本立即用10%缓冲甲醛固定，时间6～24 h，温度4℃，常规脱水及石蜡包埋。每份标本常规行HE染色，按白希清［5］的标准行子宫内膜组织学分期，两组妇女具体分期见表1。其中植入窗期（即分泌中期），相当于月经周期第20～23天。(2)免疫组织化学检测：载玻片涂以防脱片剂，切片厚度5 μm，经脱蜡、水化等，进行抗原修复处理。本研究一抗选用小鼠抗人上皮型钙粘附因子单克隆抗体（美国Zymed公司产品），采用链霉亲和素-生物素（strept avidin-biotin complex,SABC）标记法，试
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应用免疫一PCR法对维持性血透患者乙肝进行检测
目前乙型肝炎仍然是血透患者的主要并发症之一.由于检测方法的敏感性不同,血清中HBsAg含量低的乙肝感染者易出现漏诊,引起医源性感染.为了减少乙肝交叉感染,提高乙肝的检测的阳性率,本试验利用链霉亲和素将抗体和DNA偶联起来,建立HBsAg免疫-PCR检测技术.
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核-壳型磁性纳米微球的制备及在核酸提取中的应用
目的:改进传统的溶胶-凝胶方法而制备得表面包裹SiOZ的核-壳型磁性纳米微球,然后将表面连有链霉亲和素的磁性纳米微球应用于生物样品中核酸的分离.方法:用透射电子显微镜(TEM)、红外光谱(FTIR),X射线衍射仪(XRD)和磁强计(VSM)对得到的纳米微球进行表征,后用电泳验证核酸.结果:表明制备得到的磁性纳米微球表面包裹Si02,粒径均匀,分散性良好,并且具有超顺磁性和较大的比饱和磁化强度.电泳结果表明磁性微球可以很好地从细胞悬液、组织、血液等样品中分离得到高质量的核酸.结论:该方法简便快速有效,其过程不需要使用任何有毒溶剂,操作简单.
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抗癌胚抗原嵌合重链抗体与核心链霉亲和素融合基因在昆虫细胞中的表达
将抗癌胚抗原嵌合重链抗体与核心链霉亲和素融合基因插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTa中，经大肠杆菌DHl0Bac体内转座，产生重组杆状病毒pBacHTa-VH-Cr3-CS。将其转染粉纹夜蛾Tn-5B1--4细胞，经扩增后在细胞内进行表达。SDS-PAGE分析结果表明，在粉纹夜蛾Tn-5B1-4细胞中都表达产生一条特异性蛋白质，其相对分子质量约为75 000左右，以Western blot分析表明，该特异条带即为Vh-Cr3-CD蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，以HRP标记的生物素作为抗体进行蛋白质印迹在相对分子质量75 000处可见表达条带，表明融合蛋白能特异性的与生物素结合，RIA表明重组杆状病毒表达产生的VH-Cr3-CS蛋白能与CEA有较高的结合力。
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抗癌胚抗原单链抗体与核心链霉亲和素基因的融合及在大肠杆菌的表达
制备抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体的单链抗体,在保留抗原抗体结合位点的同时有效降低抗体的分子量不仅可减少人抗鼠抗体反应(HAMA),而且适合放射免疫显像.为纯化及核素标记抗体,将单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合并在大肠杆菌得到高效表达,表达量占菌体总蛋白的24%.SDS-PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为41kD,与其基因编码蛋白质的理论推算值相符.表明融合蛋白能特异性地与生物素结合,RIA表明表达产物具有结合其特异性抗原CEA的能力,以HRP标记的生物素作为抗体进行蛋白质印迹在41kD处可见表达条带.说明表达物不仅能与生物素结合且能特异性地与CEA结合.
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Beclin1进化保守区-SA融合蛋白偶联生物素-A10适配子制备PSMA靶向系统及其对前列腺癌细胞的抑制
目的:构建链霉亲和素(streptavidin,SA)与Beclin1进化保守区(evolutionary conserved district,ECD)融合蛋白原核表达载体,将融合蛋白与生物素-前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性适配子A10偶联制备PSMA靶向系统,鉴定其促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡及自噬的功能.方法:采用基因合成技术获得融合基因SA-ECD,克隆至PUC57载体鉴定无误后,再将其定向插入原核表达载体PET30a,IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blotting鉴定.按照生物素-A10∶ SA-ECD摩尔比为4∶1的比例制备PSMA特异性的偶联物即靶向系统,凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证SA-ECD与生物素的结合,流式细胞术、Western blotting、锥虫蓝染色分别检测靶向系统对前列腺癌细胞凋亡、自噬相关蛋白表达和细胞活力的影响.结果:双酶切及基因测序证实重组质粒PET30a-SA-ECD构建成功,IPTG诱导SA-ECD融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并经亲和凝胶层析成功纯化.EMSA实验证明SA-ECD能有效结合生物素-A10.靶向系统可促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡和自噬,同时抑制癌细胞活力.结论:成功表达并纯化融合蛋白SA-ECD,构建的生物素-A10∶ SA-ECD靶向系统能够杀伤PSMA+前列腺癌细胞.
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磁性纳米粒子与链霉亲和素的连接及初步应用
目的在磁性纳米粒子表面偶联上链霉亲和素,用于VEGF质粒的提纯.方法用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁性纳米粒子上, NBT/BCIP显色法和放射性核素标记法测定链霉亲和素的连接;利用生物素和链霉亲和素的高亲和力将生物素连接的探针连接在磁性纳米粒子上,制备成三链螺旋磁性纳米粒子;修饰好的粒子从含有VEGF质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.结果显色反应证实链霉亲和素连接在磁性纳米粒子表面,核素标记法显示其结合率在室温时为2.5 μg/100 μg,65 ℃时为22.28 μg/100 μg;三链螺旋磁性纳米粒子可以提纯出质粒,且纯度较高.结论通过一定修饰的磁性纳米粒子可以从含有质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.
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基于双纳米金标记的侧流免疫层析法检测人骨钙素蛋白
传统的基于纳米金的侧流免疫层析法灵敏度不高.为了克服这个缺点并且不增加额外的步骤,该研究通过双纳米金标记技术结合生物素-链霉亲和素蛋白放大系统,并利用金标定量阅读仪达到快速定量检测骨代谢标志物(以骨钙素为例)的目的.该试纸条的第一结合垫包被链霉亲和素-纳米金探针,第二结合垫包被抗骨钙素单抗Ab14318-纳米金-生物素化单链核苷酸探针,硝酸纤维素膜上的检测线包被抗骨钙素单抗Ab14319,质控线上包被羊抗鼠IgG.通过对该侧流免疫层析试纸条与电化学免疫测定法(ECLIA)的相关性研究发现,两种方法有强相关性.该研究表明该试纸条拥有良好灵敏度、准确度和可靠性.与电化学免疫测定法相比,该方法更加简单、快速,并且不需要复杂的仪器设备,非常适合在检测现场或基层社区医院使用,应用前景非常广泛.
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二步法磁共振预定位免疫成像对荷人结肠癌裸鼠增强作用的研究
目的:探讨磁共振(MR)预定位免疫成像中SA-DTPA-Gd对靶瘤性的致增强作用.方法:两组荷人结肠癌细胞裸鼠分别经静脉注射SA-DTPA-Gd和Gd-DTPA,检测各组肿瘤组织和肝组织的信号强度.结果:SADTPA-Gd组在静脉给药后6 h肿瘤强化率高达70.2%,而Gd-DTPA组给药20 min肿瘤的强化率高为21.3%,两者间差异具有显著性意义.肝组织在SA-DTPA-Gd组峰值强化率为20.4%,而Gd-DTPA组高为17.7%,两者之间差异不显著.结论:二步法MR预定位免疫成像技术对肿瘤具有显著的特异性增强作用,并有利于提高MR对病灶的敏感性.
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生物素——链霉亲和素放大免疫酶法在鼻咽癌血清学检测中的应用
[目的] 探讨生物素--链霉亲和素放大免疫酶法(BSA)应用于鼻咽癌(NPC)IgA/EA血清学早期筛查效果,提高鼻咽癌早期诊断效率.[方法] 免疫酶法(IE)检测广西鼻咽癌示范基地血清中IgA/VCA(针对EBV壳抗原VCA的IgA型抗体),IgAVCA阳性者再用IE法及生物素--链霉亲和素放大免疫酶法(BSA)分别检测血清IgA/EA(针对EBV早期抗原EA的IgA型抗体),以临床病理检查结果为确诊标准.t检验及X2检验统计分析改进前后两种方法在鼻咽癌血清学早期检测方面的差异.[结果] IE法检测IgA/VCA阳性血清388例,IE法检测IgA/EA阳性率3.6%(14例),BSA法检测IgA/EA阳性率12.9%(50例),BSA法检出阳性率显著高于IE法(X2=22.070,P<0.001).在两种方法检测的血清IgA/EA均阳性的样品中,IgA/EA检测滴度的几何平均值(GMT)分别为1:17.04和1:51.87,BSA法显著高于IE法(t=2.804,P<0.05).进一步的病理检测确诊鼻咽癌患者16例,BSA法提高了NPC检测灵敏度(X2=16_347,P<0.001).[结论] 用生物素--链霉亲和素放大免疫酶法(BSA)检测血清EBV相关抗体特异性较高,并且可以提高鼻咽癌血清学早期检测的灵敏度,为在基层开展更有效的流行病学筛查提供了可行的方法.
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链霉亲和素修饰的CdSe-ZnS量子点对聚合酶链反应的影响作用初步研究
目的:探讨链霉亲和素修饰的CdSe - ZnS量子点对聚合酶链反应的影响.方法:将链酶亲和素修饰的量子点浓度进行稀释观察其对于聚合酶链反应体系的浓度效应；反应体系中含有一定浓度的链酶亲和素修饰的量子点,在不同的退火温度下进行扩增,观察链酶亲和素修饰的量子点对退火温度的影响；将不同浓度的BSA加入到含有一定浓度的链酶亲和素修饰的量子点的反应体系中,观察BSA的影响作用；将不同公司的Taq酶与不同浓度链酶亲和素修饰的量子点组合,观察对扩增体系的影响.结果:一定浓度链霉亲和素修饰的量子点可以促进聚合酶链反应的扩增效率,拓宽PCR的退火温度范围；BSA可以逆转链霉亲和素修饰的量子点对于PCR的优化作用；量子点可能是与Taq酶相互作用,来影响PCR的扩增效能.结论:一定浓度的链霉亲和素修饰的量子点可以优化PCR的反应体系.
