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表达幽门螺杆菌热休克蛋白60克隆的构建
目的:构建含Hp热休克蛋白60(Hsp60)基因的重组载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究Hsp60的佐剂功能和免疫原性奠定基础.方法:提取Hp染色体基因,用PCR方法扩增Hsp60基因,将其克隆至表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并通过免疫印迹实验研究其免疫原性.结果:分离得到了1.6kb的Hsp60基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达,在37℃诱导表达3 h后,表达产物占细菌总蛋白的27.2%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要是包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的76.6%.经免疫印迹证实该重组蛋白可以被Hp感染患者血清所识别.结论:成功地克隆并表达Hp Hsp60基因,为Hp疫苗的研制打下了基础.
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人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆、表达及抗原性研究
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体、进行核甘酸序列分析,并在E. coliBL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法:利用分子克隆技术从Hpylori DNA染色体中,扩增热休克蛋白A编码基因片段;将目的基因与载体pET32a(+)同时经kpnⅠ、BamH Ⅰ双酶切、纯化、连接后,转化含有目的基因的重组载体;以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达;表达产物经纯化后,用Western blot法检测其抗原性.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hpylori热休克蛋白A编码基因,与GenBank报道的相比较,有1.6%的碱基(bp)发生变异,1.6%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白Mr为33×103,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96%.重组蛋白经Ni+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上.用Westernblot方法检测显示,该重组蛋白可被Hpylori阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论:成功地克隆并表达了H pylori热休克蛋白A码基因,为Hpylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
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msCs移植对扩张型心肌病TGF-β1、AT1、CYP11B2及心肌胶原表达影响的研究
目的:探讨经外周静脉途径移植骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, msCs)治疗扩张型心肌病心衰的可行性及对TGF-β1、AT1、CYP11B2及心肌胶原表达的影响。
方法:1.扩张型心肌病心衰动物模型的构建与鉴定SPF级近雄性SD大鼠采用腹腔注射ADR的方法构建DCM心衰模型。给药第10周对两组大鼠行心脏超声检查,心肌组织HE、Masson病理染色、心肌胶原分析及免疫组化检测心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,鉴定模型。2.骨髓间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病将DCM大鼠经尾静脉注射含msCs的细胞悬液。于细胞移植第20周进行心脏超声检查,观察LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS。于末次移植后第20周末行心肌组织HE、Masson病理染色、心肌胶原分析及免疫组化检测心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,RT-PCR扩增Ⅰ、Ⅲ胶原、TGF-β1、AT1、CYP11B2基因片段,检测其mRNA的表达。数据进行统计学分析。 -
基因释放剂在结核分支杆菌热休克蛋白70 DNA模板制备中的应用
聚合酶链反应(PCR)是分子生物学研究中广泛使用的技术,但其影响因素较多,常导致基因扩增效率低下。我们分别用试剂盒提取法和基因释放剂(genereleaser)提取法进行模板制备,得到了不同质量的基因模板,PCR的扩增效率也不同,现报告如下: 材料与方法结核分支杆菌H37RV,由中国生物制品检定所提供;结核分支杆菌热休克蛋白(hsp 70)引物由上海生工公司合成;DNA提取试剂盒购自上海华舜公司;基因释放剂为美国Bioventures公司产品,分别按照试剂盒说明进行DNA提取。PCR扩增参数为:50 μl反应体系,94℃预变性3 min;93℃变性1.5 min、60℃退火2 min、72℃延伸4 min,共35个循环,后再72℃延伸10 min。PCR产物作琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外线下观察分析。 结果研究设计目的基因片段大小应为1 800 bp。采用试剂盒提取DNA制备模板,未见产物;而用基因释放剂的方法制备模板,则在相对分子质量标准1 489 bp和1 882 bp之间靠近后者处,有一清晰扩增带,为目的基因。
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中国前三例甲型H1N1流感流行病学和临床特征分析
2009年4月初,一种由包含猪、禽、人3种流感病毒基因片段的甲型H1N1流感病毒引起的人间感染首先在美国和墨西哥报道,并迅速波及全球.截至2009年6月17日,已有88个国家和地区报道发现感染病例.
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博尔纳病病毒感染和帕金森病
博尔纳病病毒(Borna disease virus, BDV)是非溶细胞性嗜神经病毒,能感染多种动物并引起中枢神经系统功能障碍为特征的博尔纳病(Borna disease, BD)[1].我们在进行中国人神经精神疾病与BDV感染关系的研究中,在7例帕金森病(PD)患者周围血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC )中检出BDV P24基因片段1例.现初步报道,并探讨BDV感染与PD发病的可能关系.
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IgVH基因片段在慢性淋巴细胞白血病中的表达及其临床意义
B细胞性慢性淋巴细胞白血病(B-cLL)是西方国家常见的一种恶性淋巴细胞增殖性疾病,我国发病率虽然低于西方国家,但随着人口的老龄化,发病率呈现逐年上升趋势.B-CLL患者的临床病程和转归呈高度异质性,因此现阶段重要的就是建立完善的预后参数分层,提供精确的预后信息,指导治疗[1].
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RASSF1A基因在肝癌中表达失活的研究
新研究进展揭示,抑癌基因功能的抑制或失活,除了与基因片段的丢失,DNA序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外,还与DNA序列中CpG岛(CpG island)中胞嘧啶(C)碱基环上发生的甲基化(mCpG)有极其重要的相关性.
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反义核酸逆转人肝癌细胞株多药耐药性的效应
化疗是原发性肝癌晚期病人和术后肝癌复发的主要治疗手段之一,但是肝癌病人对多数化疗药物易产生多药耐药性(multidrug resistance,MDR),导致化疗失败.本研究利用反义RNA技术采用重组腺病毒AdEasy系统,构建了携带反义多药耐药基因片段的重组腺病毒,观察反义核酸对MDR的逆转效应,报告如下.
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甲型H1N1流感诊疗方案(2009年第三版)
2009年3月,墨西哥暴发"人感染猪流感"疫情,并迅速在全球范围内蔓延.WHO初始将此型流感称为"人感染猪流感",后将其更名为"甲型H1N1流感".6月11日,WHO宣布将甲型H1N1流感大流行警告级别提升为6级,全球进入流感大流行阶段.此次流感为一种新型呼吸道传染病,其病原为新甲型H1N1流感病毒株,病毒基因中包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段.本诊疗方案是在7月10日第二版诊疗方案基础上,依据近期国内外研究成果及我国甲型H1N1流感诊疗经验修订而成.由于这种甲型H1N1流感是一种新发疾病,其疾病规律仍待进一步观察和研究.
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卵泡刺激素正常的无精子症患者无精子因子微缺失检测
研究表明,Yq11,23区域中多个基因片段即无精子因子(azoospermia factor,AZF)的缺失可导致无精子症和严重少精子症.
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人乳头状瘤病毒感染生物状态与宫颈病变研究进展
子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,其发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌居第二位.近年来,子宫颈癌病因学研究成为热点并取得了突破性进展,大样本的研究表明,几乎所有的宫颈癌及大多数子宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN) 2~3都存在人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)感染,生殖道感染高危型HPV是妇女宫颈癌和CIN高发的主要危险因素[1,2].研究发现,在低级别CIN中,HPV基因组处于游离状态,但是大多数宫颈浸润癌和部分高级别CIN中高危型HPV整合入宿主基因组DNA,整合型HPV基因片段的插入可以引起细胞特定基因功能丧失或者下调,这一机制可能是HPV相关恶性肿瘤发病机制中的一个主要诱因或者促进因素[3].本文就HPV感染的生物状态在HPV致病机制中的意义、HPV感染生物状态的检测方法以及与宫颈癌、癌前病变的关系进行综述.在国外文献中称为HPV"物理状态"(physical status of HPV),翻译中认为称为"HPV的生物状态"更为恰当,故本文中均用"HPV生物状态".
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阿尔茨海默病患者线粒体CO2基因片段的突变分析
长片段和短片段的巢式聚合酶链反应(PCR)已经成为监测DNA片段缺失的常用手段,2000年,我们利用PCR及巢式PCR技术扩增了阿尔茨海默病(AD)患者29例老年人(65~84岁)的编码910 bp细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的mtDNA片段(CO2),通过扩增片段的多态性分析和CO2片段的序列分析进一步探讨CO2基因缺失、重排和碱基突变在AD发生发展中的作用.
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反义IGF-IR基因片段诱导C6胶质瘤细胞凋亡
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利用干血斑样品对1例HIV-1感染者进行辅助确认
天津市津南区卫生防病站送检一份血样,经初筛和复检均为艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)抗体阳性,而病毒载量测定结果低于检测水平,CD4淋巴细胞计数处于正常值范围,高度怀疑为HIV-1感染者.
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HIV-1基因分型及其研究意义
艾滋病病毒1型(HIV-1)属于单股正链核糖核酸(RNA)逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒亚科(Lentivirinae),其成熟病毒粒子含2个基因组,每个基因组全长约9.8kb,含3个结构基因、6个调节基因和两侧长末端重复序列.该病毒因具有高突变率、高重组率和高复制率等特点,故其基因组能快速变异,产生大量变异株,从而顺利逃脱宿主的免疫压力,致使HIV感染者/艾滋病(HIV/AIDS)患者总数日趋增多.至2003年底,全球HIV/AIDS患者总数已超过4 000万,每天仍有约1.4万人新感染HIV[1].通过对HIV-1基因片段或全长特异性扩增、测序及种系分析,可将其变异株做基因分型,这对于HIV-1监测、诊断、疫苗和药物治疗等发现具有重要的指导意义.
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Ⅲ型中国株HCV E2/NS1基因的扩增及其哺乳动物细胞表达质粒克隆构建
E2/NS1基因被认为是丙型肝炎病毒 (HCV)基因组的结构区基因,具有较大的变异性[1],而且在不同的HCV基因型中,E2/NS1区域的核苷酸同源性也有很大的差别[2].在我国,Ⅲ型HCV 株是流行的两种主要基因型之一,为此,本研究扩增出我国基因型Ⅲ型 HCV株的 E2/NS1基因片段,并构建出插入该基因片段的真核表达质粒.
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纳可佳治疗女性下生殖道人乳头瘤病毒感染的研究
人乳头瘤病毒(HPV)感染引起女性生殖道鳞状上皮疣状增生病变是常见的传染性疾病,目前共发现HPV 100多个型别,其中有30多个型别与生殖道感染或生殖道恶性肿瘤有关,不同亚型对宫颈上皮的致病力不同.多数宫颈癌标本中可检测到HPV病毒基因组或基因片段,90%以上的宫颈癌合并HPV感染[1],HPV感染是宫颈癌的主要病因.
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新型防龋疫苗——变形链球菌基因疫苗防龋应用基础研究
1.主要研究内容:(1)基因疫苗的构建;通过基因重组技术成功地构建了含主要致龋菌变形链球菌毒力因子基因的重组质粒pcDNA3-pac、pcDNA3-gtfB、pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP.(2)基因疫苗的鉴定:经双酶切、测序等分析证实目的基因片段插入相位正确,未改变其阅读框架.
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基因芯片技术及产品的开发与应用研究
1.概念、开发目的与意义:基因芯片是曾被评为1998年度世界十大科技突破之一的生物芯片技术的一个分支,它是大量的靶基因片段被有序、高密度地排列在玻璃、硅等载体上而制成,将待测样本标记后与之杂交,运用检测装置以及计算机软件检测芯片各靶基因的标记信号,从而快速、灵敏、高通量地比较和分析待测样本中的基因信息.该技术是目前后基因组研究中开发和应用广泛的技术,在生命科学、医学研究、制药研究等领域有重要应用价值.