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优化超声辐照条件促进EGFP在293 T细胞内转染的实验研究
目的:探讨超声辐照促进EGFP转染至293T细胞的佳条件。
方法:将293T细胞种植于24孔板内,细胞密度1.5×105/孔,24 h后更换为转染液进行超声辐照。根据辐照条件分别优化输出功率、辐照时间、微泡浓度。质粒浓度固定选择15μg/ml;输出功率选择1.5 w/cm2、2.0 w/cm2、2.5 w/cm2;辐照时间选择30s、45s、60s;微泡浓度选用20%、30%、40%。转染液为EGFP、微泡、Opti-MEM的混合液,总体积为1 ml,微泡选用sonovue,EGFP质粒浓度为1μg/μl。辐照仪器为超声基因转染仪,辐照后4 h更换为不含抗生素含血清的DMEM培养基。每个条件相互组合,重复4次。转染后72 h荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白的绿色荧光,流式细胞仪检测荧光细胞比例,CCK-8检测细胞存活率,计算转染效率=荧光细胞比例×细胞存活率。统计方法采用多因素方差分析。 -
内质网应激在唯BH3蛋白Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用
目的:探讨内质网应激在唯BH3蛋白Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。
方法:在体外原代培养出生1-3天的大鼠心肌细胞,并用抗ɑ-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。用脂质体转染法将Bim-siRNA转染心肌细胞,制作缺血缺氧损伤模型(转染48 h后给予缺氧12 h处理)。实验分组:(1)空白对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+阴性对照siRNA组;(4)缺氧+脂质体组;(5)缺氧+Bim-siRNA组。用MTT法观察细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度变化情况;用Western blot检测心肌细胞中Bim及内质网应激标志分子 Caspase-12和InSP3蛋白的表达情况。 -
溶血磷脂酸预处理对幼龄心脏再灌注损伤影响的研究
目的:探讨溶血磷脂酸(LPA)预处理通对幼龄心脏再灌注损伤后保护作用及机制。
方法:将H9C2心肌细胞分为对照组、氧化应激损伤组(200 mol/L过氧化氢处理4小时)、LPA预处理组(25μmol/L、10μmol/L、1μmol/l)和ki16425预处理组,应用MTT法和流式细胞仪检测细胞存活和凋亡。选择2周龄SD鼠建立Langendorff离体心脏缺血再灌注损伤模型,随机分为对照组(n=6)、再灌注损伤组(n=7)、LPA预处理组(n=7)和ki16425+LPA预处理组(n=7),记录缺左室收缩压(LVSP)、左室发展压(-dp/dt)、心率(HR)和冠脉流量(CF);实验结束后TTC染色检测再灌注损伤面积;取各组心尖部位检测caspase-3活性和TUNEL染色。 -
Rad基因重组腺病毒在培养乳鼠心肌细胞中的表达
目的:研究外源性Rad基因重组腺病毒在体外转染乳鼠心肌细胞后的转染效率及Rad基因的表达情况。
方法:构建Rad腺病毒载体,以不同的MOI值转染体外培养的原代乳鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察转染后荧光强度及转染效果,流式细胞仪检测转染率,采用RT-PCR、Western blot检测Rad基因表达情况。 -
沉默唯BH3蛋白Bim的表达对缺氧致大鼠心肌细胞凋亡的影响
目的:探讨唯BH3蛋白Bim在缺氧致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。
方法:在体外原代培养出生1~3天的大鼠心肌细胞,并用抗ɑ-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将Bim-siRNA瞬时转染细胞,制作缺血缺氧损伤模型(转染48 h后给予缺氧12 h处理)。实验分组:①正常对照组;②缺氧组;③缺氧+阴性对照siRNA组;④缺氧+脂质体组;⑤缺氧+Bim-siRNA组。用倒置显微镜观察并记录心肌细胞搏动频率与节律;用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量,以判断细胞损伤情况;用MTT法检测细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;用Western blot检测Bim、Bax、Bcl-2和p-P38MAPK在心肌细胞中的表达情况。 -
非小细胞肺癌患者外周血CD44的表达与临床病理的相关性研究
CD44是与恶性肿瘤转移相关的重要粘附分子,它的表达与肿瘤的转移、侵袭有关。我们运用流式细胞术检测肺癌患者外周血 CD44的表达,为判断肺癌的转移潜能和预后提供依据。 对象与方法肺癌组 50例,均经手术、穿刺活检证实并行胸部X线片和CT检查。其中男性 34例,女性16例。年龄范围30~74岁,平均年龄(48±3.5)岁。进行手术的有32例,化疗的18例。有淋巴结转移者36例,无淋巴结转移者14例;鳞癌28例,腺癌18例,大细胞未分化癌4例。组织学分类:高分化10例,中分化18例,低分化22例。根据UICC[1]分期:Ⅰ期10例,Ⅱ期10例,Ⅲ期 16例,Ⅳ期 14例。良性组:肺炎、肺结核[2]共25例,男性15例,女性10例,年龄范围24~56岁,平均年龄(30±3.5)岁;正常对照组:健康献血者30人,男性19例,女性11例,年龄范围18~25岁,平均年龄(20±2.5)岁。标本采集:肺癌组术前、化疗前及术后、化疗疗程结束后1个月采外周静脉血2 ml 。良性患者和健康献血者采外周静脉血2 ml。鼠抗人单克隆抗体CD44-FITC及阴性对照羊抗鼠IgG- FITC均由法国国际免疫公司提供。血液标本的处理和流式细胞仪检测:详见文献[3]。取少量标有荧光抗体的细胞悬液涂片,在激光共聚焦显微镜下观察CD44的表达,细胞膜上见有绿色荧光为阳性表达。
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慢性阻塞性肺病患者外周血淋巴细胞激活诱导凋亡的检测
激活诱导细胞死亡(activation induced cell death,AICD)也称细胞凋亡,外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)在抗原、丝裂原等刺激下可引起AICD.为了探讨慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者PBL的AICD水平,作者采用丝裂原PHA-P分别与正常人及COPD患者PBL体外培养,通过流式细胞仪检测PBL凋亡率,了解COPD患者PBL凋亡变化,探讨COPD患者的免疫损伤机制.
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冠心病患者外周血单个核细胞激活诱导凋亡的检测
激活诱导细胞死亡(activation-induced cell death,AICD)也称细胞凋亡,外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)在抗原、丝裂原等刺激下可引起AICD.为了探讨冠心病患者PBMC的AICD水平,我们应用丝裂原PHA-P分别与正常人及冠心病患者PBMC体外培养,通过流式细胞仪检测PBMC凋亡率,了解冠心病免疫细胞变化,探讨冠心病发病的免疫机制.
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甲氨蝶呤诱导人绒毛膜癌JAR细胞株凋亡及其相关蛋白的表达
甲氨蝶呤(MTX)是治疗绒毛膜癌(绒癌)的首选或在绝大多数联合化疗方案中必需的药物.随着对细胞凋亡研究的不断深入,发现MTX可诱导多种细胞凋亡而发挥其细胞毒作用[1,2].本研究使用流式细胞仪检测不同浓度MTX诱导发生于胎盘滋养细胞的绒癌细胞株JAR细胞的凋亡,并采用免疫细胞化学方法,检测与JAR凋亡细胞相关的p27kip1、bcl-2、bax蛋白的表达,以探讨MTX诱导JAR细胞凋亡的机制.
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妊娠合并遗传性巨血小板综合征一例
患者26岁,因停经39周+2,阵发性腹痛伴阴道少量流血3 h于2003年8月15日入院.患者4年前在我院血液科经流式细胞仪检测血小板膜缺乏(GP)Ib/IX复合物,电子显微镜(电镜)观察血小板形态异常巨大,血小板内颗粒明显增多,确诊为遗传性巨血小板综合征(BBS).患者孕期在我院定期行产前检查,未用药物治疗,血小板计数在30×109~50×109/L,患者无明显皮肤黏膜出血体征,胎儿发育正常.
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血小板无力症1例报告
患儿,男,5岁3个月,因咳嗽3天,鼻衄10余次入院.入院查体:T 37.1℃,P 105次/分,R 28次/分,Bp 80/55mmHg.轻度贫血貌,全身皮肤粘膜未见出血点及瘀斑,双侧鼻腔见新鲜血痂,双肺呼吸音清,心率105次/分,律齐,未闻及杂音.腹软,肝脾肋下未及,神经系统查无异常.患儿父母无血缘关系.入院前化验血常规:WBC 12.4×109/L,RBC2.74×1012/L,Hb 80g/L,plt 502×109/L.入院后检查:凝血四项:PT 12.7s,APTT 41.9s,TT1018.ls,Fib 5.12g/L,Ⅷ因子活性124.5%,Ⅸ因子活性102.4%;骨髓常规示增生性贫血,血小板散在分布,成小簇分布血小板极少见;血小板凝集试验:胶原20hms,花生四烯酸10hms,二磷酸酰苷10hms;经流式细胞仪检测患儿外周血GPⅡb含量为20.14%,GPⅢa含量为31.27%.给予鼻腔填塞压迫止血,并输注血小板16U×2次,未再出现鼻衄等出血症状后出院.
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流式细胞仪检测呼吸道合胞病毒感染患儿的细胞因子反应及其临床意义
为探讨RSV感染与细胞因子反应类型之间的关系,我们于2000年9月至2001年4月应用流式细胞仪技术,对RSV感染患儿进行了外周血CD+4和CD+8 T淋巴细胞内IL-4/IFN-γ表达情况的检测研究,报告如下.
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流式细胞仪检测卡氏肺孢子肺炎1例
2001年12月对1例卡氏肺孢子肺炎外周血进行CD4、CD8流式细胞仪检测并计数,现报告如下.
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用流式细胞仪检测儿童腺样体和外周血淋巴细胞浆内细胞因子
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鼻咽癌患者外周血γδT细胞对鼻咽癌细胞的细胞毒活性测定
T细胞受体(T cell receptor,TCR)γδ表型细胞与TCRαβ细胞不同,识别抗原的方式类似于免疫球蛋白,以主要组织相容性复合体非限制性方式识别抗原分子[1,2],无需抗原呈递分子配合,直接识别广谱肿瘤抗原.我们以抗体固相法体外扩增7例鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)患者及6例健康人外周血的γδT细胞,经原代NPC细胞同步培养,得到高纯度的NPC细胞.流式细胞仪检测γδT细胞纯度,研究两种来源的γδT细胞对Daudi、CNE1、CNE2和新建的传代培养NPC细胞的细胞毒作用,探讨NPC患者外周血中γδT细胞的抗肿瘤作用.
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变应性鼻炎患者外周血白介素4和13的检测
Th1/Th2平衡和复杂的细胞因子网络学说是变应性鼻炎发病机制较新的观点.虽然IL-4被认为是生成Th2型细胞的主要介质之一,但IL-13也日益受到重视.有研究表明,IL-4缺陷的转基因小鼠也能产生IgE反应,而IL-4/IL-13都缺陷的转基因小鼠不能产生IgE反应.IL-13缺陷小鼠的T细胞不能产生Th2型细胞因子.阻断IL-13可显著抑制抗原导致的气道高反应.本研究通过采用流式细胞仪检测变应性鼻炎患者细胞内IL-4、IL-13、干扰素γ(IFN-γ)的表达,以及酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中IL-4、IL-13含量,以探讨变应性鼻炎的发病机制.
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双黄连抑制流感病毒诱导MDCK细胞程序化死亡的研究
研究显示,流感病毒在体内可诱导人体的呼吸道上皮细胞凋亡,在体外使宫颈癌细胞(Hela)和狗肾传代细胞(MDCK)凋亡[1,2].近来报道抗流感病毒药物可抑制流感病毒诱导感染细胞凋亡[3].但双黄连是否可抑制流感病毒诱导MDCK细胞凋亡少有报道.我们自2005年7月至2008年6月采用Annexin V及碘化丙啶(PI)双染并应用流式细胞仪检测双黄连对流感病毒诱导MKCK细胞凋亡的影响,报告如下.
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血CD41、CD62P与2型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度的关系
众所周知,胰岛素抵抗、高胰岛素血症、脂代谢异常是导致糖尿病患者动脉粥样硬化的危险因素,近年有报道, 胰岛素抵抗、脂代谢异常使血小板活化程度增加,在动脉粥样硬化的形成中具有重要的作用[1,2].本研究采用流式细胞仪检测糖尿病患者活化血小板标志物αⅡb整合素(CD41)和P- 选择素(CD62P),用超声测量颈动脉内膜中层厚度,探讨血CD41、CD62P与糖尿病动脉硬化发生发展的关系.
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苦参碱作用K562细胞表面分化抗原表型的改变
近年来,肿瘤诱导分化剂的研究日渐增多,从中药和天然药物中寻找和提取诱导分化剂是一种新途径.苦参碱是传统中药苦参的有效成分,文献报道具有抗癌活性[1],对白血病细胞有抑制生长和诱导分化作用[2].本课题组在前期研究的基础上[3,4]通过流式细胞仪检测进一步表明:一定浓度的苦参碱可诱导K562细胞向成熟方向分化,并具有多向诱导分化作用.
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阵发性睡眠性血红蛋白尿症合并Moya Moya病一例
患者,男,14岁.因反复发作性右侧肢体活动失灵伴言语不清15?d入院.既往有反复酱油色尿史8年余,6岁时有颅脑外伤史,曾有短暂性意识不清,5年前因发现外周血细胞三系减少,当地医院诊断为“慢性再生障碍性贫血”,治疗无效.入院时体检:反应迟钝,运动性失语,智力低下,重度贫血貌,眼球居中,伸舌无偏斜,右鼻唇沟浅,巩膜无黄染,浅表淋巴结无肿大,皮肤未见出血点,双肺呼吸音清,心界不大,腹软,肝、脾肋缘下未及,右侧上、下肢肌力Ⅴ-级,左侧Ⅴ级,四肢腱反射活跃,双侧巴彬斯基征(+),双下肢无水肿,肛门指检正常.血常规:Hb 56?g/L,WBC 2.3×109/L,BPC 94×109/L,网织红细胞0.063.骨髓象:骨髓增生活跃,粒∶红=0.43∶1,粒系增生减低,各期细胞均见,形态无异常,红系增生明显活跃,占0.450,以中、晚幼红细胞为主,巨核系增生活跃,血小板成堆分布.NAP:20分/100个中性粒细胞.Ham试验阳性,Coombs试验阴性.蛇毒溶血试验:6.9%(正常值<5%).流式细胞仪检测:红细胞CD59 78.5%,粒细胞CD59 71.3%,均明显低于正常值(≥95%).头颅核磁共振血管成像术(MRA)检查:两侧大脑中动脉、前动脉闭塞,双侧大脑后动脉增粗,并见多量异常分支血管网,颅底异常血管网似烟雾状,提示Moya Moya病样血管病变. 诊断:阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)合并Moya Moya病.给予阿斯匹林、低分子量肝素、华发令等抗血小板及抗凝治疗,以及洗涤红细胞输注,症状明显好转后出院.