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升麻鳖甲汤应用举隅
升麻鳖甲汤出自<金匮要略>,原治阴阳毒,临床中我们依其义灵活化裁,用以治疗多种疾病,屡收佳效,兹就近年来应用该方治疗体会介绍如下.
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rAAV 2-GPⅡb/GPⅢa载体构建和体外表达、功能实验
为了研究rAAV载体介导的血小板无力症基因治疗的可行性,构建了由CMV启动子调控的rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒载体,并采用多种方法验证了rAAV2-Ⅱb和rAAV2-Ⅲa病毒载体在真核细胞中的表达能力,其中包括用RT-RCR方法检测BHK-21细胞感染24小时(MOI=1×105 v.g/cell)后目的基因在mRNA水平的表达,用流式细胞术的方法检测不同MOI和目的基因表达之间的量效关系,采用Western blot的方法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=1×105v.g/cell)目的基因在蛋白水平的表达,用免疫荧光法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=105 v.g/cell)目的基因在细胞表面的表达,以及应用PAC-Ⅰ结合试验验证所表达的GPⅡb/Ⅲa蛋白功能.结果表明,在MOI=1×105v.g/cell条件下,在BHK-21细胞感染24小时后即可在mRNA水平上检测到目的基因的表达,在48小时可在蛋白水平检测到目的基因的表达;在一定剂量范围内目的基因的表达量随着MOI的增加而增加,但MOI过高反而使表达量下降,目的基因表达产物活化之后能与PAC-I结合,并具有正常的生物学活性.结论:rAAV2载体能有效地介导GPⅡb、GPⅢa基因在真核细胞内表达,所表达的产物都具有正常的生物学活性,此结果为rAAV2载体在血小板无力症基因治疗中的应用打下了基础.
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绿色荧光蛋白(GFP)融合于人整合蛋白αⅡb C端不影响αⅡbβ3复合物在CHO细胞正常表达
本研究选择αⅡb作为靶蛋白观察绿色荧光蛋白(GFP)标记对αⅡbβ3复合物生物合成过程和表达的影响.从人αⅡb表达载体p3.1-2b中经PCR扩增的αⅡb基因全长cDNA,插入表达载体pEGFP-M中构建αⅡbGFP融合蛋白表达载体,测序正确后利用脂质体将重组质粒与表达人整合蛋白β3亚基的真核表达质粒p3.1-3a共转染CHO细胞,对转染后细胞用Western blot方法鉴定αⅡbGFP基因在CHO细胞中的表达并用激光共聚焦显微镜确定融合蛋白的细胞内定位.结果表明:经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,Western blot证明转基因CHO细胞有人αⅡbGFP基因的表达,融合蛋白细胞内定位研究显示αⅡbGFP可以由内质网转运至高尔基体.结论:成功构建了人αⅡbGFP融合蛋白真核表达载体;GFP融合于αⅡbC端不影响αⅡbβ3复合物在CHO细胞的正常表达.
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实时RT-PCR与ELISA在发热伴血小板减少综合征检测中的应用
目的 探讨实时荧光RT-PCR法与酶联免疫吸附实验(ELISA-IgM)法在发热伴血小板减少综合征检测中的应用价值.方法 连续采集我院2014年78例疑似发热伴血小板减少综合征患者血清138份并对其中49例确诊病例不同病程的91份血清标本,分别应用实时荧光RT-PCR方法和ELISA-IgM方法进行检测,结果进行统计学分析.结果 138份标本,实时荧光RT-PCR方法检测阳性率为51.45％,ELISA-IgM方法检测阳性率为43.48％,两种方法的检测有统计学意义(P＜0.05).在49例确诊病例中两种方法检测阳性率均受病程影响,病程早期(8d内)实时荧光RT-PCR方法检出阳性率高于ELISA-IgM法,分组检验具有统计学意义;但随着病程的延长ELISA-IgM法的检测阳性率有升高的趋势.结论 在发热伴血小板减少综合征病例的早期试验诊断中应首先使用实时荧光RT-PCR法,而ELISA-IgM法是其必要的补充,随着病程的延长后者将成为重要的诊断手段.
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八个遗传性血小板无力症家系基因型和表型分析
目的 对8个遗传性血小板无力症(GT)家系进行血小板膜糖蛋白(GP Ⅱb/Ⅲa)临床特性分析和基因突变检测.方法 采用血小板聚集试验观察血小板对各种诱聚剂的反应,流式细胞术检测血小板表面αⅡb和β3的含量;PCR法对先证者GPⅡb/Ⅲa基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.对突变位点进行直接测序,以排除基因多态性.结果 8个家系的先证者PLT计数均正常,血小板形态分散,出血时间(BT)延长,凝血象正常;对二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶、肾上腺素、胶原、花生四烯酸等多种诱聚剂反应低下,而对瑞斯托霉素反应基本正常;流式细胞仪检测结果显示,除家系2先证者为Ⅲ型GT和家系6先证者为Ⅱ型GT外,其余家系各先证者均为Ⅰ型GT.基因分析共发现12种不同类型的突变,分别为G10A、G1412T、G1199A、1525delC、G2223T、C2671T、2930delG、IVS15(-1)delG、A2334C、C1750T、69-79del和C470A.家系3先证者在GP Ⅱb/Ⅲa基因未检测到突变.结论 GPⅡb/Ⅲa基因突变是导致血小板无力症的主要原因.G10A、69-79del、C470A、G1412T、G2223T、C2671T和1525delC是导致遗传性血小板无力症的新的基因突变位点.
关键词： 血小板无力症 血小板糖蛋白GPⅡb-Ⅲa复合物 基因型 表型 -
三个遗传性血小板无力症家系临床表型和基因表型诊断的研究
目的 对3个遗传性血小板无力症(glanzmann thrombasthenia,GT)家系进行血小板膜糖蛋白Ⅱ b、Ⅲa(GPⅡb/GPⅢa)基因突变的检测.方法 应用PCR对先证者GPⅡb/GPⅢa基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;PCR产物纯化后直接测序,检测其突变基因.突变位点经直接测序证实排除基因多态性.结果 3个家系的先证者PLT均正常,血小板形态分散,出血时间(BT)延长,凝血象正常,对二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶、.肾上腺素、胶原、花生四烯酸等多种诱聚剂反应低下,而对瑞斯托霉素反应基本正常;家系1和家系2先证者的血小板膜表面CD41(GPⅡ b)/CD61(GPⅢa)的含量极度降低,分别为0.16%/1.8%、0.9%/3.7%,家系3先证者的血小板膜表面GP Ⅱ b阳性血小板为10.1%,GPⅢa阳性血小板为12.8%.免疫印迹法几乎检测不到家系1和家系3先证者的αⅡb蛋白,家系2先证者的αⅡb蛋白含量明显降低.家系1先证者在GP Ⅱ b基因存在T2255G和C2671T复合杂合突变,家系2先证者在GPⅡb基因存在A2334C纯合突变,家系3先证者在GP Ⅱ b基因存在C1750T和69-79del复合杂合突变.结论 T2255G和C2671T复合杂合突变是导致家系1先证者发生GT的原因,A2334C纯合突变是导致家系2先证者发生GT的原因,C1750T和69-79 del复合杂合突变是导致家系3先证者发生GT的原因.
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血小板无力症产妇围产期处理一例
孕妇34岁,体重76 kg,因停经38+5周,下腹坠胀2 d入院.一般情况良好,血压130/85 mm Hg,心率80次/min,胎位LOA.平素月经规律,无心肺肾疾病史.
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血小板无力症1例报告
患儿,男,5岁3个月,因咳嗽3天,鼻衄10余次入院.入院查体:T 37.1℃,P 105次/分,R 28次/分,Bp 80/55mmHg.轻度贫血貌,全身皮肤粘膜未见出血点及瘀斑,双侧鼻腔见新鲜血痂,双肺呼吸音清,心率105次/分,律齐,未闻及杂音.腹软,肝脾肋下未及,神经系统查无异常.患儿父母无血缘关系.入院前化验血常规:WBC 12.4×109/L,RBC2.74×1012/L,Hb 80g/L,plt 502×109/L.入院后检查:凝血四项:PT 12.7s,APTT 41.9s,TT1018.ls,Fib 5.12g/L,Ⅷ因子活性124.5%,Ⅸ因子活性102.4%;骨髓常规示增生性贫血,血小板散在分布,成小簇分布血小板极少见;血小板凝集试验:胶原20hms,花生四烯酸10hms,二磷酸酰苷10hms;经流式细胞仪检测患儿外周血GPⅡb含量为20.14%,GPⅢa含量为31.27%.给予鼻腔填塞压迫止血,并输注血小板16U×2次,未再出现鼻衄等出血症状后出院.
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血小板无力症患者出血机制的初探
目的 探讨血小板无力症(glanzmann's thrombasthenia,GT)患者血小板聚集功能异常的可能机制.方法 采用流式细胞仪检测血小板糖蛋白Ⅱb(GPⅡb,CD41)/Ⅲa(GPⅢa,CD61)含量,并通过血小板聚集试验、血小板黏附试验、血块收缩试验对血小板功能的检测.结果 GT患者血小板糖蛋白Ⅱb(GPⅡb,CD41)/Ⅲa(GPⅢa,CD61)含量明显低于正常,血小板聚集试验、血小板粘附试验、血块收缩试验明显较正常低下,出血时间较正常明显延长.结论 血小板GPⅡb/Ⅲa量的减少及功能障碍是导致血小板无力原因,可能机制与其相关基因突变有关.
关键词： 血小板无力症 血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 血小板聚集 -
血管性血友病一例
患儿女,4岁.以反复皮肤粘膜出血3年入院.3年前因进食不慎将唇系带刮破,出血不止,3 d后到当地医院就诊,检查血红蛋白80 g/L,诊断为"血小板无力症",给予全血100 ml和云南白药局部压迫,出血止.2个月前患儿于剧烈运动后出现鼻衄,经鼻腔填塞后仍有少量渗血.检查血红蛋白为65 g/L,予冷沉淀物1个单位和全血200 ml后出血止.患儿平素易鼻衄,双下肢轻微外伤后易出现皮肤青紫及瘀斑,稍突出皮肤,10余天后消退.
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小儿血小板无力症22例临床分析
血小板无力症(glanzmann thrombasthenia,GT)为遗传性血小板功能缺陷中为常见的疾病,是血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)数量减少或结构异常所致的出血性疾病[1].下面根据1986年修定后的标准诊断总结我科1983～1999年门诊及病房共22例GT资料[2].
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流式细胞术快速确诊小儿血小板无力症
血小板无力症(glanzmann′s thrombasthenia, GT)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病,其发病机理是由于血小板膜纤维蛋白原受体GPⅡb/Ⅲa糖蛋白缺乏,使血小板不能聚集所致[1].
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血小板聚集性与血糖浓度的改变相关性分析
我们观察血小板聚集试验对高凝状态血栓性疾病及血小板无力症等疾病的诊断意义,对临床诊断疾病有一定参考价值.糖尿病患者常伴有血小板聚集性增高现象,随着血糖浓度逐渐升高,其血小板聚集性显著增高,当血糖浓度下降后,同时伴有血小板聚集性恢复正常.为进一步探讨血糖浓度与血小板聚集性之间的相关性,对不同血糖浓度与血小板聚集性的相关性及两者之间的内在关系报道如下.
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出血性疾病研究新进展——访中国工程院院士阮长耿
<中国医疗前沿>:阮院士,您是血液学方面的学术带头人,请您谈谈我国在这个领域的研究进展.阮长耿:好的.血栓与止血是一门与基础生物学和临床医学诸多方面相关联的学科,临床医学中许多疾病的病理过程都与血栓形成和止血异常有关.近年来,出血紊乱和血栓性疾病的基础与临床研究在我国已得到长足发展,血友病A、血友病B、假性血友病(vWD)和血小板无力症等出血性疾病的基因诊断都有了极大提高.
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八例血小板无力症的基因突变特征分析
目的 分析8例血小板无力症患者的基因测序结果,结合临床表现、实验室检查探讨其发病机制.方法 收集2007至2018年于北京大学第一医院通过血小板聚集试验以及流式细胞术检测血小板表面CD41和CD61表达诊断为血小板无力症的8例患者及其中4个家系,通过下一代测序法检测整合素αⅡb、β3基因的所有外显子及其侧翼序列,以及血小板型出血性疾病相关基因,突变位点采用一代测序验证,经检索HGMD、PubMed数据库及相关文献排除多态性可能.结果 8例患者血小板计数基本正常,凝血功能正常,血小板对二磷酸腺苷反应低下,对瑞斯托霉素反应基本正常;8例患者中5例血小板表面αⅡb/β3低于正常值的5％,2例为正常的5％～20％,1例与健康人相比数量未见减少.发现5种发生于ITGA2B基因的突变,分别为c.1750C ＞T(p.Arg584Ter)、c.1882C＞T(p.Arg628Ter)、c.814G＞ C(p.Va1272Leu)、c.2333A＞ C(p.Gln778Pro)、c.432G＞A(p.Trp144Ter).发现6种发生于ITGB3基因的突变,分别为c.719G ＞A(p.Arg240 Gin)、c.2248C＞ T(p.Arg750Ter)、c.1495T＞C(p.Cys499Arg)、c.1728delC(p.Ser577ProfsTer92)、c.877C＞T(p.Gln293Ter)、c.1260G＞A.另外,发现血小板无力症患者中存在RUNX1、HPS4、MYH9、ACTN1、HPS3以及SETBP1等基因突变.结论 血小板无力症患者中杂合突变,特别是复合杂合突变更多见;血小板无力症的发病不排除有除ITGA2B基因和ITGB3基因外RUNX1等基因突变参与的可能.
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血小板膜糖蛋白αⅡb P126H突变导致血小板无力症的分子机制
目的 探讨血小板膜糖蛋白aⅡb P126H突变导致血小板无力症的分子发病机制.方法 采用PCR定点突变的方法构建aⅡb Pl26H真核表达载体,测序正确后用脂质体将其与表达β3亚基的真核表达质粒PCDM8Ⅲa共转染293T和CHO细胞.采用流式细胞仪检测转染细胞膜上aⅡ b的表达,用Western印迹法鉴定aⅡb P126H突变体在转染细胞内的总体表达,采用免疫荧光共聚焦显微镜确定aⅡb P126H突变体的细胞内定位.结果 转染突变体的细胞膜表面仅可见痕量表达的aⅡb,突变aⅡb P126H与β3共表达后,可检测到前体aⅡb,但未检测出成熟aⅡb.突变aⅡb β3蛋白主要分布于内质网,仅有极少量进入高尔基体中.结论 aⅡb P126H突变阻碍了pro-aⅡbβ3复合物由内质网向高尔基体的转运,导致细胞内滞留,从而影响了aⅡb β3在细胞表面的表达,是导致血小板表面缺乏aⅡb β3复合物,产生血小板无力症的分子机制.
关键词： 血小板糖蛋白GPⅡb-Ⅲa复合物 突变 血小板无力症 -
一例血小板无力症合并子宫内膜异位症的护理
血小板无力症属常染色体隐性遗传疾病,是一种严重的出血性疾病.血小板无力症自发出血不常见,严重出血可以表现为牙龈出血及月经量多等,外伤及手术分娩等也常引起严重出血.出血严重程度具有不可预测性.我院收治了1例血小板无力症合并子宫内膜异位症的患者,经过有效救治和精心护理,20天后康复出院,现将护理体会报告如下.
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血小板膜糖蛋白Ⅱb L721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制
目的 探讨血小板膜糖蛋白Ⅱ b L721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制.方法 应用PCR法对先证者αⅡ b和β3基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;PCR产物纯化后直接测序,检测其突变基因.突变位点经直接测序证实排除基因多态性.采用PCR定点突变法构建αⅡ b L721 R和Q860X突变真核表达载体,测序正确后用脂质体将其分别与表达β3亚基的真核表达载体共转染293T和CHO细胞.采用流式细胞术检测转染细胞膜上αⅡ bβ3的表达,用Westernblot法鉴定αⅡ b L721R和Q860X突变体在转染细胞内的总体表达,采用免疫荧光共聚焦显微镜确定αⅡb L721R和QS60X突变体的细胞内定位.结果 先证者在αⅡ b基因存在T2255G(L721R)和C2671T(Q860x)复合杂合突变.PCDM8 Ⅱ bL721R/PCDM8Ⅲa转染的293T细胞表面αⅡ b为野生型的2.1%,133为野生型的11.0%.PCDM8Ⅱ bQ860X/PCDⅢ8ma转染的293T细胞表面αⅡb为野生型的31.9%,B3为野生型的18.0%.Western blot法证实突变αⅡ b L721R与β3共表达后,可检测到前体αⅡ b(pro-αⅡb),但未检测出成熟αⅡb.αⅡ b Q860X与β3共表达后,检测到截短型αⅡ b蛋白.免疫荧光细胞内共定位研究显示L721R和Q860X突变αⅡ bβ3蛋白大部分分布于内质网,仅有少量在高尔基体中.结论 αⅡb L721R和Q860X突变不影响αⅡ b蛋白的合成和pro-αⅡbβ3复合物的形成,但阻碍了pro-αⅡbβ3复合物由内质网向高尔基体的转运,导致细胞内滞留,从而影响了αⅡbβ3在细胞表面的表达,是导致血小板表面缺乏αⅡbβ3复合物、产生血小板无力症的分子机制.
关键词： 血小板糖蛋白αⅡbB3复合物 突变 血小板无力症 -
三个遗传性血小板无力症家系临床特性和基因分析
目的 对三个遗传性血小板无力症(GT)家系进行整合素αⅡbβ3临床特性分析和基因突变检测.方法 经BPC、血涂片、出血时间(BT)、凝血常规检查、血小板聚集试验和流式细胞术进行实验检测;用PCR法对先证者αⅡbβ3基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.突变位点经直接测序排除基因多态性,103名健康人作对照.结果 三个家系的先证者BPC正常,血小板不聚集,BT延长,凝血常规指标检查正常,对ADP、凝血酶、肾上腺素、胶原、花生四烯酸等多种诱聚剂反应低下,而对瑞斯托霉素反应基本正常;家系1和家系3先证者的血小板膜表面αⅡbβ3的含量极度降低,家系2先证者的血小板膜表面αⅡb阳性血小板为63%,β3阳性血小板为76%.家系1先证者αⅡb基因存在G10A纯合突变,β3基因存在G1412T纯合突变.家系2先证者β3基因存在G1199A和1525delC复合杂合突变.家系3先证者在αⅡbβ3基因未检测到突变.结论 G10A和G1412T复合纯合突变是导致家系1先证者发生GT的原因,G1199A和1525delC复合杂合突变是导致家系2先证者发生GT的原因.G10A、G1412T和1525delC为国际首次报道的突变.
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血小板无力症1例并文献复习
1病例摘要
患者男,41岁,汉族,已婚,农民。主因间断皮肤瘀点、瘀斑34年,持续鼻出血半个月于2012年7月11日入院。患者34年前无明显诱因出现皮肤自发性瘀点、瘀斑,以四肢和胸腹部皮肤为著,当时曾就诊于省内多家省级医院,检测血小板和凝血指标等均正常,未能明确诊断。此后,随年龄增长,皮肤出血情况有所减轻,可自行消退,但反复出现,时轻时重,轻微碰撞即会出现皮肤大片瘀斑,患者未重视,亦未再予以诊治。入院前半月因鼻炎在当地医院行下鼻甲封闭术时出现双侧鼻腔出血不止,经纱布填塞和电凝治疗后,鼻出血虽有所减轻,但仍有持续渗血,出血总量500 ml 以上,为进一步治疗来我院。既往体健,患者父母均无任何出血表现,且非近亲结婚,其女儿(9岁)和儿子(19岁)亦均无任何出血表现,但患者的妹妹有类似皮肤出血倾向,月经量偏多。入院查体：体温37.0℃,脉搏95次/min,呼吸25次/min,血压100/70 mmHg(1 mmHg =0.133 kPa)。发育正常,无畸形外貌,轻度贫血貌,神清语利,智力正常。全身皮肤、黏膜无黄染,未见淤点、瘀斑。周身浅表淋巴结未触及肿大。头颅无畸形,结膜无出血,巩膜无黄染。鼻无畸形,外鼻无肿胀,两侧鼻腔纱布填塞,有鲜血不断渗出。口腔黏膜未见出血点、血疱和溃疡。心肺查体未见异常。腹软,全腹无压痛,肝脾未触及。双下肢无水肿,脊柱四肢无畸形,生理反射存在,病理反射未引出。鼻内镜检查,鼻黏膜广泛渗血,黏膜糜烂,下鼻甲肥大,鼻中隔左偏。血常规(2012-07-11)：白细胞(WBC)14×109/L,中性粒细胞(NE)0.875,血红蛋白(Hb)99 g/L,平均红细胞体积(MVC)89.9 fl,平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)341 g/L,血小板325×109/L；网织红细胞(Ret)0.02。血常规(2012-07-14)：WBC 7.7×109/L,NE 0.857,Hb 69 g/L,MCV 88.4 fl,MCHC\337 g/L,血小板318×109/L；Ret 0.025。凝血常规(2012-07-11)：凝血酶原时间(PT)14.7秒,国际抗凝标准化比值(INR)1.13,活化部分凝血活酶时间(APTT)27.3秒,纤维蛋白原(Fib)6.1 g/L,凝血酶时间(TT)12.6秒,抗凝血酶(AT)122%。骨髓涂片：骨髓有核细胞增生活跃,粒红比例大致正常,全片可见巨核细胞78只,三系均未见明显病态造血现象。尿常规：未见异常,隐血阴性,镜下未见红白细胞；大便常规：隐血(±),余阴性。血生化检查：未见异常；直接抗人球蛋白试验：阴性；胸腹部 CT：未见异常出血病灶和血肿。入院后经过多次输注血小板后,鼻出血停止,出院后半月复诊,无任何出血表现。
