DHA通过抑制PI3K通路和GLUT2表达而诱导NSCLC细胞毒性

目的：研究二氢青蒿素（ dihydroartemisinin， DHA）诱导NSCLC细胞毒性的分子机制。方法：将不同浓度的DHA作用NSCLC细胞系A549和NCI－H1650细胞不同时间，运用MTT法、克隆形成实验、Annexin V染色和流式细胞术测定DHA对细胞活力、克隆形成能力和细胞凋亡的影响；同时测定DHA对细胞中葡萄糖水平、ATP和乳酸含量的影响；Western blot 检测PI3K 通路活性和GLUT2表达变化；通过细胞转染实现葡萄糖转运体2（GLUT2）和Rheb在A549和NCI－H1650细胞中高表达，测定和分析DHA作用下细胞活力、细胞凋亡、葡萄糖水平、ATP含量和PI3K通路活性的变化；分析葡萄糖缺乏对DHA诱导NSCLC细胞毒性的影响。结果：与对照组比较， DHA显著抑制A549和NCI－H1650细胞活力和克隆形成能力以及诱导细胞凋亡，同时降低ATP和乳酸含量以及抑制细胞对葡萄糖的摄取，具有时间和剂量依赖效应。 Western blot结果显示，DHA能抑制PI3K通路活性和GLUT2的表达。上调GLUT2的表达和激活PI3K通路能减弱DHA对NSCLC细胞的毒性作用；葡萄糖缺乏能增强DHA对NSCLC细胞的毒性；相反，高浓度葡萄糖则抑制DHA对NSCLC细胞的毒性。结论： DHA能抑制NSCLC细胞活力和克隆形成，诱导细胞凋亡，该作用是通过降低PI3K活性和GLUT2的表达进而抑制细胞糖酵解代谢实现的。

BARF1表达下调通过活化 caspase 依赖的线粒体通路诱导 EBV 阳性胃癌细胞凋亡

目的：研究BARF1表达下调对EBV阳性胃癌细胞凋亡的影响，以及BARF1基因沉默介导细胞凋亡的分子机制。方法：siRNA和NCsiRNA分别转染NUGC3和SNU719细胞，运用Western blot测定细胞中BARF1、Bcl－2、Bax、细胞色素C、caspase 3和caspase 9的蛋白表达；RT－PCR测定BARF1、Bcl－2和Bax mRNA的表达；台盼蓝染色法测定细胞存活率；Annexin V－FITC／PI染色法和流式细胞仪测定细胞凋亡；细胞凋亡因子抗体芯片分析细胞中凋亡相关蛋白的表达；线粒体膜电位检测试剂盒测定线粒体膜电位；免疫共沉淀检测细胞中Apaf－1和caspase 9的相互作用。结果：与空白对照组和阴性对照组相比， BARF1基因沉默显著诱导NUGC3和SNU719细胞凋亡，而线粒体膜电位显著降低。 BARF1沉默基因能促进促凋亡蛋白的表达并抑制抗凋亡蛋白的表达，Bcl－2／Bax比例显著降低；而caspase抑制剂能抑制由 BARF1基因沉默介导的细胞凋亡。在 siRNA 转染的细胞中， caspase 3和caspase 9蛋白发生裂解，细胞色素C的浓度显著高于阴性对照组，Apaf－1蛋白与caspase 9蛋白在细胞质中能够发生相互作用。结论：BARF1基因沉默通过线粒体途径调节Bcl－2和Bax蛋白的表达进而诱导NUGC3和SNU719细胞凋亡，并呈caspase通路依赖关系。

脂联素抑制脂肪组织 MHCⅡ表达及对糖脂代谢的影响

目的：探讨脂联素是否通过影响脂肪组织主要组织相容性复合物Ⅱ类（ MHCⅡ）的表达调节糖脂代谢。方法：脂联素基因敲除小鼠（ KO）和C57BL／6小鼠（ WT）分别给予高脂饲料或普通饲料，24周后，测量小鼠体重、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、稳态胰岛素评价指数（HOMA－IR）、血清甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（ TC）、血清低密度脂蛋白胆固醇（ LDL－C）和血清高密度脂蛋白胆固醇（ HDL－C）；行肝脏组织病理形态学评价；检测脂肪组织MHCⅡ反式激活因子（CIITA）、小鼠MHCⅡ抗原Eβ（H2－Eb1）、MHCⅡ恒定链（CD74） mRNA及MHCⅡ相关蛋白质表达水平。用siRNA沉默3T3－L1脂肪细胞中MHCⅡ的表达及用过表达载体升高3T3－L1脂肪细胞中的脂联素和（或） MHCⅡ的表达，检测脂联素对MHC Ⅱ蛋白水平的影响。结果：高脂饲料或普通饲料喂养的KO小鼠体重、FBG、FINS、HOMA－IR、TC、TG、LDL－C、肝脂肪变性、脂肪组织中CIITA、H2－Eb1、CD74 mRNA和MHCⅡ蛋白表达水平均高于WT小鼠。在脂肪细胞中，抑制脂联素能够在一定程度上逆转siRNA干扰所引起的MHCⅡ表达降低，过表达脂联素后脂肪细胞中MHCⅡ的表达降低。结论：脂联素可以通过抑制脂肪组织中MHCⅡ的表达改善糖脂代谢。

蛇床子素对转染APP595／596基因的SH－SY5Y细胞的保护作用

目的：研究蛇床子素对转染APP595／596基因的SH－SY5Y细胞的作用，以探讨其可能的作用机制。方法：体外培养SH－SY5Y细胞，并转染APP595／596基因，体外构建研究Aβ致病作用的细胞模型。采用CCK－8法检测细胞存活率；检测LDH评价细胞的损伤程度；流式细胞术检测细胞凋亡；用RT－PCR和Western blot法检测β－分泌酶（又称β位点APP裂解酶1，β－site APP cleaving enzyme 1，BACE 1）的mRNA及蛋白的表达；采用免疫荧光细胞化学和Western blot法检测Aβ的表达。结果：蛇床子素对转染APP595／596基因的SH－SY5Y神经细胞有保护作用，可增加细胞的存活率，降低LDH的释放，抑制细胞的凋亡，减少BACE1的mRNA与蛋白的表达，抑制Aβ的生成。结论：蛇床子素可保护转染APP595／596基因的SH－SY5Y神经细胞，其保护机制可能与减少BACE l的mR－NA与蛋白表达有关。

缝隙连接蛋白43通过调控L型钙电流参与心房肌细胞的电重塑

目的：观察缝隙连接蛋白43（ Cx43）是否通过与L型钙通道共定位，调控L型钙电流，参与房颤（ AF）的发病机制。方法：使用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测AF和窦性心律患者心房组织中Cx43的蛋白和mRNA表达差异；用RNA干扰技术沉默心房肌细胞的Cx43表达，实时荧光定量PCR和全细胞膜片钳实验观察对L型钙通道mRNA表达和L型钙电流的影响；免疫共沉淀和激光共聚焦显微成像观察心房肌细胞中Cx43与L型钙通道是否存在共定位。结果：AF患者心房组织中的Cx43表达明显低于窦性心律患者；干扰Cx43表达可明显抑制L型钙电流和L型钙通道α1c亚基的mRNA表达；且心房肌细胞中Cx43与L型钙通道存在共定位。结论：心房肌细胞中的Cx43可通过与L型钙通道形成分子复合物，调控L型钙电流，参与心房肌细胞的电重塑。

Amiloride 通过抑制缺氧诱导的 NHE1表达而延缓 calpain 介导的 ABCA1降解

目的：研究缺氧对钠氢交换体1（NHE1）表达、细胞内钙离子浓度（[Ca2＋]i）和钙蛋白酶（calpain）活性的影响，探讨NHE1抑制剂阿米洛利（ amiloride ）对 ABCA1降解的影响以及与calpain 相关的机制。方法：RAW264．7细胞缺氧0、12、24和48 h。 MTT法检测细胞活力，real－time PCR及Western blot检测NHE1的表达。流式细胞术检测[ Ca2＋] i ，荧光素法检测细胞内calpain活性。进而，经缺氧24 h处理的细胞，cycloheximide干预条件下，NHE1抑制剂amiloride处理6 h及12 h，检测ABCA1蛋白含量。后，给予calpain抑制剂ALLN及细胞内钙螯合剂BAPTA共孵育12 h，检测ABCA1含量及calpain活性。结果：缺氧呈时间依赖方式抑制细胞增殖。缺氧促进NHE1表达上调，增加[ Ca2＋] i 及calpain活性。缺氧加速ABCA1蛋白降解，而amiloride减缓ABCA1蛋白降解。ALLN及BAPTA升高ABCA1蛋白含量，降低calpain活性。结论：Amiloride延缓calpain介导的ABCA1降解，提示缺氧诱导NHE1表达可能至少部分参与ABCA1蛋白降解。

ARHI基因抑制U937白血病细胞株生长并诱导其G2/M期阻滞及凋亡

目的：探讨抑癌基因ARHI在急性髓细胞白血病中的表达情况，同时探索其对U937细胞生长的影响。方法：RT－PCR方法检测急性髓细胞白血病细胞株、人胚肾细胞293FT、白血病原代细胞以及健康志愿者血细胞中ARHI mRNA的表达情况。构建高表达ARHI的MSCV－IRES－GFP－ARHI 质粒转染U937细胞，MTT法连续8 d检测细胞活性绘制生长曲线。新鲜培养基重悬U937细胞24 h后，采用流式细胞术检测细胞周期以及细胞凋亡。结果：293 FT细胞、健康志愿者血细胞中均检测到ARHI mRNA表达，而白血病细胞株以及白血病患者原代细胞中未检测到该基因的表达。生长曲线显示高表达ARHI基因的U937（ U937－ARHI）细胞在第6～8天细胞活力低于对照（U937－GFP）组。高表达ARHI的U937细胞G2／M期细胞比例及细胞凋亡率均高于对照组（P＜0．05）。结论：ARHI在急性髓系白血病细胞中的表达减低；高表达ARHI基因能抑制U937细胞生长、阻滞其细胞周期在G2／M期并促进细胞凋亡。

PI3 K／Akt 和 JAK2／STAT3信号转导通路在 SO2抗大鼠肢体缺血再灌注致急性肺损伤中的作用

目的：探讨PI3K／Akt和JAK2／STAT3信号转导通路在二氧化硫（SO2）抗肢体缺血再灌注（I／R）致急性肺损伤中的作用。方法：应用双大腿根部绑扎止血带复制大鼠双后肢缺血再灌注肺损伤模型。在再灌注前20 min腹腔注射Na2 SO3／NaHSO3；在再灌注前1 h静脉注射Stattic或LY294002。应用TUNEL、ELISA、Western blot等方法检测细胞凋亡、细胞因子表达及相关信号通路蛋白表达的情况。结果：与对照组相比， I／R组的MDA及MPO含量、肺系数、细胞凋亡指数、细胞因子表达以及p－STAT3、p－Akt蛋白的水平均显著增高；当应用Na2 SO3／NaHSO3后，上述反映肺损伤的各项指标均下降。 Western blot检测结果显示I／R后，肺组织中p－STAT3和p－Akt蛋白的水平均明显增加。而应用Na2 SO3／NaHSO3后， p－Akt蛋白的水平继续增加，但 p－STAT3蛋白的水平却减少（P＜0．05）。结论： JAK2／STAT3和PI3K／Akt 信号通路都参与了SO2抗肢体缺血再灌注致急性肺损伤的作用。JAK2／STAT3通路的活化，能够使I／R损伤加重；相反，PI3K／Akt信号通路的活化，可以使I／R损伤减弱。此外， JAK2／STAT3和PI3K／Akt信号通路之间存在交互作用。

激活 Nodal 信号通路促进小鼠胚胎干细胞向定型内胚层分化

目的：探讨激活Nodal信号通路在小鼠胚胎干细胞（ embryonic stem cells，ESC）向定型内胚层（ de－finitive endoderm，DE）分化中的作用，寻找小鼠ESC向DE分化的佳培养体系。方法：根据培养基的不同，实验分为3组：胚胎干细胞组（基础培养＋LIF）、自然分化组（基础培养基）和activin A组（基础培养基＋50μg／L activin A）。细胞培养1～7 d，收集不同作用时点（1、3、5、7 d）的细胞及细胞爬片。用流式细胞术检测CXCR4阳性细胞的比例；免疫细胞化学法检测CXCR4蛋白的表达；Western blot检测OCT4及CXCR4蛋白的表达。结果：流式细胞术检测结果提示，随着培养时间的延长，CXCR4阳性细胞的比例，胚胎干细胞组在1～7 d无明显变化，自然分化组和activin A组逐渐增高，第5天达高峰（P＜0．05），其中activin A组高（P＜0．05）。细胞免疫组化结果显示CX－CR4阳性细胞呈棕褐色或棕黄色。 Western blot的结果提示，随着培养时间的延长，胚胎干细胞组OCT4和CXCR4蛋白表达无明显变化；自然分化组和activin A组的CXCR4蛋白的表达逐步增高，OCT4蛋白的表达逐步下降，第5天达高峰（P＜0．05），其中activin A组的表达明显（P＜0．05）。结论：在小鼠ESC分化过程中，在诱导培养的第5天， DE的比例高。激活Nodal信号通路可以促进小鼠ESC向具有CXCR4分子标志的DE分化，有利于获取更多的DE细胞。

高糖激活Ca2＋－CaN－NFAT3信号通路致H9c2细胞肥大

目的：利用细胞实验探讨不同高糖浓度培养H9c2细胞是否引起心肌细胞肥大，探讨Ca2＋－CaN－NFAT3信号通路是否参与高糖引起H9c2心肌细胞肥厚过程。方法：体外培养H9c2大鼠心肌细胞48 h，分为5 mmol／L糖对照组、25mmol／L糖培养组、50 mmol／L糖培养组、25mmol／L糖培养加L型钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平[商品名络活喜（Norvasc）]组和50 mmol／L糖培养加Norvasc组5组。观察H9c2细胞形态并测量细胞表面积大小；荧光分光光度法检测心肌细胞内钙离子浓度[ Ca2＋] i；ELISA测细胞内CaN浓度；real－time PCR法及Western blot检测 CaNAβ、NFAT3和β－MHC的mRNA及蛋白表达。结果：细胞大小、单细胞平均[ Ca2＋] i 测定荧光值及细胞内CaN浓度在随糖浓度升高呈阶梯上升，50 mmol／L时达到高点。加入Norvasc后细胞大小较相同条件不加Norvasc者降低。 CaNAβ、NFAT3和β－MHC的mRNA及蛋白表达随糖浓度升高逐步升高，50 mmol／L时达高。加入Norvasc后CaNAβ、NFAT3和β－MHC的mRNA及蛋白表达均较未加Narvasc组明显降低。结论：高糖通过激活Ca2＋－CaN－NFAT3信号通路引起H9c2心肌细胞肥大。

糖尿病溃疡中 Wnt／β－catenin 信号通路表达的变化

目的：观察糖尿病（ DM）溃疡中Wnt／β－catenin信号通路表达的变化，探讨该信号通路在糖尿病难愈性溃疡中的作用。方法：雌性Wistar大鼠采用高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素液腹腔注射法制备糖尿病模型。分别取正常对照组与DM组制作溃疡模型。观察创面造模后第3天、第7天和第14天对照组及DM组创面愈合情况的变化，并采用HE染色法检测创面组织形态结构的变化，采用ELISA法和RT－PCR法检测创面组织中β－catenin、GSK－3β和Rspo－3蛋白及mRNA的变化。结果： DM组大鼠的创面愈合率明显低于对照组（ P＜0．05），且与对照组相比，其创面组织中含有较少的炎性细胞、纤维母细胞及新生毛细血管。 DM组大鼠创面组织中β－catenin和Rspo－3蛋白及mRNA的表达水平均低于对照组，GSK－3β蛋白及mRNA的表达水平均高于对照组（ P＜0．05）。结论：Wnt／β－catenin通路的下调有可能导致了糖尿病溃疡的难愈，而该通路的下调可能源自于Rspo－3蛋白表达的下降。

干扰P2X7R基因对RAW264．7细胞增殖和吞噬的影响

目的：应用RNA干扰技术抑制小鼠巨噬细胞RAW264．7细胞P2X7受体（ P2X7 R）基因的表达，建立稳定干扰细胞株，并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法：用脂质体法将P2X7 R shRNA重组质粒转染至RAW264．7细胞，经 G418筛选后获得稳定干扰细胞株。细胞分为野生型（ WT ）组、阴性对照（ NC ）组和干扰（shP2X7R）组。 Real－time PCR法检测细胞中P2X7R mRNA的表达，Western blot检测细胞中P2X7R蛋白的表达；CCK－8方法检测细胞生长活性，5－乙炔基－2’－脱氧尿苷（5－ethynyl－2’－deoxyuridine，EdU）掺入实验检测细胞增殖活性；流式细胞术分析细胞周期的分布和吞噬情况。结果：P2X7 R shRNA能明显抑制RAW264．7细胞的P2X7 R mR－NA和蛋白的表达，抑制率在80％以上。48 h后，shP2X7R组细胞的生长速度明显高于NC组和WT组（P＜0．05），增殖期细胞比例明显升高（P＜0．05），说明下调P2X7R基因能明显促进细胞增殖。 shP2X7R组的细胞周期出现改变，S期和G2／M期的比例明显上升，增殖指数增高（P＜0．05）。 shP2X7R组的细胞吞噬活性明显高于NC组（P＜0．05）。结论：本研究成功构建了稳定干扰P2X7 R基因表达的小鼠巨噬细胞株RAW264．7，shP2X7 R能够明显促进RAW264．7细胞的增殖，改变了细胞的吞噬活性。

米诺环素后处理通过抑制 PARP 过度活化减轻心肌缺血／再灌注损伤

目的：探讨米诺环素后处理能否通过抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶1（ PARP－1）过度活化减轻大鼠心肌缺血／再灌注（ I／R）损伤。方法：结扎大鼠冠状动脉左前降支45 min，再灌注2 h，建立心肌I／R模型。将90只雄性Wistar大鼠随机分为假手术（ sham）组， I／R组，低、高剂量米诺环素组及PARP抑制剂3－氨基苯甲酰胺（3－AB）组。氯化三苯基四氮唑（TTC）和伊文思蓝双染法检测心肌梗死范围，HE 染色观察心肌组织形态学改变， TUNEL法评估心肌细胞凋亡程度，酶联免疫吸附法测定血清肿瘤坏死因子α（ TNF－α）和白细胞介素1β（ IL－1β）含量，Western blot法检测再灌注心肌及外周血白细胞内PARP－1活化产物多腺苷二磷酸核糖（ PAR）的表达。结果：与sham组比较，心肌、外周血白细胞内PAR表达及血清TNF－α、IL－1β含量明显升高。与I／R组比较，米诺环素低、高剂量及3－AB后处理组均能显著减少梗死范围及心肌细胞凋亡程度，同时明显降低心肌、外周血白细胞内PAR表达及血清TNF－α、IL－1β含量。米诺环素高剂量组与3－AB组比较无显著差异。结论：米诺环素后处理可能通过抑制心肌及外周血白细胞PARP过度活化减轻大鼠心肌I／R损伤。

GLP－1受体激动剂对肥胖小鼠脂肪组织的脂解作用及机制探讨

目的：探讨胰高血糖素样肽1（GLP－1）受体激动剂艾塞那肽（exendin－4）对肥胖小鼠脂肪组织的作用及机制。方法：8周龄C57 BL／6 J小鼠高脂喂养12周后随机分为艾塞那肽组和生理盐水对照组，另设正常饮食组。取附睾旁脂肪检测sirtuin 1（SIRT1）、脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）、肿瘤坏死因子α（TNF－α）及脂联素mRNA的表达。 Exendin－4或联合SIRT1激动剂／抑制剂处理3T3－L1脂肪细胞24 h；小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）诱导成脂肪细胞后exendin－4干预24 h；检测SIRT1、ATGL和激素敏感性脂酶（ HSL）的蛋白表达水平。结果：与生理盐水对照组相比，艾塞那肽组小鼠附睾旁脂肪量、空腹血糖及血甘油三酯水平降低（均P＜0．05），体重减轻，血TNF－α水平降低。艾塞那肽干预后，肥胖小鼠脂肪组织SIRT1、ATGL和脂联素 mRNA表达明显上调，TNF－αmRNA表达明显下调（P＜0．05）。 Exendin－4剂量依赖性促进3T3－L1脂肪细胞SIRT1、ATGL和HSL脂解相关蛋白的表达。联合SIRT1激动剂后，脂滴数量减少，上述脂解相关蛋白的表达上调。联合SIRT1抑制剂后上述作用减弱。敲除SIRT1后MEF脂肪细胞内脂滴增大，数量增多，exendin－4促进脂解的作用消失。结论：艾塞那肽通过激活SIRT1促进肥胖小鼠脂肪组织脂解作用。

人羊膜上皮细胞移植改善 AD 样病变模型大鼠学习记忆能力

目的：观察人羊膜上皮细胞（ hAECs）对阿尔茨海默病（ AD）样病变大鼠模型的治疗效应。方法：采用胰蛋白酶消化法分离hAECs，流式细胞术分析表型。48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、培养基组和hAECs移植组，每组12只。采用双侧脑室注入脂多糖（ LPS）复制AD样病变大鼠模型。 AD样病变大鼠海马区移植5×105个hAECs。细胞移植后2周，Morris水迷宫试验观察行为学变化，HE和硫磺素S染色观察海马病理变化，免疫组化染色检测β－淀粉样蛋白42（Aβ42）、Tau蛋白和乙酰胆碱（ACh）的变化，流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的变化，流式微球阵列捕获技术（ cytometric bead array，CBA）检测血清细胞因子含量，免疫荧光染色检测海马区人细胞核抗原阳性细胞及其神经元特异性核蛋白（ NeuN ）的表达。结果：与模型组和培养基组比较， hAECs移植组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P＜0．01），跨域平台次数明显增加（P＜0．05）；海马神经元病损减轻，Aβ沉积减轻（P＜0．05），磷酸化Tau蛋白水平下降（P＜0．05），ACh增加（P＜0．05）；外周血Th1和Th17细胞百分比下降（P＜0．05），而Th2和Treg细胞升高（P＜0．05）；IL－2和IFN－γ水平下调（P＜0．05），而IL－4上调（P＜0．05）；移植区可见hAECs，并表达NeuN。结论：hAECs可明显改善AD样病变模型大鼠空间辨别性学习记忆能力，减轻海马病理损伤，其免疫调节效应可能发挥重要作用。

miRNA－25对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖的影响

目的：探讨过表达／沉默微小RNA－25（ microRNA－25，miRNA－25）对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖能力的影响及其作用机制。方法：RT－PCR检测各临床样品组织中miRNA－25的表达水平。建立miRNA－25过表达／沉默的TE1细胞株，采用CCK－8法、BrdU实验和流式细胞术检测TE1细胞增殖能力的变化及细胞周期状态；Western blot法和RT－PCR法检测细胞周期调控因子细胞周期蛋白E1（ cyclin E1）和细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）的蛋白与mRNA表达水平。结果：miRNA－25在食管黏膜组织中具有特异性表达并在TE1细胞中呈高表达。 CCK－8法和BrdU实验结果显示过表达miRNA－25的TE1细胞的增殖能力显著增加（ P＜0．05），而沉默miR－NA－25抑制TE1细胞的增殖；流式细胞术检测结果显示过表达miRNA－25可明显促进TE1细胞从G0／G1期向S期转换，沉默miRNA－25则抑制其转换。同时Western blot和RT－PCR实验结果显示过表达miRNA－25后，cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表达水平均显著增加（P＜0．05），沉默miRNA－25后则显著减少（P＜0．05）。结论： miRNA－25能够促进人食管鳞状细胞癌细胞株TE1的增殖，其作用机制可能与促进细胞周期转换及上调cyclin E1和CDK2的表达水平有关，提示miRNA－25可作为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在靶点。

M cl－1信号通路阻断剂对 H37 Rv 感染小鼠巨噬细胞凋亡的影响

目的：探讨Mcl－1信号通路阻断剂在结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠模型中对Mcl－1表达、巨噬细胞凋亡情况及结核分枝杆菌的影响。方法：小鼠腹腔注射H37 Rv菌悬液，建立感染小鼠模型，针对Mcl－1的信号通路选用JAK／STAT信号通路阻断剂AG490、MAPK信号通路阻断剂PD98059和PI3K信号通路阻断剂LY294002用腹腔注射方式作用于各组感染小鼠模型，分为H37Rv感染组、AG490处理组、PD98059处理组、LY294002处理组和对照组。通过细胞抗酸染色观察结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬细胞的动物模型是否建立成功；通过免疫细胞化学检测结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞的Mcl－1表达情况，使用流式细胞技术检测各组巨噬细胞的凋亡率，采用结核分枝杆菌菌落计数来判断巨噬细胞凋亡对结核分枝杆菌的清除效果。结果：细胞抗酸染色结果可见感染的巨噬细胞内散在排列的红色短小抗酸结核分枝杆菌。免疫细胞化学结果显示H37Rv感染组、AG490处理组和LY294002处理组中的Mcl－1蛋白为强阳性表达，PD98059处理组中Mcl－1蛋白为弱阳性表达，对照组Mcl－1蛋白为阴性表达。流式细胞术检测发现H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率较对照组高，PD98059处理组的凋亡率显著高于各组，差异显著（P＜0．05）。结核分枝杆菌菌落计数结果显示PD98059处理组对H37Rv菌株抑菌作用明显。结论：Mcl－1信号通路阻断剂通过抑制JAK／STAT、MAPK和PI3K信号通路增加结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞的凋亡率，抑制结核分枝杆菌生长；其中，MAPK信号通路干扰Mcl－1的作用明显，感染的巨噬细胞凋亡率高，抑菌作用强。

p21活化激酶4在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的：探讨p21活化激酶4（ PAK4）在人非小细胞肺癌细胞系及人非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法：采用Western blot及实时荧光定量PCR检测人支气管上皮（ HBE ）细胞、非小细胞肺癌细胞（ A549、NCI－H520、NCI－H460和NCI－H596细胞）、20例新鲜非小细胞肺癌组织及相应的癌旁组织中PAK4的表达情况；采用免疫组化检测210例非小细胞肺癌组织PAK4的表达情况；采用Kaplan－Meier法评估非小细胞肺癌患者术后5年生存率；用Cox比例风险模型分析PAK4对患者预后的影响。结果：非小细胞肺癌细胞（ A549、NCI－H520、NCI－H460和NCI－H596细胞） PAK4蛋白及mRNA表达均显著高于HBE细胞（ P＜0．05）；20例非小细胞肺癌组织中PAK4蛋白及mRNA表达高于癌旁组织PAK4蛋白及mRNA表达（ P＜0．05）；10例转移性非小细胞肺癌组织PAK4 mRNA表达显著高于10例原发性非小细胞肺癌组织（ P＜0．05）；免疫组化染色结果示210例非小细胞肺癌PAK4评分显著高于对应的癌旁组织。临床资料分析显示PAK4蛋白表达与非小细胞肺癌的分化程度、淋巴结转移、远处转移及临床分期有关（P＜0．05）；PAK4高表达组患者5年生存率显著低于PAK4蛋白低表达组患者（log－rank检验，P＜0．05），PAK4蛋白表达是非小细胞肺癌患者的独立预后因素。结论： PAK4蛋白高表达是非小细胞肺癌患者死亡的独立危险因素。

抑制白血病 K562细胞 FoxM1表达可增强细胞对高三尖杉酯碱的敏感性

目的：探讨抑制白血病K562细胞叉头框蛋白M1（FoxM1）是否增强细胞对高三尖杉酯碱（HHT）的敏感性。方法：HHT以不同浓度（0、0．015、0．030和0．045μmol／L）和低起效浓度不同时间（0．015μmol／L，0、24、48和72 h）作用于K562细胞，real－time PCR和Western blot检测FoxM1 mRNA和蛋白表达；以0．015μmol／L HHT作用K562细胞后转染FoxM1 siRNA，观察沉默K562细胞FoxM1后细胞对HHT的敏感性、细胞增殖和凋亡效应以及FoxM1相关靶分子c－Myc和Sp1表达状况。结果：随着HHT浓度增加和时间延长FoxM1表达逐渐降低，说明HHT抑制K562细胞FoxM1表达；HHT处理K562细胞后转染FoxM1 siRNA，细胞生长和克隆形成显著下降，细胞凋亡增加，因此抑制FoxM1可增加K562细胞对HHT的敏感性；FoxM1 siRNA组c－Myc和Sp1表达显著降低，表明FoxM1可正性调控c－Myc和Sp1表达。结论：HHT可以抑制白血病K562细胞FoxM1表达，干扰FoxM1可增强细胞对HHT的敏感性。

m iR－21在周围神经损伤时调控雪旺细胞凋亡

目的：探讨周围神经损伤时，微小RNA－21（microRNA－21，miR－21）与雪旺细胞（SC）凋亡的关系及相关分子机制。方法：采用实时荧光定量PCR（ real－time PCR）检测动物模型中miR－21以及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）的表达情况；通过将miR－21类似物（miR－21－mimic）、miR－21抑制物（miR－21－inhibitor）和阴性对照miRNA（negative control miRNA， NC－miRNA）转染入RSC96细胞中，构建出过表达miR－21的雪旺细胞株（ MI－SC）、抑制miR－21表达的雪旺细胞株（ IN－SC）及表达对照miRNA的雪旺细胞株（ NC－SC）；采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡情况； real－time PCR检测3组细胞中miR－21以及PTEN的表达情况；Western blot检测3组细胞中PTEN及凋亡相关蛋白激活型caspase－3（ cleaved caspase－3）的表达情况。结果：神经损伤组miR－21的表达量与对照组相比明显升高，神经损伤组PTEN mRNA的表达水平与对照组相比明显降低；与NC－SC相比，上调miR－21组细胞的凋亡比例减少，PTEN mRNA及蛋白的表达水平降低，cleaved caspase－3的表达水平降低，下调miR－21组细胞的凋亡比例增加，PTEN mRNA及蛋白的表达水平升高，cleaved caspase－3的表达水平升高（P＜0．05）。结论： miR－21可能通过下调PTEN的表达抑制雪旺细胞的凋亡，从而可能在周围神经的损伤修复中发挥作用。

过表达BMP9对人肺鳞状细胞癌细胞NCI－H520迁移和侵袭的影响

目的：探讨骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）对人肺鳞状细胞癌细胞NCI－H520迁移和侵袭的影响及其机制。方法：采用RT－PCR和Western blot法分别检测NCI－H520细胞和正常人支气管上皮（ HBE）细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达水平；用AdBMP9感染NCI－H520细胞，RT－PCR和Western blot法验证BMP9的变化；应用划痕愈合实验检测各组细胞的迁移能力， Transwell小室检测迁移和侵袭能力，并用RT－PCR和Western blot法检测迁移相关因子基质金属蛋白酶2（ MMP2）的mRNA和蛋白水平。 Western blot法检测BMP－Smad经典通路中Smad1／5的磷酸化水平（ p－Smad1／5）。用BMP特异性拮抗剂AdNoggin与AdBMP9共处理NCI－H520细胞，检测p－Smad1／5及细胞迁移能力的变化。结果：BMP9在NCI－H520细胞中的mRNA和蛋白水平均比在HBE细胞中低；AdBMP9感染的NCI－H520细胞中BMP9的mRNA和蛋白水平均明显升高，细胞迁移和侵袭能力均明显下降，MMP2的mRNA和蛋白水平下降，且p－Smad1／5的表达水平明显上调。在NCI－H520细胞中，Noggin能有效逆转BMP9导致的p－Smad1／5升高和细胞迁移抑制能力。结论：外源性BMP9转入肺鳞癌细胞NCI－H520可明显抑制其迁移侵袭的能力，该抑制作用可能与BMP－Smad信号通路的激活有关。

Adipophilin 通过 ERK1／2－AP－1途径诱导炎症因子的表达

目的：观察巨噬细胞中脂肪分化相关蛋白（ adipophilin）对炎症因子表达的影响，阐明adipophilin促进巨噬细胞炎症因子表达的机制。方法：将已构建成功的adipophilin稳定高、低表达逆转录病毒载体转染入PA317包装细胞，制备adipophilin高和低表达的RAW264．7细胞；收集已转染成功的各组细胞上清液，用ELISA方法检测IL－6、TNF－α、MCP－1等炎症因子在细胞培养液中的浓度。 Western blot检测各组细胞AP－1、p－AP－1、ERK1／2及p－ERK1／2的蛋白水平；用ERK1／2抑制剂PD98059或AP－1抑制剂curcumin孵育细胞，检测各组细胞中以上指标的变化情况。结果：高表达adipophilin的细胞上清液中炎症因子IL－6、MCP－1和TNF－α浓度明显增高，adipophil－in siRNA组细胞中的炎症因子降低；高表达adipophilin的细胞中p－ERK1／2和p－AP－1的蛋白水平增高，adipophilin siRNA组则减少；ERK1／2抑制剂PD98059使AP－1蛋白活性明显下调；给予AP－1抑制剂curcumin后，细胞培养液中的IL－6、MCP－1和TNF－α浓度明显下降。结论：Adipophilin在RAW264．7巨噬细胞中能够促进炎症因子的表达。

重组人可溶性 TRAIL 的制备及其联合硼替佐米诱导肿瘤细胞的凋亡作用

目的：构建重组人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ tumor necrosis factor－related apoptosis－indu－cing ligand，TRAIL）原核表达质粒pET－28a （＋）－TRAIL114－281，优化蛋白表达和纯化条件，制备重组人可溶性TRAIL并鉴定其活性。方法：使用CCK－8初步验证TRAIL是否具有抑制肿瘤细胞生长的生物活性；将制备的TRAIL单独或联合50 nmol／L硼替佐米应用于H460细胞（对TRAIL敏感）和K562细胞（对TRAIL抵抗）24 h，流式细胞术检测细胞凋亡率，比色法检测caspase－8、－9、－3的活化程度，Western blot分析细胞中Bax、Bcl－2和cFLIP蛋白的表达。流式细胞术检测硼替佐米处理H460细胞和K562细胞24 h后DR4和DR5的表达量变化。结果：制备了具有生物学活性且性质稳定的重组人可溶性TRAIL，且成功诱导H460和K562细胞凋亡。不同浓度TRAIL处理H460细胞后其凋亡率随着TRAIL浓度升高而显著升高（P＜0．05），但K562细胞凋亡率并未随着TRAIL浓度明显升高。联合用药组的H460和K562细胞凋亡率均显著高于单独用药组（P＜0．05），凋亡过程中caspase－8、－9、－3均被活化，药物处理组的Bcl－2和cFLIP表达量均比对照组下降，尤其联合用药组表达量下降为显著（ P＜0．05），而Bax表达量无明显变化。硼替佐米处理H460和K562细胞后DR4和DR5表达量均上调（ P＜0．05）。结论：硼替佐米能协同TRAIL启动内源性凋亡途径诱导H460和K562细胞凋亡，其可能机制是通过上调死亡受体DR4和DR5的表达量、下调抗凋亡蛋白Bcl－2和cFLIP的表达量来实现的。

高压氧疗法对大鼠心理应激条件下的牙周炎治疗效果观察

目的：探讨心理应激对大鼠实验性牙周炎的影响，观察高压氧（ hyperbaric oxygen， HBO）治疗对心理应激相关牙周炎的疗效。方法：清洁级4周龄雄性Wistar大鼠80只，随机分为4组：（1）正常对照组；（2）牙周炎组：用浸有牙龈卟啉单胞菌株的丝线结扎左侧上颌第2磨牙牙颈部，复制实验性牙周炎模型；（3）单纯应激组；（4）牙周炎＋应激组。于实验后第9周停止应激刺激，对除正常对照组外其它各组大鼠每组选取4只进行HBO治疗。于实验后2、4和8周末分批处死动物，每组处死4只，于实验后10周末处死动物，每组处死8只。采血检测血糖浓度、血浆促肾上腺皮质激素（ ACTH）、皮质类固醇和肾上腺素含量。测量术区的牙周附着情况，制作牙体牙周联合切片，观察牙周的组织学改变。结果：检测应激标记物的变化可见单纯应激组的血糖及血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素含量在实验后第2、4周明显高于正常对照组和牙周炎组（ P＜0．01），第8周时血糖降至正常水平，但血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素含量仍高于正常对照组和牙周炎组（ P＜0．05）；牙周炎＋应激组在实验后第2、4和8周血糖及血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素含量均高于正常对照组和牙周炎组（ P＜0．05）；HBO治疗组牙周炎＋应激组血糖明显低于非治疗组（ P＜0．01），单纯应激组和牙周炎＋应激组血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素水平显著下降（P＜0．01）。大体观察可见正常对照组及单纯应激组牙周附着位置正常；牙周炎组出现牙龈萎缩，附着丧失明显；牙周炎＋应激组附着丧失明显，根分叉暴露，HBO治疗后，牙龈水肿减轻，牙周袋变浅。单纯应激组与正常对照组在各时点的牙周附着水平的差异不显著（P＞0．05）；牙周炎＋应激组附着丧失程度在各时点均明显高于牙周炎组（P＜0．01）；HBO治疗结束后牙周炎组及牙周炎＋应激组牙周附着丧失程度减轻（P＜0．01）。组织学观察可见牙周炎＋应激组牙周组织破坏程度在各时点均重于牙周炎组；经HBO治疗后，牙周组织炎症程度减轻，炎症细胞浸润减少。结论：心理应激可加重牙周炎进程。 HBO对大鼠实验性牙周炎及心理应激相关牙周炎均有治疗效果。

Notch1对神经胶质瘤 U251细胞干性及化疗药物敏感性的调节

目的：探讨Notch1对人胶质瘤U251细胞干性和药物敏感性的影响。方法：用高表达Notch1胞内段（Notch1 intracellular domain， NICD1）和Notch1－shRNA慢病毒表达载体感染体外培养的人胶质瘤U251细胞， Western blot和免疫荧光染色法鉴定高表达NICD和Notch1沉默细胞。通过流式细胞术检测分析CD133＋细胞的比例、免疫荧光染色法检测nestin和GFAP的表达情况、检测肿瘤细胞球的形成率和SCID小鼠体内种植致瘤情况，分析Notch1对细胞干性的调节。并采用MTT法检测各组细胞对化疗药物替尼泊苷（VM－26）和卡莫司汀（BCNU）的敏感性。结果：NICD表达增加的瘤细胞干性表型增强，如CD133＋细胞的比例增加、nestin表达增强而GFAP表达减弱、肿瘤细胞球的形成率和SCID小鼠种植致瘤率增加，并伴有对VM－26和BCNU的敏感性降低。而Notch1基因表达下调的瘤细胞干性表型受到明显抑制，而对VM－26和BCNU的敏感性增高。结论：Notch1高表达可增加人胶质瘤U251细胞的干性，减弱U251细胞对化疗药物的敏感性。

甘氨酸受体α1亚基在乳鼠心肌细胞的表达及损害性因素对其表达的影响

目的：研究甘氨酸受体α1亚基（GlyRα1）在乳鼠心肌细胞中的表达以及脂多糖（LPS）、缺氧／复氧（ H／R）、异丙肾上腺素（ ISO）和高糖（ HG）对其表达的影响。方法：体外培养乳鼠心肌细胞，Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达；心肌细胞分别用LPS、H／R、ISO以及HG处理24 h，采用CCK－8试剂检测细胞活力， Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达。结果： Western blotting 方法检测到乳鼠心肌细胞上GlyRα1的表达；LPS（20 mg／L）、ISO（100μmol／L）以及HG（25mmol／L）处理心肌细胞24 h与心肌细胞H／R 3 h对心肌细胞存活率无明显影响；LPS组、H／R 3 h组以及ISO组心肌细胞上GlyRα1表达均高于对照组（ P＜0．01），而HG组心肌细胞上GlyRα1表达低于对照组（P＜0．01）。结论：乳鼠心肌细胞上存在GlyRα1，并且一定浓度的LPS、ISO与一定时间的H／R均可上调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达，而HG可下调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达。

微小RNA－188调控骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化之间的年龄相关性转换

骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）具有年龄依赖性的向成骨细胞分化能力减弱同时向脂肪细胞分化能力增强的特性。这个特性在提高脂肪细胞数量的同时降低了成骨细胞数量，有助于解释与年龄相关的骨质流失。
　　Li等的研究发现，与年幼的小鼠及人类相比，随着年龄的增长，BMSCs中微小RNA－188（ microRNA－188， miR－188）的水平显着升高。与对照组小鼠相比，缺乏miR－188的小鼠明显减少了年龄相关性骨质流失及骨髓脂肪堆积。相反，相对于野生型小鼠，过表达miR－188的转基因小鼠则大幅增加了年龄相关性骨质流失和骨髓脂肪堆积。此外，使用适体递送系统在小鼠BMSCs中特异性过表达miR－188能降低骨形成和增加骨髓脂肪堆积。他们还发现组蛋白脱乙酰酶9（histone deacetylase 9， HDAC9）和雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣（ rapamycin－insensitive companion of mTOR， RICTOR）是miR－188的直接作用靶点。值得注意的是，通过骨髓内注射miR－188拮抗剂（aptamer－antagomiR－188）而特异性抑制BMSCs的miR－188，可增加老年小鼠骨形成，减少骨髓脂肪堆积。

失血性休克后肠淋巴液引流恢复小鼠肾组织ACE／ACE2平衡的作用

目的：观察失血性休克后肠淋巴液（ PHSML）引流对失血性休克小鼠肾组织血管紧张素转换酶（ ACE）／ACE2平衡的作用。方法：复制小鼠失血性休克模型，随机分为休克组与休克＋引流组，行液体复苏；休克＋引流组液体复苏后，引流肠淋巴液。在液体复苏后6 h，检测肾组织ACE、ACE2、血管紧张素II（Ang II）1型受体（AT1R）、Mas相关G蛋白偶联受体（MasR）的mRNA表达以及Ang II、Ang （1－7）含量。结果：失血性休克提高了肾组织ACE mRNA、AT1R mRNA和Ang II水平，降低了ACE2 mRNA、MasR mRNA 和Ang（1－7）水平，PHSML引流抑制了失血性休克对ACE2和AT1R mRNA表达的影响；同时PHSML引流也降低了失血性休克增加ACE／ACE2、Ang II／Ang（1－7）和AT1R／MasR比值的作用。结论：PHSML引流恢复了失血性休克后肾组织的ACE／ACE2平衡，有利于减轻失血性休克所致的肾损伤。

昆明山海棠对CIA大鼠足爪组织MMP－13蛋白表达及血清和足爪组织中IL－12、IL－23和IL－37水平的影响

目的：探讨昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum Hutch，THH）对胶原性关节炎（collagen－induced arthritis，CIA）大鼠的干预作用及可能的机制。方法：SD大鼠50只，随机分为正常组和胶原性关节炎模型制作组，用鸡Ⅱ型胶原诱导制作CIA大鼠模型。将造模成功的36只大鼠随机分为模型组、地塞米松治疗组与THH 200 mg／kg、400 mg／kg干预组。 ELISA法检测CIA大鼠血清和足爪组织中促炎因子IL－12、IL－23和抑炎因子IL－37的含量；HE染色观察各组大鼠足爪组织病理学变化；Western blot法检测足爪组织MMP－13蛋白的表达；荧光标记法检测大鼠足爪组织中MMP－13的活性。结果：较模型组比较， THH 400 mg／kg治疗组大鼠体重下降明显减轻（ P ＜0．01），血清中IL－12和IL－23的水平分别降低了28．31％和41．57％（P＜0．01），足爪组织中IL－12和IL－23的含量分别下降了30．78％和39．46％，而血清和足爪组织中IL－37的水平显著升高了79．43％和75．78％（P＜0．01），足爪皮下组织病理变化明显减轻，足爪组织中MMP－13蛋白表达降低了49．22％（ P＜0．01），且MMP－13活性明显下降。而THH 200 mg／kg治疗组大鼠上述指标无明显改善。结论： THH对CIA大鼠炎症的明显抑制作用可能与其降低促炎因子IL－12和IL－23、增高抑炎因子IL－37含量，抑制炎性细胞浸润及血管增生、下调MMP－13蛋白表达、降低MMP－13活性有关。

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《中国病理生理杂志》第六届编辑委员会

长链非编码 RNA 对心脏发育的表观遗传学调控研究进展

长链非编码RNA （ long noncoding RNA or large noncoding RNA， lncRNAs ）是一类转录本长度超过200 nt的功能性RNA，存在于细胞核或胞质中。 ln－cRNAs能调节生命过程中关键基因的表达，从而影响机体正常生理发育、功能维持和异常病理过程，如神经干细胞分化发育、心脏疾病发生、肿瘤形成等［1］。 lncRNAs是继miRNAs之后的又一重要调节性非编码RNA。已有研究表明， lncRNAs能够与染色质修饰蛋白、DNA或miRNAs等核酸形成复合物，在表观遗传、转录和转录后多个层次调控心脏发育基因的表达，其中表观遗传学调控是近几年的研究热点。本文从心脏发育和心脏疾病两方面综述ln－cRNAs在心脏发育稳态中的新研究进展及其表观遗传学调控机制。

长链非编码 RNAs 的生物功能及其与器官发育和恶性肿瘤的关系

在组成人类的约30亿个碱基对中，蛋白编码序列只占1．5％，而其余不编码蛋白质的序列曾一度被认为是基因组进化过程中的“垃圾序列”。2013年发布的ENCODE研究数据表明，所谓的“垃圾序列”绝大多数被转录成分子长度超过200个核苷酸的长链非编码RNAs （ long noncoding RNAs， lncRNAs ）。随着高通量检测技术的发展，lncRNAs的面纱逐渐被揭开，并根据其与编码基因的位置关系可分为正义、反义、基因间等6类［1］。 lncRNAs由RNA聚合酶Ⅱ转录产生，不具有或少有开放阅读架（ open reading frame， ORF），在多种层面调控包括细胞分化和个体发育在内等的重要生命进程，其异常表达还与多种人类重大疾病密切相关。本文结合国内外lncRNAs的研究现状，对其生物学功能，包括对基因表达的调控功能、在细胞分化和个体发育中的作用及其与常见恶性肿瘤的关系进行综述。

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