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当归拈痛汤对类风湿关节炎大鼠滑膜细胞凋亡通路的影响
目的:观察当归拈痛汤对类风湿关节炎大鼠足趾关节的改变情况及探讨其对滑膜细胞凋亡通路的影响.方法:选取50只Wistar雄性大鼠,并随机分为模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组;除对照组外其余均建立胶原诱导的关节炎(Collagen Induced Arthritis,CIA)模型,在类风湿关节炎模型制备成功后开始给药:对照组和模型组予以6.5 g/kg生理盐水,低剂量组、中剂量组和高剂量组均为当归拈痛汤灌胃给药,分别给予生药6.5 g/kg,13.0 g/kg,19.5 g/kg.干预时间28d.采用容积法测量双后肢的足趾关节肿胀度;采用足趾关节苏木精-伊红(HE)染色计算细胞凋亡数;采用免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测Bcl-2、PI3K、Bax的蛋白表达情况.结果:对照组未见足趾肿胀情况,给药1d模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),给药7 ～28 d各剂量给药组肿胀度均低于模型组(P＜0.05),至14 ～ 28 d中、高剂量组的肿胀度显著低于低剂量组(P＜0.05),而28 d高剂量组的肿胀度又明显低于中剂量组(P＜0.05).足趾关节HE染色中,对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组中的细胞凋亡数呈逐渐上升的趋势(P＜0.05).PI3K和Bcl-2蛋白在模型组中表达上调,经过给药治疗,随着剂量的逐渐升高而下调(P＜0.05);而Bax蛋白的表达情况则与PI3K相反,随着剂量的增加而上调(P＜0.05).结论:当归拈痛汤能有效改善类风湿关节炎大鼠足趾关节肿胀度,促进滑膜细胞的细胞凋亡数进而抑制滑膜细胞增殖的进程,而PI3K通路对细胞凋亡的调控起到关键的作用.
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李氏5号方对D-半乳糖老化小鼠海马神经元NGF信号转导的影响
通过检测D-半乳糖老化小鼠海马神经元NGF(神经生长因子)、PI3K(磷脂酰肌醇酯3激酶)、Akt/PKB(蛋白激酶B)、CREB(cAMP应答元件结合蛋白)的表达,观察李氏5号方对海马神经元NGF信号转导的影响.将小鼠随机分为5组:正常对照组(C组)、D-半乳糖模型组(D组)、李氏5号方大剂量药物治疗组(L组)、中剂量药物治疗组(M组)、小剂量药物治疗组(S组).D、L、M、S 4组每日皮下注射半乳糖65 mg/kg.L、M、S 3个治疗组分别灌胃李氏5号方0.6、0.3、0.15 g/kg,连续3个月.免疫组织化学染色方法和Western blotting检测海马神经元NGF、PI3K、Akt/PKB、CREB的表达.结果:4种抗体C组深染的阳性细胞在海马广泛分布,细胞计数与D组有显著性差异;D组海马阳性反应细胞着色浅,少有突起,细胞数目少.3个剂量李氏5号方治疗组染色结果与C组相似,与半乳糖老化组比较均有显著性差异,李氏5号方水提取液能明显上调NGF的PI3K通路中的一些信号转导蛋白,提示:李氏5号方水提取液中可能含有能激活PI3K的活性物质,为深入研究李氏5号方的有效成分打下基础.
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乳腺癌新辅助化疗疗效与PI3K/mTOR通路的相关性分析
目的 观察PI3 K/mTOR通路状态与乳腺癌新辅助化疗疗效之间的关系.方法 对2009年1月至2010年11月在北京大学第一医院乳腺疾病中心接受4～6个周期包含紫杉方案新辅助化疗的105例乳腺癌患者资料进行回顾性分析.用免疫组织化学方法检测新辅助化疗前肿瘤病灶PTEN、p-AKT( Ser473)和p-mTOR( Ser2448)的表达情况,用术后病理评价新辅助化疗疗效,病理学反应级别为G4、病理完全缓解(PCR)则认为化疗有效.通过x2检验、Fisher精确概率法和双边Logistic 回归探讨上述指标与新辅助化疗疗效之间的相关性.结果 105例患者中新辅助化疗有效率为58.1％ (61/105),其中PCR占27.6％ (29/105).PTEN、p-AKT和p-mTOR的阳性表达率分别为52.4％ (55/105)、68.6％ (72/105)、43.8％ (46/105).x2检验、Fisher精确概率法分析表明p-mTOR 与新辅助化疗疗效相关(P =0.003),与获得PCR相关(P=0.001)；双边Logistic回归表明p-mTOR是新辅助化疗疗效和获得PCR(均P＜0.01)的独立预测指标.p-AKT与p-mTOR表达水平差异有统计学意义(P=0.000).p-AKT与PR表达差异同样有统计学意义(P =0.035).结论 p-mTOR状态对于包含紫杉方案的新辅助化疗有预测意义,高表达患者疗效差,低表达患者更多地从化疗中获益.
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周期性张应力下人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达
背景：前期研究发现，周期性张应力在一定时间内可以诱导人牙周膜成纤维细胞增殖。目的：观察周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子的影响；明确JNK、p38MAPK、PI3K信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子过程中的作用。方法：采用多通道细胞牵张应力加载系统对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别给予周期性张应力刺激1，6，12，24 h，并以未加力组为对照组。对加力12 h的细胞分别添加JNK、p38MAPK、PI3K信号通路特异性抑制剂预处理，并与未加抑制剂的细胞作对比。应用ELISA法检测培养细胞分泌到上清液中的结缔组织生长因子蛋白；应用荧光定量PCR技术检测细胞结缔组织生长因子mRNA的表达。结果与结论：加载周期性张应力组与对照组相比较，1 h人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子开始增强、6 h表达明显增强，12 h达高峰值、24 h表达开始下降。加入JNK信号通路特异性抑制剂后，人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子出现下降；而加入p38MAPK信号通路和PI3K信号通路的特异性抑制剂后结缔组织生长因子表达未发生明显改变。提示在一定时间范围内，周期性张应力引起结缔组织生长因子 mRNA 与蛋白水平的表达与时间呈依赖性升高；其后随着时间的延长，结缔组织生长因子的表达则开始下降。周期性张应力通过 JNK 通路的介导调控人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达。
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PI3K通路抑制剂LY294002对人脑胶质瘤细胞株U87细胞衰老和凋亡的影响
目的:PI3K/Akt信号通路是与胶质瘤发生发展密切相关的核心通路之一,LY294002是该通路的特异性抑制剂.本研究通过探讨PI3K通路抑制剂LY294002对U87胶质瘤细胞系细胞衰老及凋亡的影响,从而为胶质瘤患者治疗的新策略奠定理论基础.方法:将体外培养的人脑胶质瘤U87细胞株分为DMSO处理的对照组和LY294002(100 μM)处理的实验组,采用β-半乳糖苷酶染色和流式细胞术的方法,分别检测并比较两组肿瘤细胞衰老和凋亡的情况.结果:LY294002处理组U87胶质癌细胞的衰老指数(32.20±4.46％)显著高于DMSO对照组(3.40± 1.61％,t=6.254,P＜0.001).另外,与DMSO对照组相比,凋亡蛋白caspase-3mRNA的表达在LY294002处理组胶质瘤细胞中显著上调(t=8.923,P＜0.05).LY294002处理组肿瘤细胞的凋亡指数(80.10±4.832％)明显高于DMSO对照组(4.260±1.073％,t=8.923,P＜0.05).结论:LY294002既能够诱导肿瘤细胞衰老,又能够诱导肿瘤细胞凋亡,然而其诱导胶质瘤细胞凋亡的能力占据主导地位,为其发挥抗胶质瘤效应的主要途径.另外,在LY294002的持续作用下,部分衰老的肿瘤细胞或许会发生凋亡.这些结论为为临床增强胶质瘤患者的联合化疗奠定了理论基础.
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TRPM7-PI3K在治疗性浅低温(34℃)处理的大鼠离体心肌缺血-再灌注模型中的作用
目的 在离体大鼠心肌缺血-再灌注模型中,检测常温下心肌缺血-再灌注损伤后TRPM7的表达水平变化以及治疗性浅低温(34℃)在心肌缺血-再灌注中对TRPM7的影响及其与PI3K通路的关系.方法 SPF清洁级健康成年雄性SD大鼠108只,随机分为六组,每组18只,SHAM组:正常大鼠组;I/R组:37℃灌流液灌流大鼠心脏30 min,缺血30 min,37℃灌注液再灌注120 min;I/R+2-APB组:37℃灌流液灌流30 min,缺血30 min,灌注液中加2-APB后行37℃灌注液再灌注120 min;34H+ I/R组:37℃灌流液灌流30 min,缺血30 min,34℃灌注液再灌注120 min;34H+ I/R+ WORT组:37℃灌流液灌流30 min,缺血30 min,在灌注液加wortmannin后行34℃灌注液再灌注120 min;34H+ I/R +2-APB组:37℃灌流液灌流30 min,缺血30 min,在灌注液中加2-APB后行34 ℃灌注液再灌注120 min.以压力换能器连接Medlab生物信号采集系统记录平衡灌流30 min末(T0,基础值),再灌注30 min(T1),60 min(T2),90 min (T3),120 min(T4)各时间点的心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室内压上升/下降大速率(±dp/dt max).在再灌注120 min末,取心脏进行HE染色观察心肌损伤,Westernblot测定TRPM7蛋白含量,并测定TTC染色后的心肌梗死面积.结果 I/R组TRPM7的表达量升高(P＜0.05),心肌梗死面积明显增多(P＜0.05);I/R+2-APB组与SHAM组和I/R组比较,TRPM7表达量明显减少(P＜0.05),心肌梗死面积与I/R组比较明显减少(P＜0.05);34H+ I/R组TRPM7的表达量与SHAM组和I/R组相比明显减少(P＜0.05),心肌梗死面积与I/R组相比明显减少(P＜0.05);34H+ I/R+ WORT组TRPM7表达量与34H+ I/R组相比增多(P＜0.05),心肌梗死面积与34H+ I/R组相比有所增加(P＜0.05);34H +I/R +2-APB组TRPM7表达量与34H+ I/R组相比差异无统计学意义(P＞0.05),与34H+ I/R+ WORT组相比其TRPM7表达量减少(P＜0.05);34H+ I/R+2-APB组心肌梗死面积与34H+ I/R组相比差异无统计学意义(P＜0.05),与34+ I/R+ WORT组相比,其心肌梗死面积减小(P＜0.05).各组之间血流动力学变化差异无统计学意义(P＜0.05).结论 在离体心肌缺血-再灌注模型中,心肌缺血-再灌注损伤时TRPM7蛋白呈现高表达;治疗性浅低温(34℃)可以抑制心肌缺血-再灌注中TRPM7的高表达,并且这种保护作用是通过PI3K通路介导产生的.
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Six1通过PI3K通路抑制肺癌细胞A549的增殖和迁移
目的：研究 Six1基因对人肺癌细胞 A549增殖和迁移能力的影响及其作用机制。方法将 Six1的特异小干扰 RNA序列转染入A549细胞中,应用Western印迹法检测Six1在A549细胞中的蛋白水平的表达情况,应用MTT法和细胞计数观察低表达 Six1对A549细胞增殖的作用,应用划痕实验和transwell侵袭小室实验检测A549细胞迁移能力的变化情况,应用 Western印迹法检测PI3K信号通路蛋白的表达变化。结果在 A549细胞中,特异的小干扰 RNA 使 Six1在蛋白水平表达降低,低表达 Six1的 A549细胞系增殖和迁移能力下降,p-AKT 的蛋白表达降低。结论在 A549细胞系中 Six1通过PI3K通路抑制 A549细胞的侵袭和转移能力。
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正常生理和1型糖尿病病理下慢性生长激素刺激对肝脏胰岛素信号的影响
目的 研究1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)状态下长期生长激素(growth hormone,GH)治疗对肝脏胰岛素信号的影响及其可能机制.方法 用慢性GH注射健康小鼠与链尿佐菌素(STZ)诱导的T1DM小鼠,Western blotting检测Akt和PTEN等.结果 在健康Balb/c小鼠,GH慢性刺激可抑制肝内胰岛素信号通路分子Akt磷酸化(P＜0.05),而该信号通途的负调控分子PTEN表达则显著增加(P＜0.05);在T1DM C57BL/6小鼠,慢性GH刺激同样抑制肝内Akt磷酸化(P＜0.05),而PTEN表达水平则无显著改变(P＞0.05).同时检测胰岛素信号的另一个负调节因子p85调节亚基,当经慢性GH刺激后,其表达水平在两种小鼠中均没有变化(P＞0.05).结论 长期使用GH治疗可以抑制肝脏胰岛素信号,其机制涉及PTEN表达的升高,但其病理状态下的机制则不同.
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Mcl-1、PI3K通路活化对胃癌细胞生长及化疗敏感性的影响
目的:探讨Mcl-1以及PI3K通路活化对胃癌细胞生长及化疗敏感性的影响.方法:分别用阿霉素、足叶乙甙和PI3K通路抑制剂(wortmannin)在不同时间段处理胃癌细胞BGC-823后,采用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞对药物的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况并分析细胞周期,Western blot法测定细胞Mcl-1蛋白活性,RT-PCR法测定细胞Mcl-1 mRNA活性.结果;阿霉素、足叶乙甙作用BGC-823 24h后,Mcl-1蛋白活性降低,Mcl-1 mRNA表达下降.加用Wortmannin后,阿霉素、足叶乙甙对BCC-823凋亡诱导和周期阻滞作用持续增强,Mcl-1蛋白及mRNA表达进一步降低,肿瘤细胞对药物保持较高敏感性.结论:阿霉素、足叶乙甙至少部分是通过下调Mcl-1的表达诱导胃癌细胞凋亡.Mcl-1、PI3K通路活化可促进胃癌细胞的生存,降低化疗敏感性.
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黄连素介导的细胞自噬对缺氧损伤H9c2心肌细胞的影响
目的:研究黄连素(Berberine,BBR)对缺氧损伤H9c2心肌细胞的影响,并探索BBR所介导的细胞自噬机制在逆转心肌损伤中的作用.方法:设置不同浓度的BBR药物组,处理H9c2细胞24h,采用CCK-8法检测细胞活力,筛选适宜的BBR药物治疗浓度.分别设置正常H9c2细胞对照组,缺氧H9c2细胞组(HP组),BBR药物处理组,缺氧/BBR处理组(HP/BBR组),BBR处理时间均为24h.收集蛋白或细胞,采用Western blot及流式细胞仪法检测心肌细胞凋亡水平及自噬相关分子的表达水平.同时采用PI3K抑制剂抑制H9c2心肌细胞自噬,检测自噬相关分子表达.结果:一定浓度范围内的BBR对心肌细胞无细胞毒性,且可以显著降低缺氧损伤所致的H9c2心肌细胞凋亡;不仅如此,高浓度BBR可显著诱导H9c2细胞发生自噬,且心肌细胞自噬信号通过PI3K通路介导.结论:黄连素可通过介导细胞自噬发挥抑制H9c2心肌细胞凋亡的作用,且黄连素介导的心肌细胞自噬信号通过PI3K通路所介导.
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DHA通过抑制PI3K通路和GLUT2表达而诱导NSCLC细胞毒性
目的：研究二氢青蒿素（ dihydroartemisinin， DHA）诱导NSCLC细胞毒性的分子机制。方法：将不同浓度的DHA作用NSCLC细胞系A549和NCI－H1650细胞不同时间，运用MTT法、克隆形成实验、Annexin V染色和流式细胞术测定DHA对细胞活力、克隆形成能力和细胞凋亡的影响；同时测定DHA对细胞中葡萄糖水平、ATP和乳酸含量的影响；Western blot 检测PI3K 通路活性和GLUT2表达变化；通过细胞转染实现葡萄糖转运体2（GLUT2）和Rheb在A549和NCI－H1650细胞中高表达，测定和分析DHA作用下细胞活力、细胞凋亡、葡萄糖水平、ATP含量和PI3K通路活性的变化；分析葡萄糖缺乏对DHA诱导NSCLC细胞毒性的影响。结果：与对照组比较， DHA显著抑制A549和NCI－H1650细胞活力和克隆形成能力以及诱导细胞凋亡，同时降低ATP和乳酸含量以及抑制细胞对葡萄糖的摄取，具有时间和剂量依赖效应。 Western blot结果显示，DHA能抑制PI3K通路活性和GLUT2的表达。上调GLUT2的表达和激活PI3K通路能减弱DHA对NSCLC细胞的毒性作用；葡萄糖缺乏能增强DHA对NSCLC细胞的毒性；相反，高浓度葡萄糖则抑制DHA对NSCLC细胞的毒性。结论： DHA能抑制NSCLC细胞活力和克隆形成，诱导细胞凋亡，该作用是通过降低PI3K活性和GLUT2的表达进而抑制细胞糖酵解代谢实现的。
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中国人群结直肠癌中PIK3CA基因突变分析
目的:PIK3CA基因编码ⅠA型磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)的p110催化亚基,致癌性的PIK3CA突变可通过激活PI3K通路参与结直肠癌的发生发展.PIK3CA在西方结直肠癌患者中有较高的突变频率,但其在中国人结直肠癌中的突变情况尚不明确.本研究旨在探讨中国人结直肠癌中PIK3CA基因的突变频率、分布特点及其与结直肠癌的关系.方法:采用PCR产物直接测序法,对79例中国结直肠癌患者肿瘤标本中PIK3CA基因外显子9和外显子20中的突变进行检测分析.结果:在79例肿瘤标本中检出PIK3CA基因突变率为8.9％(7/79),其中外显子9突变率为6.3％(5/79),外显子20突变率为2.5％(2/79),其突变热点分布与既往文献报道基本相符.结论:中国人结直肠癌中存在一个PIK3CA基因突变的亚群,其E542K、E545K和H1047R突变,与以往报道的该基因的致癌性突变相一致,可能是这部分结直肠癌中PI3K信号通路激活的原因.
