首页 > 文献资料
-
抑制LSD1对hiPSCs向定型内胚层分化的调控作用
目的:探讨抑制组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)对人诱导性多能干细胞(hiPSCs)向定型内胚层(DE)分化的调控作用.方法:利用LSD1抑制剂或shRNA抑制LSD1表达,观察hiPSCs形态变化并检测LSD1活性水平,CCK-8方法检测细胞增殖活性,qPCR检测hiPSCs多能性基因及各胚层标志基因的表达,IP-WB方法检测LSD1调控靶基因的复合体模式,ChIP-qPCR方法检测DE标志基因启动子区域组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化和三甲基化(H3K4me2/me3)及第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)水平.结果:(1)抑制LSD1可显著下调hiPSCs多能性基因OCT4、Y染色体性别决定区域盒2(SOX2)及Nanog同源盒(NANOG)的表达水平(P<0.05);显著上调外胚层标志基因β3-微管蛋白(TUBB3),DE标志基因Y染色体性别决定区域盒17(SOX17)和叉头盒A2(FOXA2),以及中胚层标志基因骨形态发生蛋白2(BMP2)的表达水平(P<0.05);(2)当LSD1活性为正常水平的53.4%时利于DE分化;(3)LSD1在hiPSCs核内与组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及阻遏物元件1沉默转录因子辅阻遏物(CoREST)以复合体的形式调控靶基因;(4)抑制LSD1后,SOX17和FOXA2基因启动子区域LSD1与HDAC1结合水平均显著下降,同时H3K4me2/me3和H3K9ac富集水平显著提高(P<0.01).结论:LSD1通过调控DE分化关键基因启动子区域H3K4me和H3K9ac水平来影响hiPSCs向DE的分化能力.
关键词: 人诱导性多能干细胞 赖氨酸特异性去甲基化酶1 定型内胚层 RNA干扰 分化 -
激活 Nodal 信号通路促进小鼠胚胎干细胞向定型内胚层分化
目的:探讨激活Nodal信号通路在小鼠胚胎干细胞( embryonic stem cells,ESC)向定型内胚层( de-finitive endoderm,DE)分化中的作用,寻找小鼠ESC向DE分化的佳培养体系。方法:根据培养基的不同,实验分为3组:胚胎干细胞组(基础培养+LIF)、自然分化组(基础培养基)和activin A组(基础培养基+50μg/L activin A)。细胞培养1~7 d,收集不同作用时点(1、3、5、7 d)的细胞及细胞爬片。用流式细胞术检测CXCR4阳性细胞的比例;免疫细胞化学法检测CXCR4蛋白的表达;Western blot检测OCT4及CXCR4蛋白的表达。结果:流式细胞术检测结果提示,随着培养时间的延长,CXCR4阳性细胞的比例,胚胎干细胞组在1~7 d无明显变化,自然分化组和activin A组逐渐增高,第5天达高峰(P<0.05),其中activin A组高(P<0.05)。细胞免疫组化结果显示CX-CR4阳性细胞呈棕褐色或棕黄色。 Western blot的结果提示,随着培养时间的延长,胚胎干细胞组OCT4和CXCR4蛋白表达无明显变化;自然分化组和activin A组的CXCR4蛋白的表达逐步增高,OCT4蛋白的表达逐步下降,第5天达高峰(P<0.05),其中activin A组的表达明显(P<0.05)。结论:在小鼠ESC分化过程中,在诱导培养的第5天, DE的比例高。激活Nodal信号通路可以促进小鼠ESC向具有CXCR4分子标志的DE分化,有利于获取更多的DE细胞。