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内皮微环境NOTCH信号通路促进人多能干细胞造血分化
目的 体外诱导人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)向造血分化,富集生血内皮细胞,将其与高表达NOTCH信号通路配体DLL4的内皮细胞共培养,体外建立内皮微环境促进多能干细胞造血分化的研究模型,进一步研究明确内皮微环境影响造血干/祖细胞产生的作用及机制.方法 将携带runx1c报告基因的hiPSC通过spinEB方法诱导分化形成拟胚体(embryonic body,EB),在诱导分化第10天通过免疫磁珠分选技术(magnetic-activated cell sorting,MACS)分选富集出CD34 +的生血内皮细胞,将生血内皮细胞与高表达DLL4的内皮微环境细胞VeraVec共培养,进一步诱导其向造血干/祖细胞分化,终建立体外研究NOTCH信号通路促进多能干细胞向造血干/祖细胞分化的研究模型.结果 建立了单细胞培养hiPSC的技术方法,将单细胞培养的携带runx1c报告基因的hiPSC通过spinEB方法诱导其向造血细胞分化,在诱导分化第10天利用MACS技术分离富集了CD34 +的生血内皮细胞.同时获得了转染E4ORF1的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,UVEC)VeraVec细胞,并对其NOTCH信号通路相关基因的表达进行了鉴定.结果表明,其在mRNA水平和蛋白水平均高表达NOTCH信号通路的配体DLL4.将分离富集的生血内皮细胞与高表达DLL4的内皮细胞共培养.结果显示,其能明显促进携带runx1c报告基因的hiPSC诱导分化时红色荧光tdTomato的表达和造血细胞的形成,以此作为模型可进一步研究内皮微环境促进多能干细胞向造血干/祖细胞分化的模型.结论 成功建立了spinEB方法诱导多能干细胞分化的技术方法,能高效在体外富集生血内皮细胞,并将生血内皮细胞与高表达NOTCH信号通路配体DLL4的内皮细胞共培养,在体外构建了内皮微环境促进内皮生血转化的研究模型,供进一步研究内皮微环境促进造血干/祖细胞分化的作用及其机制,为体外利用多能干细胞制备造血干/祖细胞奠定基础,有望终在体外获得有完整功能的造血干细胞,用于临床造血干细胞移植治疗及战场辐射损伤救治,有一定的社会和军事应用价值.
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不同冻存液对人诱导性多能干细胞冻存与复苏效果的影响
目的:探讨不同冻存液对人诱导性多能干细胞(iPSC)冻存复苏后的存活率及诱导分化的影响,筛选出简单有效的冻存与复苏方法.方法:人iPSC培养至第3代后分组冻存:①含有不同配比胎牛血清(FBS)的细胞冻存液分组:A组[80％培养基(DMEM/F 12)+10％FBS+10％二甲亚砜(DMSO)];B组(70％DMEM/F12+20％ FBS+10％ DMSO);C组(40％DMEM/F 12+50％FBS+ 10％DMSO);D组(90％FBS+10％DMSO).②含有不同配比DMSO的细胞冻存液分组:E组(45％DMEM/F12+50％FBS+5％DMSO);F组(40％DMEM/F 12+50％FBS+10％DMSO);G组(35％DMEM/F12+50％FBS+1 5％DMSO);H组(30％DMEM/F 12+50％FBS+20％ DMSO).以相同方法冻存并复苏人iPSC,观察比较不同组细胞在复苏14d后重新形成典型干细胞集落的数量,并在相同诱导分化体系下,记录复苏人iPSC向神经元和胶质细胞分化的效率.结果:C和F组细胞复苏后形成典型干细胞集落的数量多于其他组(P＜0.05),A和B组细胞复苏后分化为神经元的效率略高于其他实验组.结论:以40％DMEM/F12+50％FBS+10％DMSO配比组合成的细胞冻存液作为人iPSC的冻存保护剂,可使人iPSC的冻存复苏效率优并保持较好的生物学特性.
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人诱导性多能干细胞的培养及鉴定
目的 建立稳定的人诱导性多能干细胞(iPS细胞)培养体系.方法 取第3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,丝裂霉素C处理后用作饲养层.人iPS细胞接种于饲养层上生长,胶原酶消化或机械法传代.倒置显微镜下观察iPS细胞生长状态;观察拟胚体形成能力;RT-PCR检测iPS细胞多能性基因的表达情况.结果 (1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEn为贴壁生长细胞,呈梭形或多角形.细胞增殖旺盛.(2)生长在饲养层上的人iPS细胞呈典型的克隆状生长.克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰.克隆内细胞排列紧密,细胞体积小,核大,细胞核,质比高.RT-PCR结果 显示人iPS细胞强表达多能性基因Oct4,Nanog,Sox2;去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体(EB).结论 本实验的培养体系适合人iPS细胞的培养,人iPS细胞能稳定增殖,保持自我更新及分化潜能.
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抑制LSD1对hiPSCs向定型内胚层分化的调控作用
目的:探讨抑制组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)对人诱导性多能干细胞(hiPSCs)向定型内胚层(DE)分化的调控作用.方法:利用LSD1抑制剂或shRNA抑制LSD1表达,观察hiPSCs形态变化并检测LSD1活性水平,CCK-8方法检测细胞增殖活性,qPCR检测hiPSCs多能性基因及各胚层标志基因的表达,IP-WB方法检测LSD1调控靶基因的复合体模式,ChIP-qPCR方法检测DE标志基因启动子区域组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化和三甲基化(H3K4me2/me3)及第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)水平.结果:(1)抑制LSD1可显著下调hiPSCs多能性基因OCT4、Y染色体性别决定区域盒2(SOX2)及Nanog同源盒(NANOG)的表达水平(P<0.05);显著上调外胚层标志基因β3-微管蛋白(TUBB3),DE标志基因Y染色体性别决定区域盒17(SOX17)和叉头盒A2(FOXA2),以及中胚层标志基因骨形态发生蛋白2(BMP2)的表达水平(P<0.05);(2)当LSD1活性为正常水平的53.4％时利于DE分化;(3)LSD1在hiPSCs核内与组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及阻遏物元件1沉默转录因子辅阻遏物(CoREST)以复合体的形式调控靶基因;(4)抑制LSD1后,SOX17和FOXA2基因启动子区域LSD1与HDAC1结合水平均显著下降,同时H3K4me2/me3和H3K9ac富集水平显著提高(P<0.01).结论:LSD1通过调控DE分化关键基因启动子区域H3K4me和H3K9ac水平来影响hiPSCs向DE的分化能力.
关键词： 人诱导性多能干细胞 赖氨酸特异性去甲基化酶1 定型内胚层 RNA干扰 分化 -
人牙源性iPSCs3种培养底物的比较
目的 对比研究3种人牙源性诱导性多能干细胞(iPSCs)培养底物的特点.方法 使用3种底物培养人牙源性iPSCs:小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、基质胶和重组人玻连蛋白(VTN-N),对比iPSCs的生长情况.结果 3种底物的制备时间分别为14、3、1h,三者间差异有统计学意义(P＜0.05);iPSCs重编程时间分别为(30±1.6)、(26士2.1)、(27±1.4)d,其中MEF组明显多于其他两组(P＜0.05);重编程效率分别为0.3％±0.03％、0.56％±0.08％、0.7％±0.02％ (P＜0.05).3种底物均能较好支持iPSCs生长,使其保持未分化状态.结论 重组人玻连蛋白无异源性动物组分,制备简便、标准可控、重编程时间较短,是目前理想的支持iPSCs生长的底物.
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人诱导多能干细胞体外诱导产生红细胞的研究进展
诱导多能干细胞(iPSCs)不仅具有无限增殖的能力,还可以根据不同的需要筛选出特定的表型,iPSCs可定向诱导生成RBC,作为RBC输血的一个新来源.要将此技术应用到临床输血上,还需对一些关键程序进行优化,如用于生成iPSCs的细胞类型的选择、改进用于保障临床应用安全的重编程方法、红细胞分化过程的优化等.
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人诱导性干细胞产业前研究
人诱导性干细胞在进入产业化之前,主要的产业前研究方向包括以下三点.①大规模样本收集,研究特异致病突变造成的疾病表型差异,构建基因改造的人诱导性干细胞,利用分化细胞进行疾病模型研究.②高效率,功能性诱导分化获得终末分化细胞,用于细胞替代性治疗,例如:血细胞分化,胰岛细胞分化.③和基因工程,组织工程和发酵工程相结合,实现人诱导性干细胞或分化细胞的大规模制备.本文将着重分析进入真正的产业化应用之前,人诱导性干细胞研究所面临的机遇和挑战.
