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肠杆菌科细菌碳青霉烯类抗生素耐药检测方法的研究进展
碳青霉烯类抗生素是20世纪70年代后期在沙纳霉素基础上研发出来的一类抗菌谱广,抗菌活性强的非典型β-内酰胺类抗生素[1-2],对质粒介导的超广谱β-内酰胺酶( ESBLs )、染色体及质粒介导的头孢菌素酶( AmpC酶)均具有高度稳定性,已经成为治疗严重细菌感染主要的抗菌药物之一。碳青霉烯类抗生素通过抑制胞壁黏肽合成酶,即青霉素结合蛋白( PBPs ),从而阻碍细胞壁黏肽合成,使细菌胞壁缺损,菌体膨胀致使细菌胞质渗透压改变和细胞溶解而杀灭细菌[3],其对革兰阳性菌、革兰阴性菌和厌氧菌均有较强的抗菌活性[4]。随着该类抗生素的的广泛使用,临床上不断出现碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌,给临床抗感染治疗和医院内感染控制带来了极大困难。
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基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪检测KPC型碳青霉烯酶的研究
目的 用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)比较产KPC型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌在不同药物浓度下水解厄他培南的能力.方法 收集浙江大学医学院附属第二医院临床分离的19株单产KPC肠杆菌科细菌,包括10株奇异变形杆菌,3株产气肠杆菌,2株黏质沙雷菌,2株弗劳地柠檬酸杆菌,1株肺炎克雷伯菌,1株阴沟肠杆菌;杭州市中医院分离的7株产KPC摩根摩根菌,以及上述7株摩根摩根菌和部分奇异变形杆菌(4株)的大肠埃希菌转移接合子.用MALDI-TOF MS检测产KPC肠杆菌科细菌水解厄他培南的能力.结果 当厄他培南浓度为0.1 g/L时,37株单产KPC型碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌在1.5h内全部水解厄他培南,质谱图显示厄他培南所呈现的3个峰全部消失,灵敏度高达100%;当厄他培南浓度为0.3 g/L时,1.5h组水解厄他培南的灵敏度为70.3% (26/37),2.5h组为89.2% (33/37),3.5h组为94.6% (35/37);当厄他培南浓度为0.5 g/L时,1.5h组水解厄他培南的灵敏度为48.6% (18/37),2.5h组为83.8% (31/37),3.5h组为94.6%( 35/37).两独立样本非参数检验统计显示:厄他培南0.1 g/L组与0.3 g/L、0.5 g/L组之间的水解时间差异有统计学意义,而0.3 g/L与0.5 g/L组之间的水解时间差异无统计学意义;细菌组内数据统计显示,除奇异变形杆菌组与大肠埃希菌组之间差异有统计学意义外,其他各细菌组之间差异没有统计学意义.结论 MALDI-TOF MS操作简便,可快速检测产KPC型碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌,敏感率高,假阳性率低,适合微生物检验中用于产KPC型碳青霉烯酶的检测,推荐使用0.1 g/L的厄他培南作为水解底物来检测产KPC型肠杆菌科细菌.
关键词: 厄他培南 MALDI-TOF MS 肠杆菌科细菌 KPC -
等温核酸扩增技术检测KPC耐药方法的建立及初步评价
碳青霉烯类抗生素是治疗重症感染有效的抗生素之一。近10年来,对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌在世界各地的不断暴发威胁着人类的生命健康。产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制,其中报道较多的是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶( Klebsiella pneumoniae carbapenema-ses,KPC)。而且携带KPC的细菌感染与高死亡率呈正相关。因此及时、准确、快速地检出产KPC酶细菌对预防、控制耐药菌株流行具有重要意义。碳青霉烯酶表型检测方法均较费时;PCR扩增是常见的分子生物学检测方法,检测时间大大缩短,但对模板DNA质量、仪器设备和场所要求较高。等温核酸扩增技术( nucleic acid sequence-based amplifica-tion,NASBA)具有快速、灵敏、特异的优点。本研究以RNA为靶序列,建立了 NASBA 快速检测细菌KPC耐药的方法。
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改良Hodge试验检测肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的研究
目的 用改良Hodge试验(MHT)检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的产生,了解碳青霉烯酶基因分布.方法 从浙江大学医学院附属第二医院、浙江省东阳市人民医院、北京医院和四川大学附属华西医院4家医院收集3 718株肠杆菌科细菌,用纸片法检测细菌对厄他培南的敏感性,用MHT检测碳青霉烯酶的产生情况,并用PCR扩增常见的碳青霉烯酶基因.结果 4家医院的肠杆菌科细菌对厄他培南的不敏感率为3.04% (113/3718),上述4家医院的不敏感率依次为5.09%、2.15%、2.59%和1.72%.MHT的总阳性率为2.29% (85/3718),4家医院的阳性率依次为4.73%、1.21%、1.06%和1.58%.113株厄他培南不敏感菌株中,MHT阳性82株,阴性31株.85株MHT阳性菌株中,82株对厄他培南耐药或中介耐药,仅有3株敏感.82株MHT阳性、厄他培南不敏感的菌株中,肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因阳性65株,亚胺培南水解酶(IMP)基因阳性15株,其中2株KPC和IMP同时阳性,其他4株未扩增到常见碳青霉烯酶基因.31株MHT阴性、厄他培南不敏感的菌株和3株MHT阳性、厄他培南敏感的菌株均未扩增到常见碳青霉烯酶基因.结论 MHT可有效地检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶,具有敏感性高、假阳性率低的特点.肠杆菌科细菌所产碳青霉烯酶主要为KPC,其次为IMP.
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1例静脉点滴头孢哌酮钠致血清病型反应的临床分析
头孢哌酮钠(氧哌羟苯唑头孢菌素,先锋必素,先锋必,简称T-1551)是常用的广谱抗生素,其对肠杆菌科细菌,流感杆菌、淋球菌,绿脓杆菌有较强的抗菌活性,临床报道不良反应和发生率4%[1],我科收治1例老年女性患者在静滴头孢哌酮钠第9天出现血清病型反应,现报告如下.
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碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌耐药机制研究
目的 探讨碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)的耐药机制,建立获得性碳青霉烯酶流行监测体系.方法 收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2007年1月至2010年6月临床分离非重复肠杆菌科细菌5604株,其中美罗培南抑菌环直径≤21 mm的肠杆菌科细菌100株.药物敏感性试验筛选出碳青霉烯类耐药菌株,采用聚合酶链反应(PCR)对碳青霉烯酶基因和基因附属结构进行分析;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和Southern印迹杂交方法分析耐药菌质粒;采用多位点序列分型(MLST)方法对菌株进行分型及分析同源性;采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对菌株的外膜孔道蛋白进行分析.结果 共检出CRE 11株,其中克雷伯菌属细菌7株.抗菌药物敏感性试验显示所有菌株对大多数抗菌药物耐药,低抑菌浓度美罗培南8~ 64 mg/L,亚胺培南4 ~ 64 mg/L,厄他培南4~64 mg/L,对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性则变化较大.PCR检出 IMP-4阳性菌株6株,KPC-2阳性菌株3株,其中1株ST476型肺炎克雷伯菌同时携带blaIMP-4和blaKPC-2.对基因附属结构进行分析,结果显示blaKpC-2基因位于由Tn3转座子和Tn4401部分片段构成转座子上.PFGE显示大多数CRE含有3个或3个以上质粒.MLST分型发现2株肺炎克雷伯菌同属于ST476型.SDS-PAGE提示1株产酸克雷伯菌(Kox656)存在外膜孔道蛋白(OmpK35和OmpK36)双缺失.结论 本院CRE主要是肺炎克雷伯菌,产生碳青霉烯酶是细菌耐药的主要原因,IMP-4是其主要酶型.碳青霉烯酶基因的出现和传播对治疗和感染控制造成巨大威胁,应重视医院细菌耐药性特点及耐药菌感染的临床流行病学资料,从而为临床合理用药提供参考.
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亚胺培南耐药大肠埃希菌的耐药机制研究
对肠杆菌科细菌具有强活性的β内酰胺类药物是碳青霉烯类药物,在治疗产AmpC酶和(或)超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的肠杆菌引起的感染时,碳青霉烯类药物一直是首选药物.
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肠杆菌科细菌SHV型超广谱β内酰胺酶的检测
SHV型超广谱β内酰胺酶(ESBLs)自1983年首次报道至今,已经有近百种衍生酶,它们可引起产酶菌株对广谱头孢菌素及单环β内酰胺类抗生素耐药,并且具有快速转导耐药基团的能力,给临床的抗感染治疗带来了极大困难.SHV型ESBLs鼻分布广泛,美国、法国、瑞士、希腊、日本等许多国家均有大量报道.近几年来我国浙江[1]、北京[2]、上海[3]、广东[4]等地有关此酶的报道也明显增多,但在湖南地区尚未见SHV型ESBLs检测的报道.
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大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β内酰胺酶基因分型研究
产超广谱β内酰胺酶 (ESBLs)是临床肠杆菌科细菌对β内酰胺类抗生素耐药的重要机制.近年来国内外ESBLs在临床分离菌中的检出率快速上升,其种类也不断增多.国内报道以CTX-M和SHV型ESBLs为常见[1,2].为了较全面了解本院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株ESBLs的基因分型,经本研究应用聚合酶链反应(PCR)及DNA测序方法,对215株产ESBLs临床分离株的TEM、SHV和CTX-M基因进行分析.
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超广谱β-内酰胺酶细菌致医院感染
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)由质粒介导,产ESBLs菌可以通过接合、转化和转导等形式使耐药基因在细菌间扩散,从而造成严重的医院交叉感染.为了解我院产ESBLs菌的发生率、分布情况及耐药特点,以控制产ESBLs菌的传播和流行,我们对1999年7月~2000年6月临床各科室分离的肠杆菌科细菌产ESBLs 情况及耐药性进行分析,现报告如下.一、材料与方法
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绿脓假单胞菌抗氯己定-磺胺耐药基因的初步研究
近年来绿脓假单胞菌(Pa)已成为医院感染的重要病原菌,对常用抗菌药物的耐药性在逐年上升,且多重耐药严重.据文献报道在肠杆菌科细菌的耐药机制中,Ⅰ类整合子起着非常重要的作用,它的3'保守端有消毒剂氯己定(chlorhexidine)的耐药基因(qacE△1)和磺胺耐药基因(sulⅠ) .为防细菌定植和细菌生物膜形成,目前临床所使用的Ⅱ代导管均覆有氯己定-磺胺.为了解医院感染Pa中是否存在氯己定和-磺胺类耐药基因,我们对临床分离的39株Pa进行了qacE△1与 sulⅠ基因检测.
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大肠埃希菌和克雷伯菌属产超广谱β-内酰胺酶的检测
为了解肠杆菌科细菌超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的产生情况,指导临床医生合理地使用抗生素,防止医院感染及EBSL的暴发流行,我们检测了1997年6月~1997年11月分离到的60株肠杆菌科细菌EBSL的产生情况,现报告如下.
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AmpC β内酰胺酶的检测
AmpC β内酰胺酶(简称AmpC酶)是由肠杆菌科细菌或/和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler分子结构分类法中的C类和Bush-Jacoby-Medeiros功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶.故AmpC酶又称作为头孢菌素酶[1,2].
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质粒介导的喹诺酮类耐药基因qepA的流行现状及耐药机制研究
肠杆菌科细菌对喹诺酮类药物的耐药机制多集中在染色体介导的靶位耐药和膜耐药,而质粒介导的喹诺酮类耐药报道较罕见.目前,已报道的有3种,分别由qnr基因、氨基糖苷乙酰基转移酶基因aac(6′)-Ib-cr和qepA基因介导.对于qnr基因介导的喹诺酮类耐药机制我们已做了相关的前期研究工作[1].质粒介导的qepA基因已被认为是新的影响喹诺酮类耐药的分子机制[2],可通过外排泵机制介导细菌对亲水性喹诺酮类药物的耐药.为了解武汉大学人民医院耐喹诺酮类病原菌中质粒介导的耐药基因qepA流行现状及耐药特征,有效开展qepA基因介导的喹诺酮耐药水平监测,加强消毒隔离措施和耐药菌株的检测,以减少该类菌株的出现和流行,我们对质粒介导的喹诺酮类耐药基因qepA的流行现状及耐药机制进行了研究.
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对超广谱β-内酰胺酶检测方法学评价的几点建议
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是由质粒介导,主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生,产生菌的耐药谱扩展至三代头孢和氨曲南[1].克拉维酸等酶抑制剂对其有效.大部分ESBLs属于Ambler A类,位于Bush等[2]功能分类方案2be群,少数属于Ambler D类,位于Bush 2d群.A类ESBLs分为两群:TEM和SHV衍生和非TEM和SHV衍生ESBLs.常见的ESBLs由TEM-1、2和SHV-1突变而来,利用基因突变研究氨基酸一级结构和功能的关系是目前ESBLs基础研究的热点[3].
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质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶弗劳地柠檬酸盐杆菌的研究
碳青霉烯类抗生素对革兰阴性杆菌具有强大的抗菌活性,是治疗由多重耐药革兰阴性杆菌导致的医院感染的有效药物,尤其适用于产超广谱β内酰胺酶(ESBL4)和AmpC酶的肠杆菌科细菌引起的严重感染.随着碳青霉烯类抗生素在临床上使用增加,革兰阴性杆菌临床株对该类药物的耐药性不断增加,特别是非发酵菌的耐药率升高明显,但在肠杆菌科细菌中少见.
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引进CLSI微生物检验标准促进实验室标准化进程
当前,抗菌药物耐药愈演愈烈,已成为全球面临的难题.多重耐药、泛耐药、甚至极度耐药株的出现和传播,给临床治疗和控制带来极大的困难.苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药的屎肠球菌(VRE)、产ESBL的肠杆菌科细菌、碳青霉烯类耐药的不动杆菌(CRAB)和铜绿假单胞菌(CRPA)均已成为国际普遍关注的热点问题[1].
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粪菌移植有效治疗炎症性肠道疾病
奥地利维也纳医科大学内科胃肠病学和肝脏病学的Angelberger S等人在5名患有溃疡性结肠炎的患者应用粪菌移植方法进行治疗,并在移植术后不同时间点比较粪便中细菌的组成,结果证实:具有抗炎并产生短链脂肪酸作用的普拉梭菌、卵形拟杆菌等在患者体内成功定植,这是治疗炎症性肠道疾病成功的标志。疾病的严重程度(以Mayo评分为衡量指标)与肠杆菌科细菌所占比例过高和毛螺旋菌科细菌所占比例偏低有直接关系。
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大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶基因型及耐药性研究
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是革兰阴性细菌对新型广谱β-内酰胺类抗生素耐药重要的机制[1],主要由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌产生.随着第三代头孢菌素在临床上的大量应用,产ESBLs的细菌种类不断增加,ESBLs基因表型也不断增加,成为细菌耐药机制研究的热点.
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碳青霉烯酶:未来困扰我们的难题
在所有β内酰胺类抗生素中,碳青霉烯类具有广泛的抗菌活性,它对革兰阴性菌产生的超广谱β内酰胺酶(ESBL)、AmpC酶都很稳定;但随着碳青霉烯类的广泛使用,细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性.铜绿假单胞菌由于外膜蛋白的D2孔的缺失而对亚胺培南耐药.非特异的多药外排泵的表达增强可以引起铜绿假单胞菌对美罗培南、头孢菌素、喹诺酮类、四环素等耐药.肠杆菌科细菌高产AmpC酶,同时外膜通透性降低,会造成碳青霉烯类耐药.麻烦的是,近来产生获得性碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠杆菌科细菌的报道有所增加[1,2].由这些产酶株感染造成的暴发流行,使治疗陷入无药可用的境地,病死率很高.