Objective To construct a rapid and high-throughput assay for identifying recombinant bacteria based on mass spectrometry.
Methods Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) techniques were used to identify 12 recombinant proteins (10 of Yersinia pestis, 1 of Campylobacter jejuni and 1 of Helicobacter pylori). A classification model for the various phase of recombinant bacteria was established, optimized and validated, using MALDI-TOF MS-CIinProTools system. The differences in the peptide mass spectra were analyzed by using Biotyper and FIexAnalysis softwares.
Results Models of GA, SNN, and QC were established. After optimizing the parameters, the GA recognition model showed good classification capabilities: RC=100%, mean CVA=98.7% (the CVA was 96.4% in phase 1, 100% in phase 2, 98.4% in phase 3, and 100% in phase 4, respectively) and PPV=95}. This model can be used to classify the bacteria and their recombinant, which only requires 3.7x103 cells for analysis. The total time needed is only 10 min from protein extraction to reporting the result for one sample. Furthermore, this assay can automatically detect and test 96 samples concurrently. A total of 48 specific peaks (9, 16, 9, and 14 for the four stages, respectively) was found in the various phase of recombinant bacteria.
Conclusion MALDI-TOF MS can be used as a fast, accurate, and high-throughput method to identify recombinant bacteria, which provide a new ideas not only for recombinant bacteria but also for the identification of mutant strains and bioterrorism pathogens.

应用MALDI-TOF质谱技术检测多发性骨髓瘤Jak2基因单核苷酸多态性

本研究探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)检测多发性骨髓瘤(MM)jak2基因的单核苷酸多态性(SNP)的实用性.用PCR扩增出含jak2基因2个SNP(CA28T和C643T)位点的DNA片段作为模板,产物纯化后利用MALDI-TOE MS检测5例MM和5例健康对照者样本的jak2基因多态性.结果表明:C428T和C643T位点基因型在多发性骨髓瘤病例与健康对照组的分布无差异,均为T/T纯合子.结论:本实验建立的基于MALDI-TOF MS与引物延伸技术检测jak2基因多态性的方法是一个快速、准确和可靠的检测方法.

基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪快速鉴别甲氧西林耐药和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的研究

目的：分析基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪（ matrix-assisted laser desorption／ionization time-of-flight mass spectrometry ， MALDI-TOF MS）快速鉴别甲氧西林耐药和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。方法收集浙江大学医学院附属第二医院已保存的临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）25株和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）30株用于模型的建立。同时选取34株临床分离株（12株MRSA和22株MSSA）用做模型验证菌株。 MALDI-TOF MS对所有菌株进行鉴定，ClinProTools 3．0软件对MALDI-TOF MS鉴定细菌所产生的质谱峰图进行分析。结果 ClinPro-Tools软件的4种算法所得出的结果基本一致，灵敏度均大于95．0％，其中遗传算法（GA）的灵敏度高（100．0％）；除监督式神经网络算法（ SNN）外，其余3种算法的特异性均大于90．0％。质荷比为3279、6485、6555和3299 m／z的质谱峰是用于区分MRSA和MSSA的为主要的特征性峰。受试者工作特征曲线（ ROC）显示，这4个特征性峰的曲线下面积（ AUC）均大于0．9；凝胶浏览图显示，MSSA组的3279、6485、6555 m／z峰的蛋白强度高于MRSA组，而3299 m／z峰的蛋白强度低于MRSA组。外部验证显示，GA模型对MRSA组的准确鉴定率为83．3％，对MSSA组的准确鉴定率为90．9％。结论在严格控制实验条件的情况下，MALDI-TOF MS可快速准确地鉴别MRSA和MSSA，具有耗时短，灵敏性高，特异性高的优点。准确鉴定的同时区分MRSA和MSSA，尽早为临床防治MRSA提供参考依据，限制其传播及暴发流行。

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪检测KPC型碳青霉烯酶的研究

目的 用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)比较产KPC型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌在不同药物浓度下水解厄他培南的能力.方法 收集浙江大学医学院附属第二医院临床分离的19株单产KPC肠杆菌科细菌,包括10株奇异变形杆菌,3株产气肠杆菌,2株黏质沙雷菌,2株弗劳地柠檬酸杆菌,1株肺炎克雷伯菌,1株阴沟肠杆菌；杭州市中医院分离的7株产KPC摩根摩根菌,以及上述7株摩根摩根菌和部分奇异变形杆菌(4株)的大肠埃希菌转移接合子.用MALDI-TOF MS检测产KPC肠杆菌科细菌水解厄他培南的能力.结果 当厄他培南浓度为0.1 g/L时,37株单产KPC型碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌在1.5h内全部水解厄他培南,质谱图显示厄他培南所呈现的3个峰全部消失,灵敏度高达100％；当厄他培南浓度为0.3 g/L时,1.5h组水解厄他培南的灵敏度为70.3％ (26/37),2.5h组为89.2％ (33/37),3.5h组为94.6％ (35/37)；当厄他培南浓度为0.5 g/L时,1.5h组水解厄他培南的灵敏度为48.6％ (18/37),2.5h组为83.8％ (31/37),3.5h组为94.6％( 35/37).两独立样本非参数检验统计显示:厄他培南0.1 g/L组与0.3 g/L、0.5 g/L组之间的水解时间差异有统计学意义,而0.3 g/L与0.5 g/L组之间的水解时间差异无统计学意义；细菌组内数据统计显示,除奇异变形杆菌组与大肠埃希菌组之间差异有统计学意义外,其他各细菌组之间差异没有统计学意义.结论 MALDI-TOF MS操作简便,可快速检测产KPC型碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌,敏感率高,假阳性率低,适合微生物检验中用于产KPC型碳青霉烯酶的检测,推荐使用0.1 g/L的厄他培南作为水解底物来检测产KPC型肠杆菌科细菌.

采用MALDI-TOF MS和全基因组测序鉴定和分析动弯杆菌属及其亲缘关系

目的 用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术结合16S rRNA基因测序鉴定动弯杆菌,并通过全基因组测序分析动弯杆菌的耐药基因及该菌属种间亲缘关系.方法 将65例细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)患者的阴道分泌物标本厌氧培养获得25株动弯杆菌,采用MALDI-TOF MS及16S rRNA基因测序鉴定细菌种属,并提取细菌全基因组DNA进行二代测序,测序后得到的原始数据根据SPAdes软件进行拼接组装,并与ARGD耐药基因库比对得到这些细菌含有的获得性耐药基因,后通过Harvest软件对所有菌株进行核心基因组多样性比较,构建进化树.结果 采用MALDI-TOF MS鉴定动弯杆菌属仅能获得柯氏动弯杆菌的鉴定结果;采用16S rRNA基因测序能将动弯杆菌属菌株区分为柯氏动弯杆菌和羞怯动弯杆菌;全基因组分析显示动弯杆菌主要含有四环素耐药基因tet(o)及大环内酯类耐药基因erm(x),其中tet(o)基因的检出率为84.7%, erm(x)基因的检出率为61. 5%;动弯杆菌属两个种内亲缘关系相近,种间亲缘关系甚远.结论 本实验结果表明目前MALDI-TOF MS不能鉴定出动弯杆菌属中的羞怯动弯杆菌;动弯杆菌对四环素类及大环内酯类抗生素具有潜在的耐药性;动弯杆菌在种内进化缓慢,暂无新种出现的趋势.

乙型肝炎抗病毒治疗中的耐药基因突变检测技术

中国是乙型肝炎（乙肝）的高发国家，抗病毒治疗药物耐药突变的早期发现对于接受抗病毒治疗的乙肝患者至关重要。理想的临床检测方法应具有灵敏度高、特异性高、重复性好、检测结果准确、操作简单、通量高、价格适中以及能定量检测等特点，并可检出样本中的多种混合突变。本文根据上述临床需求，就近年来出现的一些乙肝耐药突变检测技术进行讨论，并介绍一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法的新检测技术。

MALDI-TOF MS技术在多重耐药大肠埃希菌同源性分析及自建库中的应用研究

目的 评价基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对多重耐药大肠埃希菌同源性分析的能力,并建立多重耐药大肠埃希菌同源性质谱分型及药敏参考数据库.方法 对2016年3月-2017年3月医院632株多重耐药大肠埃希菌(ESBLs) Eco进行MALDI-TOF MS鉴定,利用MALDI-Biotyper软件进行同源性分析及自建库;使用VITEK 2.0全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行药敏实验,用WHONETS.6软件进行药敏结果分析.结果 2016年3月-2017年3月医院临床送检的标本中共检出(ESBLs) Eco 632株,检出率35.91％,检出标本主要有痰、尿液和血液,各科室检出(ESBLs) Eco的检出率分别为泌尿外科10.27％、肾内科8.69％、老年病科7.11％、急诊外科5.21％、血液风湿科4.90％;632株(ESBLs) Eco经MALDI-TOF MS同源性聚类分析,分为质谱数据差异性较大的两大簇六个分型,其中Ⅰa型27.00％、Ⅰ b1型11.00％、Ⅰ b2型9.00％、Ⅱa1型4.50％、Ⅱa2型33.5％、Ⅱb型15.00％;whonet5.6软件药敏分析显示六个分型的药敏结果也存在一定的差别;普外Ⅰ、普外Ⅱ、血液风湿科、急诊外科五个科室(ESBLs) Eco同源性相对较高(≥50％),提示以上科室可能存在院内交叉感染;初步建立了(ESBLs) Eco同源性质谱分型及药敏参考数据库并进行验证,质谱鉴定合格率83.3％;药敏比对合格率76.0％.结论 MALDI-TOF MS同源性聚类分析快速、准确,建立了(ESBLs) Eco同源性质谱分型及药敏参考数据库,大大缩短了实验室多重耐药菌的鉴定及同源性分析时间,并且在菌株鉴定的同时为临床提供药敏结果参考,指导临床第一时间经验用药,为临床多重耐药菌感染的快速诊断及治疗赢得宝贵时间.

利用MALDI-TOF MS进行卵巢癌血清诊断模型的建立

目的 利用基质辅助激光解析飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)进行卵巢癌血清诊断模型的建立及潜在肿瘤标志物的筛选.方法 卵巢癌患者血清20例;健康对照人群血清20例.利用弱阳离子交换磁珠(MB-WCX)进行样品前处理工作,质谱分析应用线性模式,采集血清多肽指纹图谱,建立相关的诊断模型并筛选卵巢癌特异性蛋白质峰.结果 建立了用于进行卵巢癌血清诊断的模型,利用GA、SNN和QC方法 分析,认为其灵敏度和特异性都可以达到90%以上,并找到一些差异表达的蛋白质,可以用于进行疾病与正常的区分.结论 MALDI-TOF MS技术是一种能够快速、简便且无创的分析方法 ,不仅能够用以建立血清诊断模型,还可以用以进行筛选卵巢癌患者血清中相对特异的潜在肿瘤标志物,具有较好的临床应用前景.

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定临床非发酵革兰阴性杆菌

目的 比较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass speetrometry,MALDI-TOF MS)和Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定系统对临床分离非发酵革兰阴性杆菌鉴定的一致性.方法 收集徐州医科大学附属医院2015年11月至2016年3月临床分离非发酵革兰阴性杆菌537株;分别采用MALDI-TOF MS和Vitek 2Compact全自动细菌鉴定系统进行鉴定,并比较分析两种鉴定方法结果的一致性.结果 在537株非发酵革兰阴性杆菌中,MALDI-TOF MS可将527株(98.1％)鉴定至种,10株仅鉴定至属;Vitek 2 Compact可将537株(100％)全部鉴定至种.MALDI-TOF MS与Vitek 2 Compact鉴定结果相比较,在种的水平上520株(96.8％)一致,在属的水平上533株(99.3％)一致,两种方法鉴定结果完全不一致4株(0.7％).结论 MALDI-TOF MS对临床分离非发酵革兰阴性杆菌具有较好的鉴定能力,其快速准确及价廉的特性具备临床推广价值.

临床菌株耐药性分子检测技术的应用进展

临床菌株分子检测技术发展迅速.实时荧光定量PCR的应用已较为成熟;基因芯片、多重基因遗传信息表达分析系统对部分菌株耐药基因检测的方法已经建立;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在菌株蛋白质分子及单核苷酸突变检测方面有独特优势;新一代DNA测序技术在简化实验流程的同时大幅削减成本,其应用可能为临床菌株鉴定及其耐药性检测带来新的革命.该文对上述几种分子检测技术在临床菌株耐药检测方面进行介绍,为临床应用与研究提供参考.

华莱士诺卡菌引起的肺部感染1例

诺卡菌(Nocardia)是革兰染色阳性需氧分枝杆菌,隶属于诺卡菌科,目前已发现和命名的有87个种,与人类疾病相关的约有25个种,且以星形诺卡菌(N.asteroides)和巴西诺卡菌(N.brasiliensis)常见[1].本文报道1例由华莱士诺卡菌(Nocardia wallacei)引起的肺部感染.1 病历资料患者,男,59岁,无明显诱因下出现高热,伴咳嗽、咳痰,于社区医院就诊,查胸片示左上肺节段性肺炎,予抗生素(患者未能提供相关具体用药史)抗感染治疗1周后,体温正常,咳嗽、咳痰症状改善.出院1周后患者再次出现咳嗽加剧伴晨起发热,体温波动于38 ～38.6℃,于2014年12月9日到当地二级医院就诊,实验室检查:白细胞29.63×109/L,中性粒细胞89％;胸部CT检查:左肺上叶舌段可见片状高密度影,边缘欠清晰,内伴低密度影及气体样影,纵隔淋巴结肿大,考虑左肺上叶感染伴空洞形成,左侧少许胸腔积液.

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱用于产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究

目的：探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（ MALDI?TOF MS）用于产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型。方法收集2012年10月－2014年10月5所医院的80株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌菌株。经多位点序列分析（ MLST），28株为ST11型，52株为其他分型（ other sequence type， OST）。通过MSP dendrogram聚类分析、MALDI Biotyper建立数据库、ClinPro Tools建立模型3种方法研究ST11分型的可能性。结果 MSP dendrogram聚类分析在距离水平线1000处可将80株菌聚类分析为两类，敏感性为65．78％，特异性为92．85％。 MALDI Biotyper数据库验证结果：18株ST11有1株菌分为OST，32株OST有2株菌被分为ST11，敏感性为89．47％，特异性为96．77％。 ClinPro Tools用其余菌株验证模型全部正确，敏感性和特异性均为100％。结论 MALDI?TOF MS可通过3种方法区别ST11与OST，以ClinPro Tools软件建立模型的方法可靠。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物鉴定中的应用

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption /ionization time-of-flight mass spectrom-etry ，MALDI-TOF MS）技术是近年发展起来的一种软电离新型有机质谱，它可以在几分钟内直接对平皿中或标本中的菌落进行鉴定。这种新而简单的方法大大降低了耗材成本和鉴定诊断时间。可靠性和准确性已在许多研究报告中得以证明，不同的系统设备也已在市场销售，在不久的将来，该项技术会在实际应用中拥有更加广阔的前景。MALDI-TOF MS将会成为替代传统人类病原体微生物鉴定手段的革新技术。本文将回顾MALDI-TOF MS的原理、发展、应用情况、与传统方法相比的优势及现阶段存在的局限性，着重强调该项技术在微生物系统的应用特点。

HPLC MALDI-TOF质谱法检测IFN-α2b二硫键结构

目的 采用TPCK胰酶酶切、高效液相色谱(HPLC)法与MALDI-TOF MS质谱法联用解析重组人干扰素α2b(recombinant human interferon α2b,rhIFN-α2b)的二硫键连接位置;建立活性多肽/蛋白质二硫键连接位置定位的分析方法.方法 首先验证rhIFN-α2b是否有游离半胱氨酸,然后通过TPCK胰蛋白酶酶切rhIFN-α2b蛋白质,HPLC-RPC法分离酶切样品并按峰分别收集各个肽段样品;采用质谱解析分子量和二次质谱肤段氨基酸系列测序,获得rhIFN-α2b的胰酶肽图;比对还原型与非还原型的胰酶肽图,找出差异肽段,并于理论胰酶酶切肽段比较,终确定rhIFN-α2b的二硫键位置.结果 rhIFN-α2b的二硫键位置与文献报道的天然人干扰素α2b的二硫键位置一致,为Cys1-Cys98、Cys29-Cys138.结论 建立了胰酶酶切、高效液相色谱(HPLC)法与MALDI-TOF MS质谱法联用测定活性多肽/蛋白质二硫键的分析方法,为今后蛋白质类药物的二硫键位置定位提供可靠分析手段.

质谱技术在感染性疾病诊断中的应用进展

质谱(mass spectrometry,MS)技术，尤其是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ion-ization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)，具有简便、快速及特异地分析微生物生物大分子标记物质谱图，从而实现临床微生物检验中细菌、真菌及病毒在属、种、株水平上的鉴定。MS在菌血症、尿路感染、毒素检测及耐药监测方面显示出巨大的优势，有望成为临床微生物实验室感染性疾病常用诊断方法。

利用MALDI-TOF MS进行恶性肿瘤血清蛋白组学研究方法的建立

目的:建立一套稳定的利用MALDI-TOF MS进行恶性肿瘤血清蛋白质组学分析方法.方法:通过对血清样品采集、保存条件的优化,标准蛋白质的选择,样品的前处理和上样分析等多种条件的优化,确定各个相关参数的选择.结果:经实验条件的比较与优化发现,血液样本采集1 h后经2000 g离心分离血清,分装成若干份.冻存于-80℃冰箱备用,样本前处理方法参照说明书进行;质谱分析条件为应用线性模式,采集范围800-10,000Da,利用多点采集的方法,8点采集,累加至400shots.保存备用.结论:通过优化实验条件,初步建立了利用MALDI-TOF MS进行血清蛋白质组学分析的一整套研究方法,生物质谱分析结果的整体稳定性和重复性可满足统计学和临床医学实验室分析要求.

核糖体蛋白保存条件对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定曲霉菌的影响

目的 探讨核糖体蛋白保存条件对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS,VITEK MS V 3.0)技术鉴定曲霉菌的影响.方法 从临床侵袭性曲霉菌感染患者标本中分离的曲霉菌,提取用于MALDI-TOF MS技术进行鉴定的核糖体蛋白,保存于不同条件下,应用MALDI-TOF MS技术对其进行鉴定,比较分析不同保存条件下MALDI-TOF MS技术的鉴定结果.结果 在4℃、-20℃和-80℃保存温度下鉴定正确率分别为97.73％、98.01％和97.73％,差异无统计学意义(x2=0.087,P=:0.957),核糖体蛋白在48 h、72 h、120h和168 h保存时间下鉴定正确率分别为97.73％、97.44％、98.01％和98.01％,差异无统计学意义(x2=0.827,P=0.843),在4℃、-20℃和-80℃条件下保存不同时间,其鉴定结果的质谱峰无明显变化.结论 用于质谱分析的菌株核糖体蛋白在4℃、-20℃或-80℃条件下,可稳定保存7d,其鉴定结果的质谱峰无明显变化,对MALDI-TOF MS技术鉴定结果无影响.

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在临床感染性曲霉菌快速鉴定中的应用

目的 探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS,VITEK MS V 3.0)技术在临床侵袭性曲霉菌鉴定中的应用价值.方法 分离来自于临床侵袭性曲霉菌感染患者标本中的曲霉菌,在不同的真菌培养条件下进行纯培养,应用MALDI-TOF MS技术对其进行鉴定,并与传统形态学鉴定技术鉴定结果进行比较分析.结果 88株菌株分别在沙保弱液体培养基、沙保弱琼脂培养基和察式琼脂培养基上培养,MALDI-TOF MS技术鉴定正确率分别为95.74％、95.45％和95.17％,形态学技术鉴定正确率分别为82.10％、86.08％和81.82％,不同培养基上培养鉴定正确率差异均具有统计学意义(x 2=136.936,P=0.000;x2=75.918,P=0.000;x2=122.612,P=0.000);88株菌株分别培养48 h、72 h、96 h和120 h,MALDI-TOF MS技术鉴定正确率分别为90.15％、97.35％、97.35％和96.97％,形态学技术鉴定正确率分别为77.27％、82.58％、85.23％和88.26％,不同培养时间鉴定正确率差异均具有统计学意义(x2=65.824,P=0.000;x2=132.021,P=0.000;x2=93.598,P=0.000;x2=61.382,P=0.000).结论 MALDI-TOF MS技术对临床侵袭性曲霉菌鉴定的准确率高于形态学鉴定技术,可在临床侵袭性曲霉菌鉴定中推广应用.

MALDI-TOF MS 在呼吸道感染丝状真菌鉴定中的应用

目的：用MALDI-TOF MS技术和形态学方法对139株丝状真菌进行鉴定，评估MALDI-TOF MS技术在丝状真菌鉴定中的应用。方法将从临床呼吸道标本培养分离出来的139株丝状真菌，经过预处理后，用法国梅里埃公司生产的质谱仪（VITEK MS）进行鉴定，并将结果与传统形态学鉴定方法结果进行对比。结果质谱仪对139株丝状真菌正确鉴定率为82．7％（115／139）；对曲霉属的鉴定正确率达到90．8％（108／119），其中烟曲霉和黄曲霉的鉴定正确率均为100％（77／77、21／21），黑曲霉的鉴定正确率50．0％（8／16），其他曲霉菌的鉴定正确率为40．0％（2／5）；对青霉属的鉴定正确率为58．3％（7／12）；对毛霉菌的正确鉴定率为0％（0／3）。呼吸道感染丝状真菌以曲霉菌属为主（89．2％），其中又以烟曲霉（55．4％）、黄曲霉（15．1％）和黑曲霉（11．5％）多见。结论 MALDI-TOF MS技术能快速准确鉴定常见丝状真菌，为丝状真菌的鉴定带来革命性突破，但对少见丝状真菌的鉴定仍有待于数据库的进一步完善。

新疆哈萨克族食管鳞癌miR-34a基因甲基化改变及其意义

目的:检测新疆哈萨克族食管癌miR-34a基因甲基化状态,探讨miR-34a基因甲基化与新疆哈萨克族食管癌之间的关系及意义.方法:运用基质辅助激光解析电离时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测59例新疆哈萨克族食管鳞癌、32癌旁非癌组织及34例正常食管粘膜中miR-34a基因甲基化状态.结果:miR-34a基因在新疆哈萨克族食管鳞癌、癌旁非癌组织中甲基化水平高于正常对照组.结论:新疆哈萨克族食管鳞癌及癌旁miR-34a基因甲基化率高于正常对照组,提示miR-34a基因甲基化可能与新疆哈萨克族食管癌的发生有关.