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胃癌相关蛋白GCRG213在胃癌细胞中特异性表达
目的:观察来源于胃癌高表达基因GCRG213抗体在两种不同细胞的表达情况,评价GCRG213抗体的肿瘤特异性.方法:应用免疫印迹方法对GCRG21 3抗体在胃癌细胞SGC-7901和胃上皮细胞HFE-145的表达进行比较分析.结果:GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应大小位置有一清晰的特异性条带,而与胃上皮H FE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现,GCRG213抗体与两种细胞蛋白的结合存在明显差异.结论:GCRG213抗体具有很强的肿瘤特异性.
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抗癌胚抗原单链抗体的原核表达及对人胃癌的检测
目的:探讨T84.66单链抗体的原核表达及对6种胃癌细胞系及胃癌组织的特异性亲和力.方法:将抗CEA单链抗体T84.66的cDNA插入噬菌粒载体pCANTAB5E,获得噬菌粒载体T84.66-scFv-pCANTAB5E.将后者转化入E.coli HB2151,经β,D异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用细胞培养及免疫细胞/组织化学方法,检测胃癌细胞中及石蜡包埋的胃癌组织中的癌胚抗原表达.结果:SDS-PAGE及Western blot证实,T84.66单链抗体蛋白分子正确表达.T84.66单链抗体可结合KATOⅢ,HGC-27和MKN45,表明这3种细胞表达了特异性肿瘤抗原;单链抗体不能结合SGC7901,GC803,BGC823.42例胃癌组织癌胚抗原阳性率早期和进展期分别为55%(6/11)和61%(19/31),在正常胃黏膜组织标本中无表达,二者之间存在显著性差异(P<0.05).结论:KATOⅢ等胃癌细胞系可表达癌胚抗原.后者在胃癌组织表达水平较高,而正常胃组织不表达.
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树突状细胞体内外对肝癌细胞的抑制作用
目的:研究树突状细胞对肝癌等肿瘤细胞的直接作用.方法:用rhGM-CSF和rhIL-4从健康人外周血诱导树突状细胞,用ELISA和MTT法分别检测DC培养上清液中IL-12和TNF水平,用MTT法检测DC对肝癌细胞SMMC-7 721、QGY-7703、HEPG-2、Alexander,胃癌细胞SGC-7901,慢性髓原性白血病细胞K562、Burkitt's淋巴瘤细胞Raji和正常人二倍体细胞的抑制作用,同时用流式细胞术检测DC表面FasL的表达,后用DC进行人肝癌裸鼠皮下抑制瘤的抑制试验.结果:诱导7 d的DC对4种肝癌细胞和胃癌细胞均有不同程度抑制作用,随着效靶比的增加,DC对肝癌细胞和胃癌细胞的抑制作用逐渐增加;DC预防人肝癌裸鼠皮下移植瘤,其抑制率为97%.结论:DC进入机体后也可以非特异性抑制方式发挥抑癌作用,本研究丰富和拓展了肝癌DC疫苗的内容,为今后肝癌DC疫苗的研究奠定了基础.
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非甾体类抗炎药对胃癌SGC7901细胞增生及环氧合酶活性的影响
目的:探讨非甾体类抗炎药(nonstemidal anti-imqammatory drugs,NSAID)对体外培养的胃癌细胞SGC7901生长及环氧合酶活性的作用.方法:用MTT法观察阿司匹林、尼美舒利对胃癌细胞SGC7901生长的影响;免疫细胞化学方法检测Ki-67及COX-2蛋白表达;采用放射免疫分析法测定细胞培养上清PGE2水平.结果:阿司匹林和尼美舒利呈时间、剂量依赖性方式抑制细胞增生,减少Ki-67蛋白表达.胃癌细胞SGC7901COX-2蛋白表达阳性,并伴有PGE2释放,尼美舒利可减少PGE2产生,但对COX-2蛋白表达无影响.结论:阿司匹林和尼美舒利均可抑制COX-2表达阳性的胃癌细胞SGC790l生长,尼美舒利通过抑制COX-2酶活性而减少PGE2释放,该研究提示COX-2可能在胃癌细胞SGC7901增生中起重要作用.
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BAK基因过表达对胃癌细胞的诱导凋亡作用及其分子机制
目的:探讨转染外源性BAK基因及其过表达对胃癌细胞的诱导凋亡作用和分子机制.方法:构建携带有BAK基因的真核表达载体并转染胃癌MKN-45细胞1-5d后,RT-PCR和Western Blotting法检测BAK基因表达;细胞计数、MTT比色法检测癌细胞生长活性,流式细胞仪分析细胞周期时相改变,透射电镜、末端TdT酶标记技术检测癌细胞凋亡;比色法检测癌细胞内Caspase-3活性改变.结果:转染1-5 d后,癌细胞BAK mRNA和蛋白表达水平显著增强(P<0.01),癌细胞体外生长抑制11.6-35.3%(P<0.01),增生活性抑制10.2-32.4%(P<0.01),细胞周期出现G0/G1期阻滞,部分癌细胞出现胞体缩小、核固缩等凋亡形态学改变,凋亡率为21.4%(P<0.01);癌细胞Caspase-3活性增强4.45倍(P<0.01).结论:转染外源性BAK基因使其过表达能激活Caspase-3,显著诱导胃癌MKN-45细胞凋亡,有望成为胃癌治疗的新途径.
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胃癌组织bcl-2基因表达与细胞凋亡和增生的关系
目的:探讨胃癌细胞bcl-2基因表达水平与肿瘤细胞增生活性及细胞凋亡程度的关系.方法:胃癌组织53例,用原位杂交及免疫组化染色法分别检测bcl-2 mRNA,bcl-2蛋白和增生细胞核抗原(PCNA)的表达,并采用凋亡细胞原位检测方法对组织切片中的凋亡细胞进行观察和比较.结果:胃癌组织表达bcl-2 mRNA 41例(77.4%),表达Bcl-2蛋白43例(81.1%),X2检验表明两种方法检测阳性率差异无显著性.胃癌53例增生期细胞标记物PCNA表达及凋亡细胞的阳性率均为100%,细胞凋亡和细胞增生指数呈显著性负相关(r=-0.993,P<0.01).随胃癌细胞Bcl-2蛋白表达水平升高,PCNA阳性细胞指数相应增加,肿瘤凋亡细胞指数则相应减少,Bcl-2蛋白+++组与++组间(t=2.552,2.699,P<0.05)及前两组分别与-组和+组间(t=4.487,3.975,2.807,3.094,4.885,5.816,3.404,3.895,P<0.01)凋亡和增生细胞指数差异均有显著性.结论:胃癌细胞bcl-2基因高表达可引起细胞凋亡减少与过度增生.
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致敏树突细胞及其亚细胞成分对荷胃癌小鼠的免疫治疗作用研究
目的:了解胃癌组织中DC的功能状态,探讨DC及其所分泌的亚细胞成分exosomes用于防治胃癌的可能性,旨在为胃癌的治疗探索一条新的途径.方法:利用致敏DC及其所分泌的亚细胞成分exosomes对荷胃癌小鼠进行治疗,观察其免疫治疗效果.结果:荷胃癌小鼠经胃癌细胞RNA致敏的DC及其所分泌的亚细胞成分exosomes治疗后,小鼠腹水产生率、肿瘤转移率、动物的存活率、瘤体平均质量等指标均明显优于对照组(P<0.01),局部组织中IL-12、IFNγ和IL-18的基因表达水平都明显升高(P<0.01),肿瘤局部CD4+、CD8+细胞数量增加(P<0.05),TIL细胞毒活性明显增强.结论:胃癌RNA致敏的DC及其所分泌的亚细胞成分exosomes,能促进胃癌抗原的提呈,并启动和增强局部的抗瘤免疫功能,改善临床症状和宿主的生存质量,对荷胃癌小鼠具有一定的免疫治疗效果.
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丝裂霉素联合舒林酸对胃癌SGC7901细胞诱导凋亡的研究
目的:研究丝裂霉素与舒林酸合用对人胃腺癌SGC7901细胞的生长抑制、诱导凋亡及凋亡相关基因bcl-2和COX-2基因表达的影响.方法:SGC7901胃癌细胞被分为三个实验组,舒林酸组、丝裂霉素组和舒林酸与丝裂霉素联合组.应用光镜、激光共焦显微镜、MTT法、流式细胞仪和免疫组化技术研究三组药物作用后,胃癌细胞的形态学变化、生长抑制、诱导凋亡和对凋亡相关基因Bcl-2和COX-2表达的影响.结果:药物作用于细胞后,可看到较为典型的细胞凋亡形态学变化:细胞核固缩,染色质凝集,核碎裂,染色质片段化,凋亡小体形成等.药物干预24h,联合组和MMC组对胃癌SGC7901细胞诱导的凋亡率分别为12.0%和7.20%.对细胞的增生抑制以联合组强,MMC次之,舒林酸弱.经MMC作用24 h后,COX-2和Bcl-2蛋白表达增强,而联合组出现COX-2蛋白表达减弱,Bcl-2蛋白亦未出现明显升高.结论:人胃癌SGC7901细胞体外实验中,MMC联合舒林酸使用,可使增生抑制加强.MMC可能由于上调COX-2、Bcl-2蛋白,减弱了自身对SGC7901胃癌细胞的诱导凋亡,MMC联合舒林酸可抑制COX-2、Bcl-2表达,从而提高MMC的抗癌效果.
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瞬时转染CD44反义寡核苷酸抑制人胃癌MGC80-3细胞增生并诱导凋亡
目的:研究CD44反义寡核苷酸(CD44ASODN)对人胃癌MGC80-3细胞的增生抑制和诱导凋亡的作用和机制.方法:设计并合成CD44ASODN,脂质体介导转入MGC80-3胃癌细胞,采用流式细胞术(FACS)检测CD44、Fas的表达及细胞凋亡;RT-PCR法检测CD44mRNA的表达;MTT法检测细胞增生.结果:CD44ASODN(1.6 μmol/L)明显地抑制MGC80-3细胞CD44mRNA和蛋白表达水平.CD44ASODN作用MGC80-3细胞48 h后,细胞的增生呈现明显的抑制作用,其抑制率为31.0%,72,96 h的抑制率分别为46.3%、49.6%(P<0.01),其增生抑制作用呈时间依赖效应.在CD44配体低分子质量透明质酸存在的环境中,CD44ASODN能显著增高细胞表面Fas分子的表达,表达率从6.7%提高为16.8%(P<0.01),并显著地增加MGC80-3细胞对FasmAb诱导凋亡的敏感性,凋亡率从0增加到26.5%(P<0.01).结论:CD44反义寡核苷酸通过抑制MGC80-3细胞CD44mRNA和蛋白表达,抑制MGC80-3细胞的增生,增高细胞表面Fas的表达及MGC80-3细胞对FasmAb诱导凋亡的敏感性,逆转胃癌细胞的免疫逃逸作用.
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进展期胃癌病理和预后影响因素的关系
目的:研究机体免疫因素和肿瘤生物学行为与进展期胃癌病理之间的相关性,比较并筛选对进展期胃癌预后有影响的指标.方法:获得6l例行根治性切除术的进展期胃癌预后资料,用免疫组化(SABC法)和TUNEL(原位末端标记)方法检测组织切片中胃癌细胞增生细胞核抗原标记指数(PCNA-LI)、树突状细胞(DCs,dendritic cells)浸润密度,凋亡指数(AI,apoptosis index),研究上述指标和病理之间的相关性并进行单因素、多因素生存分析.结果:PCNA-LI,DCs,AI与TNM分期、淋巴结转移、淋巴管浸润、胃癌分化有相关性.单因素生存分析表明胃癌患者的年龄、性别、病灶的大小、肿瘤分化、是否有淋巴管癌栓、AI等与胃癌预后无关.胃癌分期、浸润深度、淋巴结转移、PCNA-LI、DCs浸润密度是胃癌预后的影响因素(Log-ranktest,P<0.05).多参数回归生存分析表明肿瘤大小(RR=2.328),UICC(1997年)TNM分期(RR=5.251)是胃癌预后的独立影响因素(P<0.05).结论:UICC的胃癌TNM分期是判断胃癌预后有价值的指标.胃癌细胞本身生物学特性和机体的免疫状态与胃癌病理有一定相关性并且参与了对胃癌预后的影响.
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长春新碱诱导人胃癌耐药细胞表达P-糖蛋白由核因子-κB活化调控
目的:研究核因子-Kappa B(NF-κB)在胃癌长春新碱耐药细胞中的活化情况,及其对细胞膜P-糖蛋白(P-gp)表达的调控作用.方法:以胃癌细胞SGC7901及其长春新碱(VCR)耐药株SGC7901/VCR为研究对象.采用凝胶电泳迁移率分析检测NF-κB DNA结合活性,细胞-ELISA法检测细胞内IκB-α蛋白和细胞膜P-糖蛋白(P-gp)的表达,免疫细胞化学法观测细胞内P65核转位.结果:SGC7901/VCR耐药细胞中NF-kB的基础活性比敏感细胞高1.4倍.不同浓度VCR(5,10,20,50 μg/L)均可引起耐药细胞NF-κB DNA结合活性增强、Iκ3-α蛋白表达下降和P-gp表达增强,而亲本敏感细胞产生的上述效应均不及耐药细胞明显;SGC7901/VCR耐药细胞中,NF-κB活性与P-gp的表达呈正相关(r=0.977,P<0.01),且NF-κB活化的同时伴有P65核转位.NF-κB抑制剂MG-132可抑制VCR诱导的NF-κB活化及IкB-α降解,同时还能抑制P-gp高表达.结论:胃癌长春新碱耐药细胞中NF-кB活性增强,可能参与调控VCR诱导的细胞膜P-gp高表达.
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胃癌下调新基因CA11的功能研究
目的:胃癌下调新基因CA11的细胞定位及其生物学功能的研究.方法:地高辛标记CA11原位正常胃黏膜组织mRNA杂交.将CA11构建至pcDNA3.1/Myc-His(-)A载体,将其及空载pcDNA3.1/Myc-His(-)A载体稳定转染胃癌7901细胞系,Western blot证实CA11转染细胞CA11融合蛋白表达,行生长曲线及MTT检测,形态学分析结果.结果:NBT/BCIP显色表明,CA11位于正常胃黏膜上皮细胞胞内,CA11稳定转染胃癌7901细胞系表达CA11融合蛋白,生长曲线及MTT检测均表明,CA11显著抑制胃癌7901细胞的生长(72 h,0.379±0.019 A vs 0.467±0.021 A,P<0.01).较对照组空载转染7901细胞,CA11稳定转染胃癌7901细胞系形态不规则,核糖体、胞膜纤毛明显减少.结论:CA11位于正常胃黏膜细胞,能显著抑制胃癌细胞的生长,可能为一功能强大的候选抑癌基因.
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mRNA致敏树突细胞对胃癌的免疫治疗作用研究
目的:了解DC在胃癌胃黏膜中的功能状态,探讨DC用于胃癌等实体瘤防治的可能性,旨在为胃癌的治疗探索一条新的途径.方法:利用致敏DC治疗胃癌,以观察其对荷胃癌小鼠的免疫治疗效果.结果:荷胃癌小鼠经胃癌细胞RNA致敏的DC治疗后,小鼠腹水产生率、肿瘤转移率、动物的存活率、平均瘤体质量等指标分别为75%(6/8)、25%(2/8)、75%(6/8)、(2.04±0.33 g),均优于对照组(P<0.01);局部组织中IL-12、IL-18和IFN γ的基因表达水平都明显升高(P<0.01);肿瘤局部CD4+、CD8+细胞数量分别为0.71±0.25/μm2和0.67±0.22/μm2,P<0.05),TIL细胞毒活性明显增强.结论:胃癌RNA致敏的DC,能促进胃癌抗原的提呈并启动和增强局部的抗瘤免疫功能,改善临床症状和生存质量,对荷胃癌小鼠具有一定的免疫治疗效果.
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幽门螺杆菌对胃上皮细胞Cox-2表达与凋亡的影响
目的:研究Cox-2在胃癌细胞中及胃黏膜组织中表达的意义,探讨其表达与胃上皮细胞凋亡的关系.方法:将粗制H pylori总蛋白与胃上皮细胞株MKN28,AGS共同孵育,用RT-PCR及免疫组化染色法测定孵育前后细胞Cox-2表达的情况,同时检测了40例患者胃镜活检胃黏膜病变标本的Cox-2蛋白的表达及Hpylori感染情况.用流式细胞术观察H pylori、选择性Cox-2抑制剂NS-398及二者共同诱导细胞凋亡的情况.结果:与Hpylori孵育后的MKN28细胞株中Cox-2表达增加;Cox-2蛋白在与Hpylori共同孵育前后的MKN28细胞株中表达强度分别为0.26和0.40(P<0.05),AGS细胞中为0.29和0.31(P>0.05);Cox-2在胃癌中的表达明显高于浅表性胃炎(CSG)、萎缩性胃炎(CAG)组(P<0.05).流式显示,与Hpylori孵育24,48 h MKN28细胞凋亡率分别为1.0%和5.7%(P<0.01);与10,100,200 μmol/L NS-398孵育24 h及48 h的MKN28细胞凋亡率分别为1.2%,14.0%,27.5%及1.5%,31.2%,51.8%,具有浓度、时间依赖性(P<0.01).与Hpylori,NS-398共同孵育24,48h的MKN28细胞凋亡率分别为12.2%,25.0%,其凋亡率低于单用NS-398(P<0.01).结论:H pylori感染上调MKN28细胞中Cox-2的表达;Cox-2基因可抑制细胞凋亡,在胃癌发生发展过程中起重要作用,可能为胃癌形成的机制之一.
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钙周期素结合蛋白的细胞周期依赖性转位现象
目的 研究钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)在胃癌细胞SGC7901中亚细胞定位与细胞周期的关系.方法 利用双胸腺嘧啶脱氧核苷(胸苷)阻滞法将胃癌细胞SGC7901进行细胞周期同步化,流式细胞术检测细胞周期同步化效果.免疫荧光染色法观察CacyBP/SIP在不同时期的亚细胞定位.蛋白质印迹法检测CacyBP/SIP总蛋白及核蛋白在不同时期的表达水平.结果 采用双胸苷阻滞法使SGC7901细胞阻滞于G1/S期,撤药后培养4h,细胞进入S期.大多数细胞在8~12h时进入G2/M期,16h又重新进入G1期.免疫荧光染色发现,在G1和S期时,CacyBP/SIP主要分布在细胞浆中,而在以G2期为主的细胞中,CacyBP/SIP聚集在核周或进入胞核,说明CacyBP/SIP存在细胞周期依赖性的核转位.在细胞的各时相中CacyBP/SIP总蛋白无明显变化,但在G2期时CacyBP/SIP的核蛋白表达水平增高.结论 CacyBP/SIP存在细胞周期依赖的转位现象,可能参与了G2/M期的调控作用.
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曲古霉素A对人胃癌细胞SGC-7901的作用及其机制
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,其病死人数在我国居恶性肿瘤的首位.手术对早期胃癌有较好的疗效,但对中晚期的胃癌疗效欠佳.化疗和放疗对胃癌有效率均较低,只能作为辅助治疗.寻找更有效的治疗手段仍是目前胃癌研究的重点之一.近年研究表明,曲古霉素A(TSA)对肿瘤细胞有明显的抑制作用[1],但其对胃癌细胞的作用及其机制尚不完全清楚.本实验意在探索TSA对胃癌细胞SGC-7901的作用及其可能机制.
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抑制端粒酶活性能增加胃癌细胞对顺铂的敏感性
肿瘤细胞存在多药耐药现象和化疗药物的毒副作用是影响肿瘤化疗效果的主要原因.新近研究表明,表达于绝大多数肿瘤细胞而不表达于正常体细胞的端粒酶与化疗敏感性有关[1,2].在我们既往研究工作的基础上,我们观察了反义人端粒酶RNA(hTR)转染的SGC-7901胃癌细胞在端粒酶活性受抑制后对常用化疗药物顺铂敏感性的变化,探索胃癌联合化疗的新途径.
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体在胃癌中的表达
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是近发现的TNF家族新成员,因其独特结构和作用特点,有可能成为临床上重要抗肿瘤因子[1] .我们观察到TRAIL在体外可诱导胃癌细胞的凋亡[2].体外实验的目的是为了终使TRAIL在体内能够治疗胃癌.现已知TRAIL是通过其受体而起作用的.因此根据肿瘤表达其受体状况,决定了肿瘤对TRAIL敏感性.为此,我们检测了TRAIL受体(R1、R2、 R3、 R4)在胃癌组织中的表达,为TRAIL应用于胃癌的临床治疗提供理论基础.
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胃癌淋巴结微转移的检测及临床意义
目前胃癌是全球高发恶性肿瘤的第4位,病死率位于恶性肿瘤的第2位,严重威胁人类的健康。胃癌的转移和复发是影响预后的主要因素[1],而胃癌细胞在胃周淋巴结、腹腔以及外周血中的微转移可能是导致转移和复发的主要原因。近些年来,随着免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应在临床上的应用,使胃癌淋巴结微转移的检测成为可能。目前根治性手术可以有效的预防胃癌淋巴结复发率[2],随着化疗进展的提高,包括新的抗癌药物应用,使得早期胃癌5年生存率为90%,进展期胃癌5年生存率<40%。但是如何进行胃癌淋巴结微转移检测,减少复发率、提高生存率仍是我们目前面临的难题。
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体外模拟气腹环境对胃癌细胞增殖凋亡的影响
目的通过体外模拟气腹环境,观察二氧化碳(CO2)和氦气(He)在不同压力下对胃癌细胞MKN-45增殖、凋亡的影响. 方法实验分为对照组、CO2组和He组,其中CO2组和He组又按照压力不同分为0、5、10、15 mm Hg组(作用时间均为4 h).细胞在密闭培养箱内经不同压力CO2或He作用4 h后用血气分析仪检测培养液pH值;MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪观察细胞凋亡指数变化;Annexin V-FITC/PI双标染色、流式细胞仪测定凋亡细胞比例. 结果处理结束后即刻检测,CO2组细胞培养液呈弱酸性,He组细胞培养液呈弱碱性.MTT法检测细胞增殖变化,CO2组0、5、10 mm Hg组OD值与对照组比较无明显差异(P>0.05),15 mm Hg组OD值与对照组比较在前3天无明显差异(P>0.05),在4~7天OD值明显低于对照组(P<0.01).而在He组,不同压力组细胞增殖活性与对照组比较无明显差异(P>0.05).在CO2环境下,0、5 mm Hg组细胞凋亡指数与对照组比较无明显差异(P>0.05),而10、15 mm Hg组明显大于正常对照组(P<0.01).0、5 mm Hg组细胞凋亡比例与对照组比较无显著差异(P>0.05),而10、15 mm Hg组细胞凋亡比例明显大于对照组(P<0.01).在He环境下0、5、10、15 mm Hg组细胞凋亡指数和凋亡比例较对照组均无明显差异(P>0.05). 结论在临床常用压力范围内(≤10 mm Hg),CO2对胃癌细胞增殖、凋亡无明显影响,而在15 mm Hg压力下,CO2抑制细胞的增殖.