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支架蛋白活化蛋白激酶C受体1在胃癌细胞中的表达及其与胃癌细胞增殖的关系
目的 探讨活化蛋白激酶C受体1C(RACK1,GNB2L1)在胃癌细胞HGC27中的表达及过表达RACK1对HGC27生长增殖的影响.方法 体外培养胃癌未分化细胞HGC27和正常胃黏膜上皮细胞系GES-1,收集细胞48 h后,提取mRNA和蛋白,利用RT-PCR检测RACK1 mRNA在HGC27和GES-1细胞中的表达;利用Western blotting法检测RACK1蛋白在两种细胞中的表达;以人胚肾HEK293细胞cDNA为模板,构建pcDNA3.1 A-flag-RACK1重组质粒,利用Lipo2000转染入HGC27细胞中,Western blotting法检测质粒的转染效率,MTT法检测过表达RACK1对HGC27胃癌细胞系生长增殖的影响.结果 HGC27胃癌细胞中RACK1的mRNA和蛋白水平表达低于GES-1细胞(P＜0.01).双酶切鉴定和测序分析表明,pcDNA3.1 A-flag-RACK1重组质粒构建成功.将该质粒转入HGC27细胞后,与未转染组相比,空载转染组RACK1蛋白表达无明显区别(P＞0.05),pcDNA3.1-RACK1转染组RACK1蛋白表达明显升高(P＜0.01);转染pcDNA3.1 A-flag-RACK1转染组细胞存活率在72 h和96 h明显少于pcDNA3.1空载对照组(P＜0.01).结论 支架蛋白RACK1的mRNA和蛋白水平在HGC27细胞中低表达,上调RACK1的表达可明显抑制HGC27细胞增殖.
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浆膜腔积液恶性肿瘤细胞鉴别诊断标志物研究进展
良性和恶性浆膜腔积液的诊疗和预后不同,因此对浆膜腔积液恶性肿瘤细胞的鉴别诊断具有重要的临床意义.传统的浆膜腔积液细胞学检杳特异性高,但敏感性较低,特别是转移性癌细胞和间皮细胞的形态学上有交叉,鉴别诊断常很困难.随着免疫细胞化学和分子遗传学技术的进步,越来越多的标志物开始被应用于浆膜腔积液恶性肿瘤细胞的鉴别诊断.一、闭合蛋白(claudin)细胞间的紧密连接由咬合蛋白、闭合蛋白和连接黏附分子构成.目前已发现闭合蛋白家族由24个跨膜蛋白亚型组成,相对分子质量为20 000 ～27 000[1].闭合蛋白表达异常所致的细胞间紧密连接功能的失常,可能是影响肿瘤细胞发生、发展的原因之一.研究显示,闭合蛋白-1、-7在宫颈癌中表达显著增高,闭合蛋白-3、4在浆液性卵巢癌中呈高表达,而闭合蛋白-4的低表达与胃癌细胞的低分化、浸润深度和转移情况密切相关[ 2-3].
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胃癌中Her-2/neu过表达与基因扩增及其意义
Her-2/neu基因编码的相对分子质量185 000的蛋白质(P185)能加速细胞运动,促进癌细胞转移.已证实有Her-2/neu基因扩增的乳腺癌患者(约占乳腺癌患者25%)手术后易复发,生存期短并对常用的化疗药物如环磷酰胺、5-氟尿嘧啶等不敏感[1,2].本项研究的目的是通过双色荧光原位杂交(dual color fluorescence in situ hybridization,FISH)技术和免疫组织化学技术检测各类型胃癌细胞中Her-2/neu基因数量及蛋白表达并探讨其临床意义.
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人p53 175位点minigene对胃癌细胞体外生长的影响
肿瘤的发生发展是多阶段和多基因参与的极为复杂的过程,p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性高的基因[1].
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白桦酯酸对人CIK细胞杀伤胃癌细胞株SGC-7901的功能影响及机制研究
目的 观察白桦酯酸作用前后对人CIK细胞增殖及对胃癌SGC-7901细胞杀伤活性的影响,探讨其发生的机制.方法 分离健康者外周血单个核细胞( PBMC)在体外经多种细胞因子诱导为CIK细胞,收集培养第10天的CIK细胞,给予不同浓度白桦酯酸诱导48 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测人CIK细胞增殖率；流式细胞术(FCM)检测白桦酯酸作用前后CIK细胞穿孔素(PFP)、颗粒酶B(GrB)、CD107a的表达变化；乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定白桦酯酸对CIK细胞杀伤胃癌细胞株SGC-7901的活性影响；Western blot检测药物诱导前后CIK细胞胞外信号调节激酶(ERK1/2)和接头蛋白76KD含有SH2结构域的白细胞特异性磷酸蛋白(SLP-76)、T细胞活化连接分子(LAT)的表达变化.结果 白桦酯酸浓度在0.08 ～ 10μg/ml时能促进CIK细胞生长；经白桦酯酸诱导后的CIK细胞PFP、GrB、CD107a的表达显著高于对照组(P＜0.05),对胃癌SGC-7901细胞的杀伤活性亦显著高于对照组(P＜0.05)；经白桦酯酸作用的CIK细胞,其SLP-76、LAT、ERK1/2的表达不同程度增加,显著高于对照组(P＜0.05).结论 白桦酯酸在一定浓度范围内能够促进CIK细胞增殖,并增强其对胃癌SGC-7901细胞的杀伤活性,其机制可能与活化SLP-76、LAT、ERK1/2,上调CIK细胞表面PFP、GrB、CD107a的表达有关.
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新城疫病毒体外感染胃癌细胞诱导HSP70的表达及意义
我们通过新城疫病毒(NDV)感染诱导胃癌细胞HSP70(热休克蛋白)蛋白的表达,观察其在体外抗瘤活性,进一步探讨NDV的抗瘤机制,为未来肿瘤的生物治疗提供试验资料.
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c - FLIP 调节 TRAIL 诱导胃癌细胞凋亡敏感性的研究
目的：探讨凋亡抑制蛋白 c - FLIP 对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导胃癌细胞 SGC7901凋亡的影响。方法采用 RNAi 技术干扰 c - FLIP 的表达，MTT 法测定细胞活力、采用 Hoechst 33258染色及流式细胞仪检测细胞凋亡，定量 PCR 和 Western blot 法检测 c - FLIP，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（caspase -8）的表达。结果特异性的 RNAi 能够显著抑制 c - FLIP mRNA 和蛋白的表达。单独使用不同浓度 TRAIL 处理 SGC7901细胞24 h 后，发现细胞的存活率有所降低，但没有显著差异。在干扰 c - FLIP 表达的同时用 TRAIL 100 ng/ ml 作用胃癌细胞 SGC7901不同时间（6 h，12 h，24 h），发现作用24 h 后，细胞的存活率为对照组的62.8%，显著降低（ P <0.05），而处理后不同时间的对照组细胞存活率无显著差异（ P >0.05）。凋亡实验显示在二者共同作用 SGC7901细胞24 h 后，能够促进细胞的凋亡。Western blot 结果显示二者共同作用24 h 后，c - FLIP 显著降低、caspase -8及激活型 caspase -8（p -18）的表达均显著升高。结论抑制 c - FLIP 的表达增强了 TRAIL 诱导胃癌细胞 SGC7901的凋亡。
关键词： 胃癌细胞 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 c-FLIP 细胞凋亡 敏感性 -
不同构型甲硫氨酸与化疗药物对胃癌细胞增殖与凋亡效应的影响
目的通过体外实验了解甲硫氨酸(Met)及其联合化疗药物对胃癌细胞增殖与凋亡的效应.方法选用人胃癌细胞株SGC-7901为培养对象,以RPMI-1640培养基为基础分为三组:L-Met组,含0.15%L-Met;D-Met组,含0.15%D-Met;Met-Hcy+组,不含Met而替以0.27%同型半胱氨酸(Hcy);三组培养基中分别加入不同浓度的5-氟脲嘧啶(5-FU),5-FU与细胞接触的终浓度分别为0、1、10 mg/L.分别培养24和48小时用MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡状况.结果(1)细胞增殖状况:D-Met组存活的胃癌细胞少,L-Met组存活的胃癌细胞明显多于另两组;各组中存活的肿瘤细胞随5-FU浓度的增高而显著减少;培养48小时存活的细胞明显多于培养24小时.(2)细胞凋亡状况:D-Met组早期凋亡率、晚期凋亡率和总细胞凋亡率高;各组细胞凋亡率随5-FU浓度的提高和培养时间的延长相应增高.结论D-Met和5-FU均可诱导胃癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,D-Met较Met-Hcy+更具优势.
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mir-155-5 p调控胃癌细胞肿瘤生物学特征的靶点研究
目的：：将mir-155-5p在胃癌细胞过表达后,选用表达谱芯片筛选其靶基因,结合生物信息学预测选择部分两者的交集靶基因,研究其功能和作用机制。方法：采用Affymetrix真核生物基因表达谱筛选mir-155-5p调控的基因实验,然后通过Western blot技术检测筛选靶基因的蛋白表达。本研究采用了人类全基因组基因表达谱芯片筛选了mir-155-5p mimics,mir-155-5p mimics-nc和mir-155-5p mock转染胃癌MKN-45和BGC-823细胞的后差异表达基因。结果：mimics在转染胃癌细胞BGC-823中后,与mimics-nc组和mock组细胞相比, mimics组细胞的SMAD1、STAT1、CAB39、CXCR4和CA9的mRNA的表达量显著下调；mimics在转染胃癌细胞BGC-823和MKN-45后,与mim-ics-nc(MNC)组和mock(MOCK)组相比,mimics(MIMICS)组细胞的 SMAD1、STAT1和 CAB39的蛋白的表达下调。结论：SMAD1、STAT1、CAB39作为mir-155-5p的预测靶蛋白,mir-155-5p过表达可使其在胃癌细胞MKN-45和BGC-823中的表达水平下调。
关键词： mir-155-5p 表达谱芯片 靶基因 胃癌细胞 蛋白表达 -
MMP-9反义寡核苷酸抑制胃癌细胞生长的实验研究
目的 探讨MMP-9反义寡核苷酸作为靶基因对胃癌细胞的生长抑制效应,以进一步揭示MMP-9反义寡核苷酸治疗胃癌的可能性和可行性.方法 以人胃癌细胞株MGC803为研究对象,应用ASODN技术,将MMP-9ASODN转染到MGC803细胞中,利用MTT法检测不同浓度不同时间MMP-9反义寡核苷酸对MGC803细胞的杀伤活性,流式细胞仪检测分析MMP-9反义寡核苷酸对MGC803细胞周期及凋亡的影响.结果 MMP-9反义寡核苷酸在体外能够抑制MGC803肿瘤细胞增殖,且这种增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性:MMP-9反义寡核苷酸在体外能够诱导MGC803肿瘤细胞凋亡,作用与浓度和时间有关.结论 MMP-9反义寡核苷酸可望成为一种人胃癌临床有效的治疗方法.
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沉默干扰HMGA2对胃癌细胞Wnt/β-Catenin信号转导通路的影响
目的:观察小分子RNA沉默HMGA2在胃癌细胞株MKN-45的表达,研究HMGA2对Wnt/β-Catenin通路中主要分子β-Catenin以及下游靶分子c-myc、Cyclin D1的表达量及转录活性的影响,探讨HMGA2对Wnt/β-Catenin信号转导通路的影响.方法:构建针对人MGA2基因的shRNA真核表达载体,瞬时转染人胃癌细胞株MKN-45,用RT-PCR、Western blot分别检测转染后shHMGA2组、scrambled组和空白对照组细胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表达情况,评估抑制效应；分别检测转染后3组细胞中的β-Catenin、c-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达水平.结果:转染48 h后shHMGA2-1组的HMGA2mRNA相对表达量(0.58±0.07),与shHMGA2-2组(0.92±0.13)、shHMGA2-3组(0.90±0.16)、scrambled组(1.07±0.14)及空白对照组(1.19±0.09)相比有统计学意义(P＜0.05),其他4组相比无统计学意义(P＞0.05)；转染48 h后shHMGA2-1组的HMGA2沉默效果好,HMGA2 mRNA表达明显下降,抑制率51.3％；故选用质粒shHMGA2-1继续后续实验；Western blot结果显示转染72 h后shHMGA2-1组HMGA2蛋白相对表达量为(0.11±0.03),与scrambled组(0.48±0.12)及空白对照组(0.55±0.08)相比有统计学意义(P＜0.05),HMGA2蛋白表达明显下降,抑制率80％；沉默干扰HMGA248 h和72 h后,β-Catenin mRNA和蛋白表达水平在空白对照组(1.07±0.02,0.69±0.04)与scrambled组(0.91±0.02,0.67±0.10)中无明显差异(P＞0.05),而shHMGA2-1组(0.53±0.04,0.44±0.05)较之两组有明显的下降(P＜0.05)；shHMGA2-1组中c-myc mRNA和蛋白相对表达量为(0.39±0.04,0.25±0.07)较之空白对照组(0.88±0.05,0.75±0.09)、scrambled组(0.84±0.03,0.66±0.l0)有明显下降(P＜0.05),后两组相比较无统计学意义(P＞0.05)；shHMGA2-1组中Cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达量为(0.31±0.02,0.12±0.01)较之空白对照组(0.52±0.03,0.73±0.12)、scrambled组(0.51±0.01,0.63±0.07)有明显下降(P＜0.05),后两组相比较无统计学意义(P＞0.05).结论:RNAi载体能有效地抑制HMGA2在胃癌细胞株MKN-45中的表达,沉默干扰HMGA2抑制了Wnt/β-Catenin通路中的主要分子β-Catenin以及下游靶分子c-myc、Cyclin D1的表达,HMGA2基因可能是通过调控Wnt/β-Catenin通路对胃癌细胞生长和凋亡发挥作用的.
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常氧与低氧下CagA+幽门螺杆菌对人胃癌SGC7901细胞系HIF-2α、ABCG2表达的影响
目的:观察常氧与低氧下CagA+幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)对人胃癌SGC7901细胞系低氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2alpha,HIF-2α)、ABCG2表达的影响,初步探讨H.pylori在胃癌发生发展中的干细胞机制,及其与肿瘤微环境低氧的协同作用.方法:内镜下采集胃黏膜标本,行H.pylori培养并鉴定,PCR方法检测H.pylori CagA+基因.CagA+ H.pylori与胃癌SGC7901细胞于常氧和低氧环境下共培养48 h(分常氧对照组、低氧对照组、常氧CagA+H.pylori组、低氧CagA+ H.pylori组).免疫细胞化学法检测HIF-2α和ABCG2蛋白的表达,RT-PCR法检测ABCG2 mRNA的表达.结果:免疫细胞化学结果显示:常氧下胃癌SGC7901细胞HIF-2α、ABCG2蛋白呈低水平表达,低氧和CagA+H.pylori均能显著诱导HIF-2α、ABCG2蛋白表达(与常氧对照组相比,均P＜0.01),与低氧对照组和常氧CagA+H.pylori组相比,低氧CagA+H.pylori组表达进一步升高(均P＜0.01).相关分析显示HIF-2α与ABCG2表达呈正相关(r=0.976,P＜0.05).RT-PCR检测ABCG2 mRNA表达结果与免疫细胞化学一致.结论:CagA+ H.pylori可刺激胃癌细胞HIF-2α、ABCG2表达,低氧环境下其表达进一步增加,表明CagA+ H.pylori和低氧对HIF-2α、ABCG2的表达有协同作用.提示CagA+H.pylori和低氧可能是诱导胃癌细胞干细胞化及化疗抵抗的重要原因.
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奥曲肽联合汉防己甲素对人胃癌细胞增殖的影响
目的:观察奥曲肽、汉防己甲素单独及联合应用对体外培养人胃癌细胞株增殖的影响,并初步探讨其可能的作用机制.方法:以MTT比色法观察奥曲肽(善宁)、汉防己甲素(Tet)单独及联合应用对体外培养人胃癌细胞株SGC790l和MKN 45增殖的影响,并用Fura-2/AM荧光标记法测定了其对胃癌细胞内游离Ca2+浓度的影响.结果:2.4×10-5 mol/L、2.4×10-6 mol/L高浓度奥曲肽、10-160 μmol/L浓度范围的Tet对体外培养人胃癌细胞株SGC 7901和MKN 45均有显著的抑制作用,其增殖抑制率(IR)分别为,对SGC 7901:40.76%、23.2%和30.5-70.0%;对MKN 45:24.9%、21.7%和20.4-79.01%(P＜0.05或P＜0.01);奥曲肽2.4×10-6、2.4×10-9、2.4×10-12 mol/L分别与Tet 10 μmol/L联合应用,可将其对SGC7901和MKN 45的IR分别由32.8%和27.0%提高至50.5%和60.3%、55.0%和47.7%、67.8%和63.0%(vs Tet组P＜0.05或P＜0.01).10μmol/L Tet作用于SGC 7901和MKN 45,其细胞内游离Ca2+浓度较对照组显著降低(394.2±18.4 nmol/L vs 505.0±15.8 nmol/L,412.1±20.8 nmol/L vs 512.0±16.0 nmol/L,P＜0.01);2.4×10-6 mol/L奥曲肽亦可显著降低胃癌细胞内的钙离子浓度(SGC 7901 450.8±20.1 nmol/L,P＜0.01;MKN45413.1±10.4 nmol/L,P＜0.01).但奥曲肽联合Tet并不能进一步降低胃癌细胞内钙离子浓度.结论:Tet对体外培养人胃癌细胞有剂量依赖性的抑制作用,其机制可能是通过降低细胞内游离Ca2+浓度发挥其抗增殖作用.高浓度奥曲肽的抗增殖作用亦可能与其抗钙作用有关;各浓度奥曲肽可显著提高小剂量Tet对胃癌细胞的抑制作用,但与其抗钙作用无关.
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丹参酮ⅡA对低氧培养下人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡及HIF-1α表达的影响
目的:观察丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对低氧培养下人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡及HIF-1α表达的影响.方法:用氯化钴(CoCl2)创建低氧模型,设常氧对照组、低氧对照组和低氧加不同浓度Tan ⅡA组.分别取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的Tan ⅡA干预低氧胃癌SGC7901细胞24、48、72 h后,MTT法检测细胞活力:用上述同样浓度的Tan ⅡA干预低氧胃癌细胞48 h和72h后.HOECHST染色法检测细胞凋亡.Tan ⅡA(0.5、2.0、10.0 mg/L)干预低氧胃癌细胞48h后,免疫细胞化学二步法检测HIF-1α蛋白表达的变化.结果:MTT法证实,低氧条件下,Tan ⅡA呈时间、剂量依赖性地抑制胃癌SGC-7901细胞增殖(P＜0.01),10.0 mg/L Tan ⅡA作用细胞72 h后,其抑制率达71.2%.HOECHST染色法发现,低氧条件下,分别用0.5-1 0.0 mg/L浓度的Tan ⅡA作用胃癌细胞24、48 h,Tan ⅡA可呈时间、剂量依赖性地诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡(F=60354.00,187922.10,均P＜0.05),10.0mg/L Tan ⅡA作用细胞72 h后,凋亡率达40.70%±1.55%.免疫细胞化学法显示,Tan Ⅱ A呈剂量依赖性地抑制低氧诱导的HIF-1α蛋白表达(F=712.326,P＜0.01).结论:低氧条件下,Tan ⅡA抑制胃癌细胞增殖并诱导其凋亡,这种作用可能与其抑制HIF-1α蛋白表达有关.
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丹参酮ⅡA联合5-FU对低氧下人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡的影响及与HIF-1α和突变型P53表达的关系
目的:观察低氧环境下不同浓度的丹参酮ⅡA(Tan Ⅱ A)联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡的影响及与HIF-1α和突变型P53的表达.方法:用氯化钴(CoCl<,2>)创建低氧模型,采用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的TanⅡA联合10.0 mg/L的5-FU分别作用于低氧SGC7901细胞24、48和72 h,MTT法检测细胞活力:用上述同样方式作用于低氧SGC7901细胞24、48和72 h后,Hoechst染色法检测细胞凋亡:TanⅡA(0、0.5、2.0、10.0 mg/L)联合10.0 mg/L的5-FU作用于低氧SGC7901细胞48h后,免疫细胞化学二步法检测IHIF-1α及突变型P53的表达.结果:低氧环境下,不同浓度的Tan Ⅱ A联合10.0 mg/L 5-FU呈时间、剂量依赖性地抑制SGC7901细胞的增殖(均P<0.01),10.0 mg/LTan Ⅱ A联合5-FU作用细胞72 h后,其抑制率为67.46%.0.5-10.0 mg/L TanⅡA联合5-FU作用细胞24、48、72 h.TanⅡA呈时间、剂量依赖性地促进SGC7901细胞凋亡(均P<0.01).HIF-1α及突变型P53表达明显高于常氧组(t=22.786,13.914,均P<0.01),不同浓度的Tan Ⅱ A联合10.0 mg/L 5-FU作用细胞48 h后,HIF-1α、突变型P53蛋白表达明显降低(F=182.234,130.062,均P<0.01),且二者呈高度正相关(n=5,r=0.995,P<0.01).结论:在低氧环境下,TanⅡA可能通过抑制HIF-1α及突变型P53蛋白表达从而增强5-FU抑制SGC7901细胞增殖及诱导凋亡作用.
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幽门螺杆菌提取物体外对人胃癌细胞SGC-7901形态的影响
目的:探讨幽门螺杆(H pylori)刺激人胃癌细胞SGC-7901后,对细胞形态,迁移以及细胞骨架的影响.方法:从人胃黏膜组织中分离培养H pylori,将得到的H pylori菌体超声裂解,用超声提取物刺激SGC-7901细胞,直接观察SGC-7901细胞形态的变化:细胞迁移活动用Boyden迁移槽和划线法分析;用phalloidin对细胞内F-actin进行荧光染色,研究其对细胞骨架的作用.各组间细胞迁移数量比较用单因素方差分析,组间两两比较用SNK检验:对照组和刺激组细胞发生蜂鸟表型的百分率进行t检验.结果:H pylori菌体超声提取物刺激人胃癌细胞SGC-7901后,细胞的活动性增强,高浓度和低浓度刺激组与对照组相比细胞迁移数明显提高(F=12697.314,P＜0.01),两两之间相比也具有统计学意义(P＜0.01).受刺激后蜂鸟表型细胞数较对照组大大提高(t=29.626,P＜0.01).对照组细胞仅有少量应激纤维形成,H pylori刺激10 min后,应激纤维增加.结论:H pylori可诱导胃癌细胞SGC-7901发生形态改变,促进其迁移,并且增加细胞内细胞骨架的形成.
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PI3K p55γ N末端氨基酸过表达对胃癌MGC803细胞迁移的影响
目的:观察p55γ N末端24个氨基酸的过表达对胃癌MGC803细胞迁移的影响.方法:通过脂质体介导用pEGFPN24和空载体pEGFPC1质粒进行基因转染, 建立稳定表达融合蛋白GFP-N24和GFP的细胞系; 通过细胞划痕实验和迁移实验观察GFP-N24的过表达对细胞运动迁移的影响; 明胶酶谱实验观察其对肿瘤转移相关基因MMP9表达和分泌的影响; 免疫印迹实验检测GFP-N24的过表达对PI3K-Akt信号通路活性的影响.结果:建立了稳定表达融合蛋白GF P-N24的MGC803/GFP-N24细胞系和表达GFP的MGC803/GFP细胞系. 细胞划痕实验和细胞迁移实验发现表达GFP-N24的MGC803细胞运动迁移能力下降(t = 0.003, P <0.01). GFP-N24通过减少磷酸化Akt的表达而抑制PI3K-Akt信号的活性, 但其对MMP9的表达和分泌没有影响.结论:P I3K p55γ N末端24个氨基酸通过抑制PI3K-Ak t信号通路的活性而抑制胃癌MGC803细胞的迁移, 其在胃癌的治疗上可能具有潜在的应用前景.
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人pEGFP-PKARⅡβ重组质粒的构建及其在BGC-823胃癌细胞中的表达
目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RⅡβ(PKARⅡβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方法:以pRSETB-PKARⅡβ质粒为模板,PCR扩增出全长PKARⅡβ编码序列,用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,亚克隆至含有GFP标签的融合表达栽体pEGFP-C1中.测序正确后,将重组质粒转染到胃癌细胞BGC-823中,提取细胞蛋白进行Western bolt检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-PKARⅡβ在人胃癌细胞BGC-823内的定位.结果:将人全长PKARⅡβ编码序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1.2 kb,在预期的位置产生条带.Western blot检测到了融合蛋白正确表达,分子量约为72 000 Da.并观察到GFP-PKARⅡβ在HEK293和BGC-823细胞内都有表达,且定位以细胞质为主,在细胞核内少量表达.结论:成功构建了人全长PKARⅡβ编码序列的pEGFP-PKARⅡβ真核表达载体,证实GFP-PKARⅡβ蛋白在BGC-823细胞质内特异表达,为进一步研究PKARⅡβ的在胃癌中的功能提供了重要的实验材料.
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Foxo3a对胃癌细胞SGC7901凋亡的促进作用
目的:观察转录因子Foxo3a对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响,并初步探讨其促进凋亡的分子机制.方法:构建Foxo3a真核表达质粒,转染培养的胃癌细胞系SGC7901 4-6 h,在FBS完全培养基培养24 h后,换成0.1%无血清的培养基中培养8 h,TUNEL染色观察对胃癌细胞凋亡的影响,Western blo检测切割的caspase-3和PARP水平.结果:成功构建了Foxo3a真核表达质粒.转染胃癌细胞后,与对照组相比,1和2 μg Foxo3a处理组胃癌细胞凋亡率达到了5.8%±2.3%和11.1%±3.4%.是对照组的近2和4倍.caspase-3和PARP活性明显增高.结论:Foxo3a是一种肿瘤抑制因子,可通过促进caspase-3和PARP的活性来诱导癌细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞的生长.
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EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2A对胃癌细胞增殖的影响
目的:构建EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的腺病毒表达载体,探讨LMP2A表达对胃癌细胞的作用.方法:RT-PCR扩增获取目的基因LMP2A,采用AdEasy系统构建携带目的基因的重组腺病毒载体pAd-2A,脂质体法将重组质粒pAd-2A转染HEK293细胞包装重组腺病毒.用重组腺病毒感染靶细胞SGC(胃癌细胞),通过MTT实验、流式细胞分析、激光共聚焦检测目的基因LMP2A表达对靶细胞增殖的影响.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实,目的基因LMP2A正确插入重组质粒,HEK293细胞成功包装出具有稳定感染性的重组腺病毒,命名为vAd-2A,经测定病毒滴度为3.16×1012 pfu/L.MTT实验、流式细胞分析以及激光共聚焦检测结果显示,感染腺病毒vAd-2A的SGC细胞增殖旺盛(感染vAd-2A细胞vs感染vAd细胞和未感染病毒细胞,P＜0.01),S期细胞比例升高(24 h:35.2%±5.1% vs 14.0%±3.4%,13.2%±4.6%,P＜0.01;48 h:25.6%±4.1% vs 12.9%±2.6%,12.5%±3.2%,P＜0.01),LMP2A可诱导细胞周期调节蛋白cyclinE的表达.结论:成功构建了EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的重组腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒,同时证实LMP2A可通过诱导cyclinE的表达促进SGC细胞增殖.
