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EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2A对胃癌细胞增殖的影响
目的:构建EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的腺病毒表达载体,探讨LMP2A表达对胃癌细胞的作用.方法:RT-PCR扩增获取目的基因LMP2A,采用AdEasy系统构建携带目的基因的重组腺病毒载体pAd-2A,脂质体法将重组质粒pAd-2A转染HEK293细胞包装重组腺病毒.用重组腺病毒感染靶细胞SGC(胃癌细胞),通过MTT实验、流式细胞分析、激光共聚焦检测目的基因LMP2A表达对靶细胞增殖的影响.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实,目的基因LMP2A正确插入重组质粒,HEK293细胞成功包装出具有稳定感染性的重组腺病毒,命名为vAd-2A,经测定病毒滴度为3.16×1012 pfu/L.MTT实验、流式细胞分析以及激光共聚焦检测结果显示,感染腺病毒vAd-2A的SGC细胞增殖旺盛(感染vAd-2A细胞vs感染vAd细胞和未感染病毒细胞,P＜0.01),S期细胞比例升高(24 h:35.2%±5.1% vs 14.0%±3.4%,13.2%±4.6%,P＜0.01;48 h:25.6%±4.1% vs 12.9%±2.6%,12.5%±3.2%,P＜0.01),LMP2A可诱导细胞周期调节蛋白cyclinE的表达.结论:成功构建了EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的重组腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒,同时证实LMP2A可通过诱导cyclinE的表达促进SGC细胞增殖.
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EB病毒LMP2A和EB病毒BZLF1融合基因反转录病毒表达载体的构建
目的:将LMP2A和BZLF1基因进行融合同时可发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用,协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞.实验拟构建含EB病毒潜伏膜蛋白2A编码基因和即刻早期基因融合基因的反转录病毒表达载体,并筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法:实验于2006-08/2007-08在济宁医学院微生物教研室和青岛大学医学院微生物教研室进行.应用反转录-聚合酶链反应分别获得潜伏膜蛋白2A和即刻早期基因编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A.将融合基因Z2A定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-Z2A,脂质体法将pMSCVpuro-Z2A转染反转录病毒包装细胞PT67.嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实Z2A正确插入逆转录病毒表达载体,筛选获得了稳定产毒的嘌呤霉素抗性细胞克隆,收获病毒的滴度为7.8×106 CFU/L,且重组逆转录病毒在PT67细胞能有效转录.结论:携带Z2A基因的重组反转录病毒表达载体pMSCVpuro-Z2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组反转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Z2A的产毒细胞系PT67-Z2A.
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EBV融合基因Z2A腺病毒的制备及其在诱导EBV阳性细胞凋亡的应用
目的:构建EB病毒基因LMP2A及BZLF1的融合基因(Z2A)重组腺病毒表达载体,探讨Z2A融合蛋白对EBV+细胞凋亡的作用.方法:利用AdEasy系统构建重组腺病毒载体pAd-Z2A,而后将之转染293细胞(人胚肾细胞)产生重组腺病毒rAd-Z2A.后者用于感染EBV阳性及阴性细胞,RT-PCR、Westem-blotting检测Z2A的mRNA和蛋白表达,以及流式细胞术检测其对EBV阳性细胞凋亡的调控.结果:序列测定和酶切实验均证实,Z2A融合基因正确插入穿梭质粒,并成功获得重组腺病毒表达载体pAd-Z2A及重组腺病毒rAd-Z2A.感染rAd-Z2A的NEC靶细胞检测到Z2A的表达.流式细胞术检测发现,与EBV-细胞组及EBV+空白质粒转染组相比,接种rA1-z2A的EBV+细胞组48h(P＜0.05)凋亡细胞显著增多,72h时细胞近乎全部凋亡(P＜0.01).结论:重组腺病毒rAd-Z2A可有效感染EBV+及EBV-细胞,从而显著促进EBV+细胞凋亡而不影响EBV-细胞,为进一步特异性靶向EBV+肿瘤的基因治疗奠定基础.
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EB病毒潜伏膜蛋白2A抗原表位的融合表达及其意义
为了探讨含有EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)抗原表位片断表达的融合蛋白在鼻咽癌血清学检测中的应用意义,通过重叠延伸PCR方法,合成了3对相互重叠的寡核苷酸引物,涵盖LMP2A的主要的4个抗原表位,将它们拼接在一起构建一个多肽融合基因,克隆到PGEX-4T-2载体中表达融合蛋白,以GST亲和层析柱法纯化融合蛋白,鉴定后以此为抗原检测鼻咽癌患者的血清.结果表明,获得了含EB病毒LMP2A主要的4个抗原表位的融合蛋白(EC2A),蛋白纯度达90%以上,ELISA结果显示鼻咽癌患者血清的检出率为77.9%,正常人群血清为阴性,与常规的VCA-IgA法进行比较,有9份(13.3%)血清VCA-IgA为阴性而EC2A-IgG检出阳性,为鼻咽癌的临床检测提供了新思路,也为后续的单克隆抗体制备奠定了基础.
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抗EB病毒LMP2A单克隆抗体的制备及免疫学特性分析
目的:利用杂交瘤技术制备抗EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)单克隆抗体并分析其免疫学特性.方法:以LMP第2和第5胞外区表位串联制备的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备抗LMP2A的单克隆抗体.通过ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术等方法鉴定单抗的免疫学特性.结果:获得1株稳定并持续分泌抗LMP2A单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株,所分泌的单克隆抗体5C 12-C4-A6能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面的LMP2A蛋白.结论:本文制备了能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面LMP2A蛋白的单克隆抗体,为进一步进行鼻咽癌临床早期诊断和分子靶向治疗奠定了基础.
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EB病毒潜伏膜蛋白2A胞外区重组基因在大肠杆菌中的表达及其在血清学检测中的应用
目的:构建EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)胞外区重组基因的表达载体在大肠杆菌中表达,并将表达的蛋白用于EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者的血清学检测.方法:用BamHⅠ和EcoRⅠ将含LMP2A胞外区重组基因的质粒pEC2A双酶切后,克隆到pET32a中.重组质粒经PCR、酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌(E.coli)BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性.用纯化的蛋白进行鼻咽癌患者血清学检测.结果:重组表达质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为40 ku.以此为抗原能在鼻咽癌患者血清中检测到特异性的抗体.结论:成功获得了LMP2A胞外区重组基因表达的蛋白,纯化的蛋白可用于EBV相关鼻咽癌患者的血清学检测.
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表达EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)的小鼠移植瘤模型的建立
目的:建立表达EB病毒LMP2A小鼠移植瘤模型,为树突状细胞治疗EB病毒相关肿瘤的动物试验奠定基础.方法:将EB病毒LMP2A基因克隆至逆转录质粒pLXSN中,重组质粒用脂质体Clonfectin转入BALB/c小鼠来源的骨髓瘤细胞SP2/0,经G418筛选获得阳性克隆,亚克隆得到EB病毒LMP2A表达株并经PCR、RT-PCR、IFA、流式细胞仪鉴定.腹股沟皮下接种该细胞入BALB/c小鼠得到移植瘤模型,两周后切除肿瘤组织并作苏木精-伊红(H-E)染色切片.结果:构建出含EB病毒LMP2A基因的重组逆转录质粒,获得表达EB病毒LMP2A的SP2/0细胞,该细胞在BALB/c小鼠可生长成肿块.结论:成功地构建表达EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)的小鼠移植瘤模型.
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EB病毒融合基因重组腺病毒表达载体的构建
目的 构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体.方法 逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸(spliced overlap exetension,SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接,构建融合基因Z2A.将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV 质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A.经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A.结果 重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达.结论 本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础.
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EBV LMP2A对胃癌细胞生物学特性的影响
[目的]探讨EBV LMP2A基因对人胃癌细胞生物学特性的影响.[方法]用包含LMP2A基因的逆转录病毒载体转染人胃癌细胞株(SGC7901),QRT-PCR检测LMP2A基因的表达,CCK8检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞凋亡；划痕试验和transwell检测细胞迁移能力；克隆形成试验检测细胞成瘤能力.[结果]LMP2A基因转染的胃癌细胞生长速度增快、凋亡减少、迁移能力增强,在平板和软琼脂中集落形成能力增强.[结论]LMP2A基因能明显增强胃癌细胞的恶性生物学行为.
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LMP2A、AnnexinA2、Rad52、Gli1在鼻咽癌中的表达及其与肿瘤恶性程度的相关性
目的:鼻咽癌中LMP2A、AnnexinA2、Rad52、Gli1的表达及其与肿瘤恶性程度的相关性.方法:选择在本院经纤维鼻咽镜下活组织证实为鼻咽癌以及轻度慢性鼻炎黏膜炎症的组织,抽提组织中的RNA后采用荧光定量PCR试剂盒检测LMP2A、AnnexinA2、Rad52、Gli1以及上皮间质转化基因、细胞周期基因的表达量.结果:鼻咽癌病灶中LMP2A、AnnexinA2、Rad52、Gli1的mRNA表达量显著高于鼻炎黏膜炎症病灶且临床分期越晚,鼻咽癌病灶中LMP2A、AnnexinA2、Rad52、Gli1的mRNA表达量越高;鼻咽癌病灶中E-cadherin的mRNA表达量显著低于鼻炎黏膜炎症病灶且与与LMP2A、Gli1呈负相关,N-cadherin、Vimentin、ZEB2的mRNA表达量显著高于鼻炎黏膜炎症病灶且与与LMP2A、Gli1呈正相关;鼻咽癌病灶中CyclinD1、CyclinE、PCNA的mRNA表达量显著高于鼻炎黏膜炎症病灶且与AnnexinA2、Rad52呈正相关.结论:鼻咽癌中LMP2A、AnnexinA2、Rad52、Gli1的高表达能够促进癌细胞的上皮间质转化及细胞周期的进程.
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EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定
目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因, 并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A, 转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株.方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中, 与两辅助病毒载体PHIT456、 PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T, 测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929, 经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆, 用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况.结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×10~8 cfu/L, 感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A.结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础, 也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路.
