首页 > 文献资料
-
EB病毒LMP2A和EB病毒BZLF1融合基因反转录病毒表达载体的构建
目的:将LMP2A和BZLF1基因进行融合同时可发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用,协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞.实验拟构建含EB病毒潜伏膜蛋白2A编码基因和即刻早期基因融合基因的反转录病毒表达载体,并筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法:实验于2006-08/2007-08在济宁医学院微生物教研室和青岛大学医学院微生物教研室进行.应用反转录-聚合酶链反应分别获得潜伏膜蛋白2A和即刻早期基因编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A.将融合基因Z2A定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-Z2A,脂质体法将pMSCVpuro-Z2A转染反转录病毒包装细胞PT67.嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实Z2A正确插入逆转录病毒表达载体,筛选获得了稳定产毒的嘌呤霉素抗性细胞克隆,收获病毒的滴度为7.8×106 CFU/L,且重组逆转录病毒在PT67细胞能有效转录.结论:携带Z2A基因的重组反转录病毒表达载体pMSCVpuro-Z2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组反转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Z2A的产毒细胞系PT67-Z2A.
-
EBV融合基因Z2A腺病毒的制备及其在诱导EBV阳性细胞凋亡的应用
目的:构建EB病毒基因LMP2A及BZLF1的融合基因(Z2A)重组腺病毒表达载体,探讨Z2A融合蛋白对EBV+细胞凋亡的作用.方法:利用AdEasy系统构建重组腺病毒载体pAd-Z2A,而后将之转染293细胞(人胚肾细胞)产生重组腺病毒rAd-Z2A.后者用于感染EBV阳性及阴性细胞,RT-PCR、Westem-blotting检测Z2A的mRNA和蛋白表达,以及流式细胞术检测其对EBV阳性细胞凋亡的调控.结果:序列测定和酶切实验均证实,Z2A融合基因正确插入穿梭质粒,并成功获得重组腺病毒表达载体pAd-Z2A及重组腺病毒rAd-Z2A.感染rAd-Z2A的NEC靶细胞检测到Z2A的表达.流式细胞术检测发现,与EBV-细胞组及EBV+空白质粒转染组相比,接种rA1-z2A的EBV+细胞组48h(P＜0.05)凋亡细胞显著增多,72h时细胞近乎全部凋亡(P＜0.01).结论:重组腺病毒rAd-Z2A可有效感染EBV+及EBV-细胞,从而显著促进EBV+细胞凋亡而不影响EBV-细胞,为进一步特异性靶向EBV+肿瘤的基因治疗奠定基础.
-
EB病毒融合基因重组腺病毒表达载体的构建
目的 构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体.方法 逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸(spliced overlap exetension,SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接,构建融合基因Z2A.将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV 质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A.经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A.结果 重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达.结论 本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础.
-
EB病毒感染诱导Akata的c-fos及BZLF1基因的短暂表达
目的 研究EB病毒感染对EB病毒阴性的Burkitt'S淋巴瘤细胞株Akata的B细胞早早期癌前基因c-fos及病毒激活的关键转录因子BZLF1的表达的影响.方法 应用EB病毒(来源于EB病毒阳性Akata/GFP.EBV.c18)感染EB病毒阴性的Burkitt'S淋巴瘤细胞株Akata,使用RT-PCR和蛋白质印迹技术分别检测EB病毒感染不同时间后细胞c-fos和EB病毒的BZLF1的表达. 结果 EB病毒感染Akata后30min到3 h期间c-fos的表达明显增加,随后恢复正常;EB病毒感染后1.5 h到48 h的BZLF1的短暂表达,随后消失;而且EB病毒感染后6 h到12 h BZLF1蛋白也有短暂表达.随后消失. 结论 EB病毒感染能诱导Akata的B细胞c-fos及随后的BZLF1的短暂表达.
关键词： EB病毒 Burkitt's淋巴瘤 c-fos BZLF1 Akata细胞 -
EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建
目的 构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体.方法 逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A.将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A.经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A.结果 重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达.结论 本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础.
