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鼻咽癌特异性减毒重组疫苗 Lmdd-LMP2 A 的构建及其抑瘤效应的研究
目的：构建含有EB病毒潜伏膜蛋白2A（LMP2A）的减毒单核增生性李斯特菌重组疫苗（Lmdd-LMP2A），并检测其抑瘤效应，旨在为鼻咽癌的免疫治疗提供新的思路及理论依据。方法将EBV-LMP2A基因克隆入李斯特菌穿梭载体p1565中，再将重组穿梭载体p1565-LMP2A电转化至减毒单核增生性李斯特菌株Lmdd感受态细胞中，得到重组疫苗Lmdd-LMP2A。进而对HLA-A2转基因小鼠皮下接种CNE-1／HLA-A2／LMP2A鼻咽癌细胞株，建立皮下荷瘤鼠模型。利用尾静脉注射法接种李斯特菌疫苗免疫荷瘤鼠并检测其特异性CTL诱导情况及抑瘤效应。结果成功构建了重组减毒李斯特菌鼻咽癌疫苗Lmdd-LMP2A，该疫苗高度减毒，安全性较好且稳定表达LMP2A蛋白并诱导特异性T细胞免疫应答。荷瘤鼠抑瘤模型结果表明，与对照组相比，Lmdd-LMP2A能明显的抑制肿瘤生长。并且，Lmdd-LMP2A免疫组也能延长小鼠的荷瘤生存期，均显示了该种重组疫苗的有效抑瘤价值。结论成功构建的减毒重组李斯特菌疫苗Lmdd-LMP2A，可以在确保安全性的同时发挥良好的特异性抗肿瘤效应，对于肿瘤治疗具有潜在的临床意义。
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CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的:构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A (LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV+)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组.采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒.设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC).采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV+肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学.结果:酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体plRES2-CSF2A.转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达.MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P＜0.05或P＜0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体.pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV+肿瘤细胞48 h时凋亡细胞明显增多.结论:重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV+ CNE2细胞增殖且促进其凋亡.
关键词： 潜伏膜蛋白2A 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 融合基因 真核表达载体 -
慢病毒介导RNAi下调LMP2A基因表达抑制EB病毒相关胃癌细胞的体外生长
背景:EB病毒(EBV)与多种人类肿瘤,如Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌等上皮性肿瘤相关.病毒编码的潜伏膜蛋白2A(LMP2A)存在于部分EBV相关胃癌(EBVaGC)中,与肿瘤发生、发展密切相关.目的:应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术抑制LMP2A基因表达,探讨下调LMP2A对EBVaGC细胞体外生长的影响.方法:构建慢病毒载体pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV和阴性对照载体并转染EBVaGC细胞株GT38,以real-time PCR和蛋白质印迹法检测慢病毒载体的抑制效率,CCK-8实验、克隆形成实验和流式细胞术检测GT38细胞的细胞生长、细胞周期和细胞凋亡.结果:GT38细胞转染LMP2A-shRNA-LV后,LMP2A mRNA和蛋白表达分别下调65.4%和50.8%,进而导致细胞体外增殖受抑,克隆形成能力降低,G0/G1期细胞比例增加,细胞凋亡率增高,与转染阴性对照慢病毒载体和未予转染慢病毒的GT38细胞相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:慢病毒介导的RNAi技术能高效抑制LMP2A基因表达,进而抑制EBVaGC细胞的体外生长,诱导G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡.LMP2A可作为EBVaGC基因治疗的潜在靶点.
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EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响
目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖、迁移、侵袭的影响.方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切、测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91、pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验、Transwell 侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响.结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR、Western blot、免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力.结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖、迁移、侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础.
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EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析
目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性.方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化.制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性.结果通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析.结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础.
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EBV-LMP2A和β-catenin蛋白在鼻咽癌中的表达关系及意义
目的 探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)和β-连环素(β-catenin)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中的表达关系及其临床意义.方法 应用免疫组化SP法检测LMP2A和β-catenin蛋白在32例鼻咽黏膜慢性炎、56例NPC和18例NPC淋巴结转移灶中的表达,采用Westem blot法和免疫荧光细胞化学染色法观察LMP2A和β-catenin蛋白在CNE2-LMP2A细胞及其对照组CNE2-Vector和CNE2细胞中的表达.结果 (1)LMP2A在NPC及其淋巴结转移灶中的阳性率分别为89.3％ (50/56)和77.8％(14/18),均明显高于鼻咽黏膜慢性炎(37.5％,12/32)(P均＜0.01);β-catenin在NPC及其淋巴结转移灶中的异常表达率分别为62.5％ (35/56)和83.3％(15/18),均明显高于鼻咽黏膜慢性炎(3.1％,1/32)(P均＜0.01);LMP2A与β-catenin正常表达呈负相关(rs=-0.391,P ＜0.01);LMP2A和β-catenin蛋白在鼻咽癌T分期、N分期和临床分期组间表达率的差异均有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01).(2)CNE2-LMP2A细胞中β-catenin蛋白表达水平明显高于CNE2-Vector和CNE2细胞;CNE2-LMP2A细胞中β-catenin胞质和胞核的表达水平明显高于CNE2-Vector和CNE2(P均＜0.01).结论 LMP2A高表达和β-catenin异常表达与鼻咽癌临床生物学行为进展密切相关,其机制可能与LMP2A上调β-catenin蛋白水平并促进其核转位有关.
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鼻咽癌患者血清抗EB病毒潜伏膜蛋白2A抗体的检测及其临床意义
目的:检测鼻咽癌患者血清抗EB病毒潜伏膜蛋白2A抗体并探讨其临床意义.方法:以重组质粒pET28a表达的EB病毒潜伏膜蛋白2A重组表位蛋白为检测抗原,ELISA和Western blot 检测正常人和鼻咽癌患者血清抗EBV-LMP2A抗体.结果:ELISA检测鼻咽癌患者和正常人血清抗EBV-LMP2A抗体水平分别为0.966±0.127、0.425±0.103,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01);Western blot检测二者的抗体水平比较差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:鼻咽癌患者血清EBV-LMP2A抗体表达显著高于正常对照,可能与鼻咽癌的发生有关,可作为鼻咽癌的辅助诊断指标.
关键词： 鼻咽癌 Epstain-Barr病毒 潜伏膜蛋白2A 抗体 检测 -
EB病毒编码的潜伏膜蛋白2A在鼻咽癌中的研究进展
鼻咽癌是我国南方和东南亚地区常见的头颈部恶性肿瘤,其发病与EB病毒(EBV)感染关系密切.EBV属于人类γ疱疹病毒,广泛分布于全球,感染人群后,大多数成为无症状病毒携带者(即潜伏感染).EBV主要编码潜伏膜蛋白1(LMP1)和LMP2、EB病毒核抗原1(EBNA1)和EB病毒编码的小RNA(EBERs)[1,2].LMP1为病毒癌基因,通过激活NF-κB、AP-1和JNK/STAT传导通路而致瘤;然而,有研究表明LMP1在伴和不伴有淋巴结转移的鼻咽癌组织中表达率无统计学意义,提示LMP1阳性表达与鼻咽癌淋巴结转移无相关性.
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LMP2A、E-Cadherin和fibronectin在鼻咽癌中的表达及其临床意义
目的:探讨EBV编码的潜伏膜蛋白2A(LMP2A)与上皮-间质转化(EMT)标志物E-钙粘素(E-Cadherin)和纤维连接蛋白在鼻咽癌(NPC)中的表达及与临床病理学参数的关系.方法:采用免疫组织化学SP法检测LMP2A、E-Cadherin和fibronectin蛋白在32例鼻咽黏膜慢性炎、56例NPC和18例NPC淋巴结转移灶中的表达.结果:①LMP2A在NPC及其淋巴结转移灶中的阳性表达率分别为89.3％(50/56)和77.8％(14/18),均明显高于鼻咽黏膜慢性炎(37.5％,12/32)(均P＜0.01);E Cadherin在NPC及其淋巴结转移灶中的正常表达率分别为33.9％(19/56)和5.6％(1/18),均明显低于鼻咽黏膜慢性炎(90.6％,29/32)(均P＜0.01);fibronectin在NPC及其淋巴结转移灶中的阳性表达率分别为83.9％(47/56)和72.2％(13/18),均明显高于鼻咽黏膜慢性炎(28.1％,9/32)(均P＜0.01).②NPC中LMP2A与E-Cadherin正常表达呈负相关(r=-0.387,P＜0.01)、与fibronectin表达呈正相关(r=0.421,P＜0.01).③LMP2A、E-Cadherin和fibronectin表达与NPC患者N分期和临床分期密切相关(均P＜0.05),与M分期无相关性(P＞0.05);LMP2A、E-Cadherin表达与T分期也密切相关(均P＜0.01).结论:LMP2A、fibronectin在NPC中表达升高,而E-Cadherin正常表达则降低;LMP2A可能通过下调E-Cadherin和上调fibronectin表达来介导EMT促进NPC淋巴结转移和恶性进展.
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EB病毒LMP2A在鼻咽癌患者肿瘤组织中的表达及意义
目的:观察EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)在鼻咽癌(NPC)患者肿瘤组织中的表达,探讨采用LMP2A作为靶抗原进行NPC免疫治疗的可行性.方法:采用SP免疫组织化学方法,检测40例NPC组织及38例鼻咽黏膜慢性炎症组织标本LMP2A的表达.结果:40例NPC标本中36例LMP2A表达阳性(90.0%);LMP2A的表达与NPC病理分化程度无明显相关性.38例鼻咽黏膜慢性炎症组织标本中33例LMP2A阴性反应,5例阳性反应.鼻咽黏膜慢性炎组织与NPC组织中LMP2A阳性表达率间差异存在统计学意义.结论:在不同病理分化程度的NPC肿瘤组织中LMP2A均可广泛表达,在正常鼻咽组织细胞中基本不表达.采用LMP2A作为靶抗原诱导机体特异性细胞免疫反应杀伤NPC肿瘤细胞具一定可行性.
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鼻咽癌组织中ZEB2、AnnexinA2、LMP2A的表达及其与预后情况 、恶性分子的相关性
目的:研究鼻咽癌组织中ZEB2、膜联蛋白A2(AnnexinA2)、潜伏膜蛋白2A(LM P2A)的表达及其与预后情况 、恶性分子的相关性.方法:选择2015年3月 ～2018年2月期间在徐汇区大华医院进行纤维鼻咽镜下局部组织活检的患者作为研究对象,根据活检后的病理学结果将符合鼻咽癌诊断的患者纳入鼻咽癌组 、符合鼻黏膜炎症的患者纳入研究的对照组.收集活检组织并检测ZEB2、AnnexinA2、LMP2A以及增殖 、侵袭相关恶性分子的mRNA表达量.结果:鼻咽癌组肿瘤组织中ZEB2、Annexi-nA2、LMP2A、β-catenin、CyclinD1、iASPP、N-cadherin、PARP-1、MM P9的mRNA表达量显著高于对照组的鼻炎黏膜组织,RASSF1A、p21WAF1、E-cadherin、IFR5、TIMP1的mRNA表达量显著低于对照组的鼻炎黏膜组织;鼻咽癌组肿瘤组织中ZEB2、AnnexinA2、LMP2A的mRNA表达量与 β-catenin、CyclinD1、iASPP、N-cadherin、PARP-1、MM P9呈正相关,与RASSF1A、p21WAF1、E-cadherin、IFR5、TIM P1呈负相关.结论:鼻咽癌组织中ZEB2、AnnexinA2、LMP2A的高表达与肿瘤分期及恶性分子表达的改变密切相关.
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EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建
目的 构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体.方法 逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A.将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A.经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A.结果 重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达.结论 本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础.
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EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立
目的 构建含EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-2A,脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67.嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达.结果 限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体;筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆;收获病毒的滴度为3.2×107 CFU/L,且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录.结论 携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A.
