重型乙型肝炎外周血单核细胞基因表达谱研究

目的应用基因芯片技术建立慢性重型乙型肝炎外周血单核细胞基因表达谱.方法应用含8192条人体c D N A的微阵列芯片和来自外周血单核细胞的标记cDNA,分析了10例慢性重型乙型肝炎和10例无症状HBsAg携带者(ASC)基因表达谱.通过应用GenePix 4000B扫描仪和ImaGene3.0分析软件比较Cy5标记的慢性重型肝炎来源cDNA与Cy3标记的ASC来源cDNA的杂交结果,获得个体基因的相对表达比值.结果在8192个基因中,初筛出2 4 9个(3%)表达差异达2倍以上的基因,其中主要是细胞信号和传递,细胞周期和代谢,凋亡及炎症相关类基因(占79%).结论这些结果提示了乙型肝炎病毒感染机体致慢性重型肝炎过程中,全面改变了宿主细胞内基因表达,并为进一步对这些差异表达基因的功能研究提供了一个框架.

脱氧核酶对丙型肝炎病毒RNA的剪切活性

目的观察丙型肝炎病毒(HCV)RNA特异性脱氧核酶的体外剪切活性,探讨其用于抗病毒基因调控的可能性.方法以HCV 5-非编码区及部分C区(5'-NCR-C)中两个具有5'…A ↓ U…3'特征的序列为靶位,以5'GGCTAGCTACAACGA 3'为活性中心,设计并合成两端经硫代修饰的脱氧核酶(TDRz),即TDRz-127和TDRzl.用Nar I将质粒pHCV-neo完全线性化后,以之为模板体外转录获取HCV 5'-NCR-C;用碱性磷酸酶去除其5'端磷酸,再用T4聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP进行5'端放射性标记.在pH7.5、Mg2+10 mmol/L等条件下,将两种TDRz分别(5μmol/L)或共同(各2.5μmol/L)与底物RNA(200 nmol/L)混合,经变性、复性后于3 7℃孵育,分别于不同的时间点取出等份终止反应.以8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分离、显示剪切产物,在凝胶成像分析仪上分析各条带光密度值并计算剪切百分率.结果在所设常用反应条件下于 37℃孵育15、30、45、60、75、90min后,TDRz-127的剪切百分率分别达8.3%、16.1%、24.3%、26.2%、29.4%和31.1%,TDRzl的剪切百分率分别达7.4%、13.0%、15.6%、18.7%、19.4%和20.3%,两者同时剪切时的百分率约15.1%、29.6%、37.8%、39.1%、41.5%、42.6%.结论TDRZ-127和TDRzl对HCV 5'NCR-C的剪切百分率随时间延长而升高,两者联合剪切优于单独剪切的效果.

低密度脂蛋白受体的研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)受体的研究,主要集中在CD81分子和低密度脂蛋白受体(low density li-poprotein-receptor,LDL-R)两种穿膜蛋白分子上[1].近的研究表明,LDL-R可能是H CV感染肝细胞的受体候选分子[2].

肝干细胞

1958年Wilson和Leduc在研究小鼠营养性肝损伤的修复机制中发现,增殖的毛细胆管细胞(终末胆管细胞)具有干细胞样特性,可分化为肝细胞及胆管细胞,于是首次提出原始肝脏细胞的概念.

树鼩实验性肝癌发生过程p53基因的变化

目的探讨由人乙型肝炎病毒(HBV)和黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发的树鼩肝细胞癌变过程,p53基因的表达及变化.方法将树鼩分为四组:A组:HBV+AFB1,B组:只感染HBV;C组:只摄入AFB1;D组:作空白对照.定期肝活检,用免疫组织化学、分子生物学等技术对实验树鼩肝及肿瘤组织进行检测.结果 (1)接受HBV及AFB1双因素的A组,肝细胞癌(HCC)发生率(66.7%)明显高于只接受HBV的B组或AFB1的C组(30%),而且HCC的平均发生时间也明显早于C组,(120.0±16.6)周与(153.3±5.8)周,t=3.336,P＜0.01.(2)在第75周前各组动物肝均未检出突变的p53蛋白.(3)105周时,A组p53蛋白表达率为78.6%,B组为60%,C组为71.4%,D组为10%(x2≥5.03,P＜0.05).在A、C组检出p53基因异常带.(4)树鼩肝癌p53基因突变点分别位于2 7 5、7 8及1 3密码子;其野生型p 5 3基因的核苷酸及氨基酸序列与人的p 5 3基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为91.7%、93.4%.结论再次证实HBV和AFB1有协同致肝癌作用;突变的p53蛋白出现于肝细胞发生癌变之前,p 5 3基因的突变促进了肝癌的发生和演进.HBV可能协同AFB1致p 5 3基因突变.

丙型肝炎病毒NS5A对p53活性调控机制研究

目的研究HCV NS5A对抑癌蛋白p5 3活性的抑制作用及其作用机制.方法采用荧光素酶报告基因系统观察pwwp-luc,pwwp-mut-luc,pC53-NS3及pCNS5A分别转染或共同转染HepG2、Huh7细胞的荧光素酶活性.应用凝胶滞留试验观察HCV NS5A是否影响p5 3与其特异DNA序列的结合.结果内源性p5 3能激活p21启动子转录功能,使荧光素酶活性明显增加(3.49×105与0.60×105,t=5.92,P＜0.01).外源性p 5 3也能激活p21启动子转录功能,荧光素酶活性为5.6 3×105,与对照组(0.47×105)比较差异具有显著性(t=10.12,P＜0.01).HCV NS5A能抑制内源性和外源性p5 3对p21启动子的激活作用,并呈剂量依赖性(F≥20.71,P＜0.01).凝胶滞留试验显示HCV NS5A能阻碍p5 3与其特异DNA序列的结合.结论HCV NS5A能抑制p5 3的反式激活功能使其目的基因p21启动子的转录功能下降,其机制是HCV NS5A能阻碍p 5 3与其特异DNA序列的结合.

树突状细胞与肝癌的免疫治疗

近20年来通过对树突状细胞(dendriuc cells,DC)的研究,学者们逐渐认识到DC是目前发现的功能强的抗原提呈细胞,DC是启动、调控、并维持免疫应答的中心环节.

乙型肝炎病毒核心抗原与前S1抗原融合蛋白诱导小鼠免疫反应的实验研究

采用基因重组技术表达了去除C末端的HBV核心抗原和前S1抗原融合蛋白,经免疫印迹试验表明其具有特异抗原反应性[1].进一步用该融合抗原免疫BALB/C小鼠,观察其诱导小鼠特异性体液免疫产生情况.

应用抑制性消减杂交方法克隆人肝细胞癌差异表达基因

Diatchenko等[1]报道了一种新的快速克隆差异表达基因cDNA的方法,称为抑制性消减杂交(SSH),十分适用于克隆造成某种特殊细胞表型的特异表达基因,例如正常和病变之间的基因表达差异分析.人肝细胞癌(HCC)是我国高发的恶性肿瘤之一,其发生发展与多种基因的突变与表达异常有关.我们应用抑制性消减杂交方法克隆HCC与癌旁非癌组织之间差异表达基因的cDNA,为今后获得HCC疾病易感基因及其功能研究奠定实验基础.

奥曲肽治疗食管胃底静脉曲张出血的疗效观察

以垂体后叶素作对照进一步观察奥曲肽对食管胃底静脉曲张(EVB)的临床疗效及其治疗时血胰高糖素、一氧化氮(NO)的变化规律,以期为临床合理应用奥曲肽提供理论依据.

胰高糖素负荷试验的血糖P-B值用于评价肝硬化患者肝功能状况的价值

肝硬化患者胰高糖素负荷后的血糖反应能力减弱,且随着肝硬化患者病情严重程度的增加而减弱[1],血糖峰值浓度与基础浓度之差(血糖P-B值,BGP-B)与肝硬化患者的肝功能状况密切相关[2].胰高糖素负荷试验(GLT)的血糖P-B值可能用于评价肝硬化患者的肝功能状况,我们对此进行了研究.

实验性肝纤维化大鼠Ⅳ型胶原酶的表达

肝纤维化是以胶原为中心的细胞外基质(ECM)在肝脏异常的沉积.这种异常的沉积,更大程度是由于降解的绝对或相对减少而引起的.肝纤维化时,在ECM降解过程中起主导作用是基质金属蛋白酶(MMPs).Ⅳ型胶原酶(MMP-2)是特异性Ⅳ型胶原降解酶,与肝纤维化的形成有关.现以四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型,采用northern印迹杂交,明胶酶谱法(zy-mography)等技术,对肝纤维化大鼠进行系统、动态观察,探讨肝纤维过程中MMP-2基因及蛋白表达规律.

肝硬化腹水发生机制

一、腹水发生的学说肝硬化腹水发生的机制尚未完全阐明,目前主要有以下几种学说.

顽固性腹水的治疗

顽固性腹水又称难治性腹水,是指患者经正规利尿剂治疗6周、腹水仍无明显消退或加重的一种腹水状态.它是肝病晚期常见的严重并发症之一.

肝硬化腹水的诊断及鉴别诊断

正常腹腔内有少量液体,通常在100～200ml以内.肝硬化腹水大多隐匿出现,也可突然发生.少量腹水无明显症状和体征,当腹水量增多时可有腹胀、腹围增大和腹部膨隆.腹水量在1 000ml以上时,可出现移动性浊音.

p38信号转导途径对离体肝脏缺血再灌注损伤的影响

目的研究离体肝脏缺血再灌注期间p38信号转导途径的激活对其损伤程度的影响.方法通过自行建立的兔离体盯脏缺血再灌注模型,将一定剂量的特异性p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190加入到保存液中,根据原位灌注液及保存液中加入SB202190的剂量再将离体肝分为A、B、C、D 4组.分别于冷保存前、冷保存未及再灌注5、10、15、30、60、120 min获取离体肝组织及受体兔静脉血液标本.分别应用免疫印迹杂交和免疫沉淀法测定离体肝组织磷酸化p 3 8MAPK的活性.用全自动生化分析仪测定离体兔肝功酶学含量;并测定再灌注120 min内的胆汁分泌总量.结果在正常肝组织中p38 MAPK即有一定的基础活性;经冷保存后有一定的升高,再灌注10 min时达到峰值,然后逐渐下降,至再灌注120 min时降低至正常水平;而在冷保存液中加入SB202190后,再灌注期间p38 MAPK的活性受到显著性抑制,其中B、C、D组p38 MAPK活性峰值仅分别为A组的5 3.9%,12.8%,9.6%;再灌注期间各组受体肝酶学水平均表现为A＞B＞C＞D,而胆汁分泌量表现为A＜B＜C＜D,且任意两组间差异均有显著胜.结论冷保存液中加入SB2021 90后离体肝再灌注期间p38 MAPK活性受到显著性抑制,而且能够使离体肝于缺血再灌注期间损伤程度明显降低,从而提示缺血再灌注期间p 3 8信号转导途径的激活与离体肝损伤密切相关,p 3 8信号转导途径的激活可能是导致离体肝缺血再灌注损伤的重要机制之一.

丝裂原激活蛋白激酶信号通路在肝脏缺血预处理细胞保护效应中的作用

目的研究p44/42丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路在肝脏缺血预处理细胞保护效应中的作用.方法建立体内和体外肝脏缺血预处理模型,应用蛋白激酶C(PKC)抑制剂和MAPK抑制剂,通过检测p44/42MAPK磷酸化水平,细胞活力,血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性变化,同时观察光镜细胞形态学损害,对相关数据进行统计学处理. 结果体内和体外的缺血预处理两部分实验都观察到相似的结果.和缺血再灌注组比较,预处理组的p44/42 MAPK磷酸化水平显著增高,肝细胞结构损伤改变较小,血清ALT、AST水平显著降低,缺血再灌注组的ALT、AST水平分别为(762.8±130.5)U/L和(820.9±111.3)U/L,预处理组的ALT、AST水平分别为(281.0±35.6)U/L和(407.7±73.7)U/L;和缺血预处理组相比,PK C抑制剂组和丝裂原蛋白激酶(MEK)抑制剂组相应的观察指标呈相反的变化,p44/42 MAPK磷酸化激活显著减少,肝组织细胞结构出现较明显的损伤改变,血清A LT、AST水平显著升高,PK C抑制剂组和MEK抑制剂组的ALT、AST水平分别为(645.61±90.4)U/L、(678.6±136.5)U/L和(466.2±82.8)U/L、(732.9±91.1)U/L.结论肝脏缺血预处理细胞保护作用中,p44/42 MAPK通路起到至关重要的作用.

中华肝脏病杂志影响因子在内科医学类列第4位

2003年中青年肝病科研论文奖及课题基金开始申报

拉米夫定治疗活动性肝炎肝硬化的疗效观察

目的观察活动性肝炎肝硬化患者拉米夫定长程治疗的疗效及对停药后肝功能异常的对策探讨.方法口服拉米夫定100 mg,每日一次,连服18个月治疗活动性肝炎肝硬化患者5 8例.观察治疗前后的临床症状体征、生化指标、病毒学改变情况、停药后情况及对策探讨.结果(1)3 5例(74.5%)患者治疗后病情缓解稳定,生活质量改善;child-pugh积分下降;肝功恢复正常或好转.(2)HBV DNA下降＞103拷贝/ml; HBeAg阴转率达3 3.3%(13/39).(3)10例停药后,在3～6个月随访期间肝炎复发再次住院.停药后肝功能异常的治疗:2例用干扰素治疗1个月后出现黄疸、肝损害加重,立即停药保肝处理后缓解;8例患者未加任何抗病毒药物,经加强保肝、调节免疫等治疗后,肝功能得到改善.结论乙型肝炎后肝硬化患者伴有活动性病毒复制及肝炎时,长程拉米夫定治疗可改善肝功能,阻止病情进展,提高生活质量;停拉米夫定后肝炎活动不宜应用干扰素治疗.

基因芯片检测拉米夫定治疗后乙型肝炎病毒变异

拉米夫定是一种对乙型肝炎病毒(HBV)DNA复制有很强抑制作用的核苷类似物,目前已广泛应用于临床,但其会引起HBV DNA聚合酶活性区发生变异(YMDD变异),而影响其治疗效果或加重病情.

定量检测慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒DNA的临床价值

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者肝内乙型肝炎病毒(HBV)DNA载量与血清HBV DNA、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)水平的相关性及其在抗病毒治疗中的意义.方法41例HBeAg阳性CHB患者,在干扰素α和拉米夫定联合治疗前进行肝穿刺,取肝组织分别进行HBV DNA检测及组织学检查,据肝组织HBVDNA载量小于等于或大于104fg/cm3将其分为两组,治疗前及治疗期间监测其肝功能、血清HBeAg及HBV DNA情况.结果(1)肝组织HBV DNA载量高于血清HBV DNA载量(对数值:4.081±1.127与3.163±1.010,t=2.218,P＜0.05),二者高度相关(r=0.840,t=4.322,P＜0.001);肝组织HBV DNA载量与血清HBeAg亦呈正相关(r=0.459,t=3.056,P＜0.005).(2)肝组织HBV DNA载量与肝组织炎症活动度呈反向关系(x2=3.874,P＜0.05).(3)治疗期间两组患者血清HBV DNA水平均明显下降,治疗前肝组织HBV DNA水平低者效果较好;治疗1年时HBeAg、抗-HBe血清转化率以肝组织HBV DNA水平低者为高(HBeAg转阴率68.4%与36.4%,x2=4.194,P＜0.05;抗-HBe阳转率73.7%与40.9%,x2=4.447,P＜0.05).结论肝组织HBV DNA水平较血清HBV DNA、HBeAg水平更能准确反映肝组织HBV DNA复制情况,且能间接反映机体的免疫状态,可作为抗病毒治疗适应证选择及疗效预测因子.

肝癌细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因表达的研究

目的研究MA GE、GAGE、BAGE基因在肝癌细胞株中的表达情况,评价这些肿瘤特异性抗原作为肿瘤分子标记以及肿瘤免疫治疗特异性靶位的可能性.方法用RT-PCR检测国内建株的肝癌细胞株SMMC-7721、QQY-7701、BEL-7402中MAGE-1、MAGE-3、GAGE1-8、GAGE1-2和BAGE基因mRNA的表达,以GAPDH基因作为检测内对照,并与非肿瘤肝穿组织比较.结果肝癌细胞株SMMC-7721表达MAGE-1和BAGE基因; QQY-7701表达MAGE-3和BAGE基因; BEL-7402表达MAGE-1和GAGE1-2基因; 3株肝癌细胞至少表达其中一个基因.肝硬化病人肝穿刺组织中MAGE、GAGE、BAGE基因表达均为阴性.结论MAGE、GAGE、B A G E肿瘤特异性抗原可以作为肝癌早期诊断的分子标记,并具有作为肝癌免疫治疗特异性靶位的潜在价值.

树突状细胞负载肝癌相关抗原后成熟调控的研究

目的研究树突状细胞(DC)负载肝癌相关抗原后的成熟调控.方法用SDS-PAGE制备电泳纯化牛结核分枝杆菌热休克蛋白70,用其诱导DC的分化与成熟.结果DC负载肝癌可溶性抗原后,10%细胞失去了DC特征,同时其表面CD 54(90.0%)、CD 83(78.0%)、CD 86(85.0%)分子表达下降;牛分枝杆菌卡介苗-热休克蛋白70(BCG HSP70)的活化有利于负载肝癌可溶性抗原后的DC维持其特异性标志,同时DC表面CD 54(92.0%)、CD83(90.0%)、CD86(91.0%)分子表达增加,DC诱导同种异体淋巴细胞转化的能力增加,淋巴细胞增殖加快,从而促进DC成熟,增加其抗原呈递能力.结论预示BCG HSP70有可能成为促进DC活化和成熟的另一重要分子.

树突状细胞和巨噬细胞对肝癌细胞抗原的提呈作用

目的比较同一个体来源的树突状细胞(D C)和巨噬细胞(Mφ)对肝癌细胞抗原的提呈作用.方法从同一健康外周血中分离出单核细胞,在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(G M-CSF)联合白细胞介素-4(IL-4)或单独在GM-CSF的作用下,分别诱导出DC和Mφ;DC或Mφ与自体淋巴细胞和肝癌细胞抗原共培养5 d,结束培养前1 2 h加入37 kBq/孔(1 μci=37 kBq)3H-胸腺嘧啶,收获细胞,用液体闪烁计数仪测定增殖效应(cmp值).结果接触肝癌细胞抗原的DC和Mφ都具有显著地刺激自体淋巴细胞增殖的能力,而以DC的刺激能力更为明显.加20μl/ml抗原时刺激效应明显,DC组、Mφ组和淋巴细胞组的cpm值分别是119 50.3±1 621.8、8 708.5±176.1和402.5±43.1.结论同一个体来源的DC的抗原提呈能力明显强于Mφ.

肿瘤特异性肿瘤/睾丸抗原在肝癌组织中的表达

目的研究7种主要肿瘤/睾丸(CT)抗原MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10、NY-ESO-1、SSX-2、SCP-1在原发性肝细胞癌(H C C)患者癌组织中的表达、编码基因的变异状况及与临床指标的关系.方法收集30例肝癌患者的癌和癌旁组织,采用特异性引物逆转录聚合酶链反应检测7种CT抗原的表达,并对PCR产物进行测序分析.结果在30例HCC患者中,MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10、NY-ESO-1、SSX-2、SCP-1在癌组织中的表达率分别为66.7%、70.0%、20.0%、36.7%、40.0%、33.3%和33.3%,而癌旁没有表达.癌组织中至少表达1种、2种和3种CT抗原的阳性率分别为90.0%、70.0%和53.5%.我国肝癌表达的7种CT抗原编码基因与国外报道的相比,同源性非常高.MAGE-10和SCP-1的表达与甲胎蛋白的水平相关,MAGE-3和SSX-2表达与平均年龄相关.结论7种CT抗原在HCC患者癌组织中均有表达,阳性率为20.0%～70.0%,其编码基因序列高度保守.一些CT抗原的表达与临床指标存在相关性.

丝裂霉素诱导凋亡癌细胞致敏树突状细胞后的免疫应答

目的观察树突状细胞(D C)从丝裂霉素诱导的凋亡胆管癌细胞获取抗原后,抗肿瘤免疫应答及对胆管癌细胞的特异性免疫杀伤效果.方法用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)加IL-4从人外周血分化、诱导D C,丝裂霉素在体外诱导培养的人胆管癌细胞凋亡,将D C、T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞共培养,同时设计不同类型肿瘤细胞(坏死胆管癌细胞及培养胆管癌细胞)作对照,7 d后,分离、富集D C、T淋巴细胞进行免疫应答及肿瘤细胞杀伤试验.结果与凋亡胆管癌细胞共培养的D C可以有效提呈胆管癌细胞抗原,有强烈的免疫应答,刺激的细胞毒T淋巴细胞特异性地杀伤胆管癌细胞.结论丝裂霉素诱导凋亡癌细胞可以致敏rhGM-CSF加rhIL-4从人外周血单个核细胞诱导、扩增出的DC,并产生显著的杀伤胆管癌细胞的免疫反应,可望成为特异性免疫治疗肿瘤的一条新途径.