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凝血酶上调人肾小球系膜细胞PAI-1表达的细胞内信号转导研究
为探讨转录因子活化子蛋白1(AP-1)和相关的信号转导分子在凝血酶诱导人肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)表达中的作用,采用纤维蛋白平板法、Northern杂交、凝胶电泳阻滞实验(EMSA)和Western杂交方法,分别检测凝血酶刺激培养的人肾小球系膜细胞PAI-1蛋白质活性和mRNA表达情况,以及AP-1 DNA连接活性和AP-1组成蛋白质c-Jun、c-Fos量的变化.结果发现:①凝血酶呈浓度依赖性的方式促进肾小球系膜细胞PAI-1蛋白质活性和mRNA表达,其效应能被凝血酶的特异性拮抗剂水蛭素阻断;②凝血酶能明显促进转录因子AP-1的DNA连接活性;③curcumin、staurosporine和genistein均能在不同程度上抑制AP-1的DNA连接活性,并进而部分逆转凝血酶上调系膜细胞 PAI-1 mRNA表达的效应.研究表明,转录因子AP-1在凝血酶上调人肾小球系膜细胞PAI-1表达的信号转导过程中起着重要的作用,蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶可能是凝血酶介导系膜细胞AP-1活化及PAI-1 表达的上游信号.
关键词： 信号转递 原癌基因蛋白质c-jun类 纤溶酶原激活物抑制物1 凝血酶 -
钙信号在尾加压素-Ⅱ促血管平滑肌增殖中的作用
目的:探讨钙信号在尾加压素-Ⅱ(urotensin-Ⅱ,UⅡ)促血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖中的作用.方法:在离体培养的VSMC上,用流式细胞仪和3H-TdR参入的方法探讨UⅡ的促增殖效应;在离体孵育的大鼠主动脉平滑肌组织上观察UⅡ对平滑肌45Ca2+摄入的影响;应用激光共聚焦显微镜检测UⅡ作用后细胞内游离钙的改变.结果:UⅡ(10-9～10-7molL-1)浓度依赖地刺激VSMC的DNA合成,并诱导细胞由静止向增殖状态转化.与对照组相比10-8 mol*L-1 UⅡ使细胞的增殖指数[(G2-M+S)%]增加192%(P<0.01).钙通道阻断剂尼卡地平和Ca2+螯合剂EDTA均可阻断UⅡ对VSMC的促增殖效应,其中UⅡ(10-8 mol*L-1)与尼卡地平(10-5 mol*L-1)共同孵育的VSMC DNA合成量仅为单纯UⅡ(10-8 mol*L-1)组的59.0%. UⅡ(10-10～10-8 mol*L-1)可浓度依赖地使胸主动脉对45Ca2+的摄入增加,尼卡地平(10-5 mol*L-1)也可显著对抗UⅡ(10-8 mol*L-1)对45Ca2+摄入的诱导作用(P值均小于0.01).用激光共聚焦显微镜观察发现UⅡ作用后细胞内Ca2+浓度迅速升高,持续约3 min,形成钙波.结论: UⅡ可通过促进细胞Ca2+摄取和增加细胞内Ca2+浓度,发挥其促进VSMC增殖的作用.
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钙调神经磷酸酶介导碱性成纤维细胞生长因子诱导的大鼠心肌细胞肥大
目的:观察钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导心肌细胞肥大中的作用.方法:在原代培养的大鼠心肌细胞上,应用双波长荧光光度计检测心肌细胞游离Ca2+浓度;应用对硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate,PNPP)作底物测定CaN活性;根据3H-亮氨酸参入水平评估各种信号通路阻断剂对bFGF刺激的心肌细胞蛋白质合成速率的影响.结果:bFGF刺激心肌细胞24 h后,胞内游离Ca2+浓度较对照组增高272%(P＜0.01);同时,bFGF刺激的心肌细胞CaN活性较对照组增高173%(P＜0.01).bFGF(60μg·L-1)刺激的心肌细胞3H-亮氨酸参入较对照组增高106%(P＜0.01);CsA(0.1～10 μmol·L-1)可以浓度依赖的方式抑制bFGF刺激的心肌细胞3H-亮氨酸参入.此外H7(PKC抑制剂)和50 μmol·L-1PD98059(MAPK抑制剂)亦可完全阻断bFGF刺激的心肌细胞3H-亮氨酸参入.结论:Ca2+/CaN信号通路参与bFGF诱导心肌细胞肥大的信息传递.另外,丝裂素活化蛋白激酶及蛋白激酶C可能亦是bFGF刺激心肌细胞肥大的重要信号传递途径.
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睾酮对胰岛素敏感细胞胰岛素受体底物1和葡萄糖转运载体4表达的影响
目的探讨雄激素对胰岛素敏感性影响的可能的分子机制.方法诱导3T3-L1前脂肪细胞系和C2C12成肌细胞系分别分化为3T3-L1脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞,然后对这两种细胞分别以10-9mol/L睾酮处理4、8、12、24及48 h,并以不同浓度(10-12～10-5mol/L)的睾酮处理24 h,用Western印迹的方法检测两种细胞在以两种方法处理后胰岛素受体底物1(IRS-1)和葡萄糖转运载体4(GLUT4)表达的变化.结果随着10-9mol/L浓度的睾酮处理时间的延长,IRS-1和GLUT4在两种细胞的表达逐渐增加,IRS-1于12 h达峰后下降.3T3-L1脂肪细胞及C2C12骨骼肌细胞中12 h峰值分别是0 h对照的(1.42±0.42)倍和(1.53±0.14)倍,均P＜0.05;GLUT4于24 h达峰后表达下降[3T3-L1脂肪细胞及C2C12骨骼肌细胞中24h峰值分别是0 h的(3.22±0.10)倍和(5.17±1.06)倍,均P＜0.05].当睾酮处理浓度从10-12mol/L逐渐增加时,IRS-1在两种细胞的表达逐渐增加,于10-9mol/L达峰值后表达逐渐下降[在3T3-L1脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞,10-9mol/L睾酮处理后的峰值较空白对照分别增加(4.23±0.27)倍和(3.16±0.15)倍,均P＜0.05].GLUT4在C2C12骨骼肌细胞的表达随着睾酮浓度的升高有增加的趋势[经10-7mol/L睾酮处理后的表达量是空白对照的(2.99±0.15)倍,P＜0.05,于10-7mol/L后增加趋势不明显.在3T3-L1脂肪细胞中,GLUT4的表达于10-11mol/L达峰值[较空白对照增加(2.58±0.02)倍,P＜0.05],然后随着睾酮浓度的升高表达下降.结论睾酮影响胰岛素信号转导分子的表达存在剂量和时间上的双向作用.
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信号传导及转录活化因子3蛋白在小鼠胚胎肝脏发育中的表达
背景:信号传导及转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白广泛表达于不同类型的细胞和组织中,是重要的信号转导及转录级联成分,参与调控细胞的增殖分化等多种生理功能.但是在胚胎肝脏发育中是否有STAT3的表达,STAT3是否参与了胚胎肝脏中期发育过程,目前国内外尚无文献报道. 目的:通过研究STAT3蛋白在小鼠胚胎肝脏发育中的表达,试图揭示STAT3信号转导通路在胚胎肝脏发育过程中的作用和可能机制.设计:以STAT3蛋白为研究对象随机对照的基础研究.单位:一所军医大学的组胚教研室.材料:本实验于2004-01/2004-06在解放军第三军医大学组胚教研室的实验室完成.KM种小鼠(清洁级)由解放军第三军医大学动物中心提供.随机取雄鼠10只,雌鼠20只,体质量25～30 g.方法:分别取交配后13.5 d(n=8)、交配后14.5 d(n=9)、交配后15.5 d(n=7)鼠胚做冰冻连续切片.每2张切片中取1张用0.01 mol/LPBS代替STAT3一抗设阴性对照实验.利用免疫细胞化学技术和免疫荧光细胞化学技术显示STAT3蛋白在小鼠胚胎肝脏发育中的表达.主要观察指标:鼠胚冰冻连续切片STAT3蛋白的表达情况.结果:在孕13.5 d(E13.5 d)鼠胚中,STAT3蛋白在肝细胞中的表达较强,孕14.5 d(E14.5 d)和孕15.5 d(E15.5 d)STAT3蛋白在肝脏中的表达有所下降.结论:STAT3蛋白参与了胚胎肝脏的发育过程,可以用STAT3在肝发育中的表达来解释肝再生的机制,并为组织器官修复提供实验学数据.
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心力衰竭发病机制中血管紧张素Ⅱ致肥大心肌细胞微管的变化
目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)致肥大心肌细胞微管的变化规律及骨架调控剂对肥大心肌细胞中微管重构的影响.方法:在Wistar大鼠乳鼠心肌细胞原代培养基础上,应用AngⅡ诱导建立肥大心肌细胞模型,采用免疫荧光法检测肥大心肌细胞中微管的空间重构及骨架调控剂对微管空间构象的影响.结果:AngⅡ组心肌细胞3H-亮氨酸掺入较对照组明显增强(P＜0.05),提示蛋白质合成增强、细胞肥大.肥大心肌细胞中微管的荧光强度及密度增强,在AngⅡ作用的基础上,骨架调控剂秋水仙素及紫杉醇可致微管的密度分别减弱或增强.结论:AngⅡ可通过特定途径介导心肌细胞微管的重构,骨架调控剂秋水仙素及紫杉醇通过影响微管的聚合状态参与调控细胞对不同外来刺激的反应及细胞的跨膜信号转导.
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脊髓压迫性损伤后p3 8MAPK信号转导通路的时间变化规律
目的:研究脊髓压迫性损伤后p38MAPK信号转导通路在其中的变化规律和可能的意义.方法:制备脊髓压迫伤动物模型,用Westerm blot检测伤后0,30 min,6,24,72 h组织中p38MAPK的变化情况.结果:脊髓损伤后局部组织中p38MAPK存在明显的变化规律:30 min时出现明显表达上调,6 h达到高峰,以后逐渐下降,而正常脊髓组织中未检测出明确的表达.结论:p38MAPK信号转导通路参与了脊髓损伤后的信号转导,其变化规律有可能对脊髓损伤的治疗具有参考意义.
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弓形虫14-3-3信号转导蛋白基因亚克隆及鉴定
目的将弓形虫14-3-3(Toxo14-3-3)信号转导蛋白基因亚克隆入表达载体pBK-CMV，用于寻找弓形虫新的诊断和候选疫苗分子以及寄生虫-宿主相互作用等研究。方法根据Toxo14-3-3核苷酸序列设计并合成一对引物，以弓形虫速殖子mRNA为模板，RT-PCR法扩增Toxo14-3-3 DNA片段，通过TA连接将其克隆入pGEM-T载体、经测序证实序列完全正确。再将该目的基因亚克隆入表达载体pBK-CMV中，转化大肠杆菌XL1-blue，提取质粒，经双酶切法和以该质粒为模板PCR法证实。结果 Toxo14-3-3信号蛋白基因ORF含798 bp，编码265个氨基酸。结论获得表达质粒pBK-CMV/Toxo14-3-3阳性重组体，为原核和真核基因表达奠定了基础。
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TGF-β/Smad信号通路及其在肾纤维化中的作用
转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是介导肾小球硬化和肾间质纤维化关键的细胞因子,其作用包括趋化和活化炎性细胞,介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化,以及刺激细胞外基质蛋白的合成及降低基质金属蛋白酶的活性和/或增加蛋白酶抑制剂的合成来促进细胞外基质的沉积.Smad蛋白是TGF-β受体的胞内激酶底物,介导了TGF-β的胞内信号转导.Smad7是负反馈调节TGF-β功能的细胞分泌因子,其过度表达可能改变R-Smads和Ⅰ-Smads对TGF-β诱导纤维化的应答或阻断的病理生理平衡.深人研究Smads介导的TGF-β胞内信号转导,将有助于对肾脏纤维化发病机制的理解,为探索新的治疗途径、开发临床新药提供理论依据.
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P38MAPK信号通路与肾脏纤维化
有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是所有真核生物细胞将信号从感受器传递到细胞的主要信号转导通路.P38MAPK属于MAPK的一个亚族,是广泛存在于细胞浆内的含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白质激酶.通过许多不同的刺激(分裂素、分化因子、应激信号)而激活磷酸化而改变基因的表达水平,参与多种胞内信息传递过程,调节许多病变过程的重要基因表达,参与细胞外基质的合成,介导细胞生长、发育、增殖、分化、老化及死亡全过程.近年研究发现,P38MAPK在肾脏纤维化过程中起一定作用.
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应激研究进展
The initial definition of stress and its development were briefly retrospected with elucidating the significance of stress in life sciences study. Stress is involved in a variety of physiological and pathophysiological processes. Description of the advances focusing on the relationships between stress and several body systems including nervous system, immune system and cardiovascular system etc. and on the stress molecules and signal transduction was carried out. The ultimate aim of the review is to emphasize the importance and the distinct position of stress during the development of modern bio-medicine, and to further attract more attention to the research field of stress from more scientists.
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胃粘膜相关淋巴组织型淋巴瘤MAPK和Stat3磷酸化及cyclinD1蛋白表达的意义
目的:研究胃粘膜相关淋巴组织型(MALT)淋巴瘤MAPK和Stat3磷酸化与cyclinD1蛋白表达及其意义.方法:利用免疫组织化学方法检测了45例胃MALT淋巴瘤MAPK和Stat3磷酸化及cyclinD1蛋白的表达.结果:在胃MALT淋巴瘤中p-MAPK、p-Stat3及cyclinD1蛋白的阳性率分别为73.3%(33/45)、64.4%(29/45)和68.9%(31/45);低度恶性组p-MAPK和cyclinD1蛋白的阳性表达强度明显高于高度恶性组(P＜0.01),而p-Stat3表达强度无明显差异(P＞0.05);在低度和高度恶性胃MALT淋巴瘤中p-MAPK和cyclinD1蛋白的阳性信号强度均呈明显的正相关(r=0.6572和0.6823,P＜0.01),而p-Stat3与cyclinD1蛋白表达未见明显相关性(r=0.1927,P＞0.05).结论:提示MAPK磷酸化在胃MALT淋巴瘤中发生及演进过程中起重要作用,但Stat3的磷酸化可能与该肿瘤的恶性演进关系不明显;在胃MALT淋巴瘤的发生与发展中,p-MAPK可诱导cyclinD1过度表达,从而促使该肿瘤细胞维持高增殖状态.
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丝裂原激活蛋白激酶信号通路在肝脏缺血预处理细胞保护效应中的作用
目的研究p44/42丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路在肝脏缺血预处理细胞保护效应中的作用.方法建立体内和体外肝脏缺血预处理模型,应用蛋白激酶C(PKC)抑制剂和MAPK抑制剂,通过检测p44/42MAPK磷酸化水平,细胞活力,血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性变化,同时观察光镜细胞形态学损害,对相关数据进行统计学处理. 结果体内和体外的缺血预处理两部分实验都观察到相似的结果.和缺血再灌注组比较,预处理组的p44/42 MAPK磷酸化水平显著增高,肝细胞结构损伤改变较小,血清ALT、AST水平显著降低,缺血再灌注组的ALT、AST水平分别为(762.8±130.5)U/L和(820.9±111.3)U/L,预处理组的ALT、AST水平分别为(281.0±35.6)U/L和(407.7±73.7)U/L;和缺血预处理组相比,PK C抑制剂组和丝裂原蛋白激酶(MEK)抑制剂组相应的观察指标呈相反的变化,p44/42 MAPK磷酸化激活显著减少,肝组织细胞结构出现较明显的损伤改变,血清A LT、AST水平显著升高,PK C抑制剂组和MEK抑制剂组的ALT、AST水平分别为(645.61±90.4)U/L、(678.6±136.5)U/L和(466.2±82.8)U/L、(732.9±91.1)U/L.结论肝脏缺血预处理细胞保护作用中,p44/42 MAPK通路起到至关重要的作用.
