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FasL N-端编码序列对其表达的影响
目的探讨Fas配体(Fas ligand, FasL)胞内区氨基酸组成对膜型FasL蛋白表达的影响.方法 PCR技术扩增FasL胞内区产生不同缺失的cDNA,构建重组表达质粒;使用脂质体转染法将表达质粒导入靶细胞;RT-PCR分析FasL mRNA水平;荧光抗体染色、流式细胞仪和Western免疫印迹技术检测细胞中FasL蛋白的表达.结果 FasL N-端缺失第2～16氨基酸残基后,FasL蛋白在细胞中的表达水平显著增加,但mRNA水平不变.结论 FasL N-端第2～16氨基酸残基对FasL蛋白表达水平具有自我调节作用.
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白血病细胞中共表达P2X7受体和Notch1胞内区
本研究旨在构建野生型及N187D突变型P2X7与ICN1基因的共表达载体,并在白血病细胞中表达,为进一步探讨P2X7在白血病发展中的作用奠定基础.采用Overlap PCR法,通过2A连接,构建野生型或N187DP2X7与ICN1的共表达载体；经DNA序列分析验证后,包装病毒、感染K562细胞并经细胞分选获得稳定感染细胞系.采用RT-PCR、Western blot、胞浆游离钙离子浓度测定等方法,验证外源基因的表达及P2X7受体的功能.结果表明,序列分析显示载体构建正确；包装病毒对K562细胞感染效率40％-70％,流式分选获得稳定表达细胞株；RTPCR结果显示,P2X7受体和/或ICN1基因可在对应的稳定表达细胞株中高效表达；Western blot也证明,P2X7受体可在感染编码P2X7受体基因病毒的K562细胞中高效表达；胞浆游离钙离子浓度检测显示,在BzATP刺激下,表达野生及N187D突变型P2X7的K562细胞胞浆游离钙离子浓度持续升高.结论:本研究在白血病细胞中成功共同高表达P2X7受体与ICN1,为进一步探讨野生型和N187D突变型P2X7受体在白血病发展中的作用奠定基础.
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EGFR抑制剂细胞磷酸化筛选模型的建立与应用
表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶(PTK)活性的跨膜糖蛋白受体,由 N 端胞外区、跨膜区、胞内区 3 部分组成,胞内区共 542 个氨基酸残基,由近膜区、酪氨酸激酶区、C 末端等 3 个亚区构成,近膜区的前13 个氨基酸(645 ～ 657)介导胞内二聚化[1].自身磷酸化位点位于 C 末端,其中 Tyr1068 为主要的 3 个磷酸化位点(Tyr1068、Tyr1148 和 Tyr1173)之一,与细胞信号传递密切相关[2].表皮生长因子(EGF)与 EGFR 胞外区 N 端结合,受体之间二聚化形成同源或异源二聚体,二聚体促使EGFR 胞内区氨基酸残基自磷酸化,进而启动胞内信号通路,调控癌细胞的增殖、存活及凋亡[3].
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抑制SARS病毒侵染宿主细胞的多肽药物的研制
囊膜病毒一般通过囊膜上的糖蛋白和宿主细胞膜上的受体识别,然后介导病毒囊膜和细胞膜的融合,从而病毒释放内部基因组和蛋白而侵染细胞.这种糖蛋白在不同囊膜病毒中,结构上具有很大的相似性,包括一个很大的胞外区、一个跨膜螺旋锚定蛋白区和一个从20到150个氨基酸大小不等的胞内区.这类糖蛋白前体表达后,水解成密切相关的两个亚单位,然后形成多聚体 (一般是三聚体).这种糖蛋白一般具有一段称为"融合肽"的序列,这段序列副含疏水氨基酸和甘氨酸,可以作用于宿主细胞膜来介导膜的融合[1].
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入淋巴细胞CD2胞内区结合蛋白的分子克隆
CD2分子,又称E受体,分布于胸腺细胞及所有成熟T淋巴细胞和大部分NK细胞的表面,是T淋巴细胞的粘附和信号分子,在T淋巴细胞分化、成熟、识别、粘附、激活和凋亡等方面都具有重要作用.CD2分子的胞内区含有能调节细胞识别作用、粘附作用和细胞信号传递作用的不同功能区.近年的研究发现,CD2与其配体CD58、CD48的结合介导T细胞识别、粘附和激活作用.而以抗CD2不同抗原决定簇的单克隆抗体处理T细胞,则引起T细胞的不同应答反应.T112和T113处理T淋巴细胞引起细胞激活,而T11l和D66处理T淋巴细胞引起细胞激活后凋亡(activation induced cell death),其原因尚不明了.本实验室在多年研究的基础上推测,CD2胞内区可能传递不同的刺激信号,从而引起不同的细胞应答反应.为了验证这一假说,本研究采用酵母双杂交系统(two hybrid system),首次克隆得到了一与CD2胞内区结合的下游蛋白,并对该蛋白的功能进行探讨,结果如下:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人外周血淋巴细胞mRNA中扩增了CD2胞区cDNA片段,并将其命名为CD2c.
关键词： CD2 胞内区 酵母双杂交系统 v-fos转化效应蛋白 -
B细胞活化因子/增殖诱导配体在类风湿关节炎发病机制及治疗中的研究进展
B细胞活化因子(B cell activating factor of the TNF family,BAFF)是Schneider等于1999年发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族的新成员,又叫做B细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)~([1-2]).BAFF是由283个氨基酸残基组成的相对分子质量为313 000的Ⅱ型跨膜蛋白,可分为胞内区、跨膜区、胞外区3个部分.其N端的1～46位氨基酸为胞内区片段.47～73位氨基酸为跨膜区片段,其余为胞外区片段~([1]).
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Fas/FasL与妊娠免疫耐受及病理妊娠研究进展
Fas属于TNFR/NGFR(肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体)超家族的Ⅰ型跨膜蛋白,胞内区有一段80个氨基酸的序列与细胞的凋亡信号传递有关,称为死亡功能区.
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人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达
目的 克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白.方法 通过PCR获得hlL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760 bp的目的片段.重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确.表达的融合蛋白相对分子质量约为55 000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5 mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶件蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别.结论 已成功克隆了hlL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GsT融合蛋白.
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解聚素-金属蛋白酶家族剪切活化作用及其研究
解聚素-金属蛋白酶 (a disintegrin and metalloprotease,ADAM)又名MDC(Metalloprotease Disintegrin Cysteine-rich),是近年来发现的一类具有多个功能区的细胞膜表面糖蛋白家族,大约由800多个氨基酸残基组成.典型的ADAM蛋白其蛋白序列含保守的具有多个特征性的功能域,从N肽基端到C肽基端依次为信号肽区域、前调控区域、金属蛋白酶区域、解聚素区域、富半胱氨酸区域、上皮生长因子区域、跨膜区域和胞内区的细胞表面糖蛋白区域[1].
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T淋巴细胞生存与死亡的决定
T淋巴细胞抗原受体(TGR)通常以异二聚体(α/β或γ/δ)的形式存在,大多数胸腺和外周T淋巴细胞表达TGRγ/δ,而只有5%以下的T淋巴细胞和某些内皮组织中的T淋巴细胞表达TCRγ/β[1].TCRα/β的γ/δ分子胞内区都很短,只有3～5个氨基酸残基.因此,TGR分子本身不能传递抗原刺激信号,而由CD3分子传递.高度可变的TCR分子与恒定的CD3分子组成T细胞抗原受体复合物(TCR/CD3),共同完成抗原刺激信号的传递.
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瘦素受体第20外显子基因变异与2型糖尿病的关系探讨
瘦素是肥胖基因编码的一种脂源性激素,它与位于下丘脑和脂肪组织的瘦素受体结合后,发挥调节能量代谢和体脂平衡的作用.瘦素受体基因,又被称为糖尿病基因[1],于1995年被定位克隆[2],目前已在其20个外显子中发现19种基因多态性,但关于该基因变异与肥胖和糖尿病的关系,众家报道不一[3,4].本实验选择其胞内区第20外显子,检测其2927位核苷酸C→A变异和3057位核苷酸G→A变异频率[4],并探讨其变异与2型糖尿病的关系.
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组织因子在食管鳞癌中的表达及其临床意义
食管鳞癌是常见的上消化道恶性肿瘤,其死亡率高居恶性肿瘤死亡率第2位.食管鳞癌的治疗目前主要有外科、放射,药物及免疫治疗等.对于Ⅱ期以上的病例,单一的治疗方案往往效果不佳,故多采用综合治疗.组织因子又称凝血因子Ⅲ.是一相对分子质量为47×103的单链跨膜糖蛋白.由263个氨基酸残基组成,包括胞外区、跨膜区、胞内区三个结构域[1].
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多囊蛋白-1胞内区cDNA的克隆与表达
目的：获取多囊蛋白-1胞内区片段。方法：用PCR法克隆多囊蛋白-1胞内区的cDNA片段，然后插入融合蛋白表达载体pProEX Hta 中，经测序证实后，转入大肠杆菌中表达并用亲和层析法进行纯化。结果：克隆到一个660 bp的多囊蛋白-1胞内区cDNA片段，得到了一个相对分子质量为2.6万的融合蛋白。结论：多囊蛋白-1胞内区片段的融合蛋白为制备抗多囊蛋白-1单克隆抗体提供了基础。
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用于治疗癌症的抗EGFR人单克隆抗体Panitumumab
表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜糖蛋白,它包括一个胞外配体结合区和一个具有酪氨酸激酶活性及信号传导功能的胞内区,EGF和转化生长因子-α(TGF-α)是其重要的配体.其配体的结合可激活受体及其信号传导途径,并由此激活或调节细胞生长进程.该受体存在于源自所有3个胚细胞层(尤其是上皮层)的健康细胞及恶性组织中,已证实在多种恶性细胞中均出现该受体的过度表达,且受体水平上调导致临床预后不良.
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CD2胞内区结合蛋白的分子克隆及其功能研究
CD2分子分布于胸腺细胞、所有的成熟T淋巴细胞和大部分天然杀伤细胞的表面,是T细胞粘附和信号分子,在细胞分化成熟、识别、粘附、激活和凋亡等方面具有重要作用.
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EGFR 核移位途径及生物学功能研究进展
表皮生长因子受体（ epidermal growth factor receptor， EGFR），又称ErbB－1或HER1，是位于人染色体7p12的原癌基因c－erbB1的表达产物，其前体含1210个氨基酸，经剪切折叠形成1186个氨基酸残基的糖蛋白，定位于细胞膜上，分子量约为170 kD，为跨膜酪氨酸激酶受体（ tyrosine ki－nase receptors， RTKs）家族成员之一。 EGFR与其他跨膜蛋白类似，包含胞外区（ extracellular ligand－binding domain）、跨膜区（ single membrane－spanning region）和胞内区（ intra－cellular domain）3个部分，其中胞内区又含3个区域，分别为膜旁核定位信号区（ juxtamembrane nuclear localization sig－nal）、酪氨酸激酶区（ tyrosine kinase domain）和酪氨酸残基磷酸化区（ tyrosine－rich C－terminal tail），对激活下游信号分子起到重要的作用。传统的受体学说认为EGFR是一种膜受体，作为第一信使通过胞外段与相应配体结合后在Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173等位点发生自身磷酸化，进而与下游的一些信号分子结合激活下游的信号通路，如PLC－γ－CaMK／PKC、PI3K －Akt －mTOR、Ras －Raf －MAPK 和JAK－STAT等，但其自身不会进入细胞核。近年来越来越多的研究发现EGFR除了传统的信号通路之外还可以移位至细胞核，尤其是低分化的肿瘤细胞［1］，发挥转录因子和激酶活性，在肿瘤的增殖、侵袭、转移［2］以及诊断［3］治疗［4］中发挥重要作用。本文综述EGFR移位入核的途径及其入核后所发挥的生物学功能。
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肝细胞癌相关信号通路及靶向治疗研究进展
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国原发性肝癌中常见的一种类型,也是全球癌性死亡中重要的一个因素.目前治疗方法有多种,包括药物对症治疗、手术治疗、放射治疗、生物免疫治疗等.随着相关信号转导机制研究的发展,靶向疗法逐渐引起专家学者的重视.本文总结了涉及HCC主要相关信号传导通路及对应靶向治疗药物作用机制及研究进展,并述及其局限性,以期促进其临床应用.1 EGF/EGFR信号通路表皮生长因子受体(EGFR),又称ErbB-1,是ERB受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)家族,有胞外配体结合区、跨膜区及胞内区,其中胞内区具酪氨酸激酶活性.与配体结合后,EGFR形成同二聚体或异二聚体,磷酸化并激活下游多种信号如PI3K/Akt/mTOR、Ras/RM/MEK/ERK.EGFR的配体包括表皮生长因子(EGF),TGF-α,双向调节素(AREG),肝素结合的EGF(HB-EGF)等[1].HCC发病中EGFR研究相对较多:(1)EGFR在HCC中高表达,且这种高表达与晚期阶段并发症,细胞增殖水平及肿瘤分化水平有关[2];(2)EGFR通路的激活可作为HCC患者生存预后的预测因素[3];(3)EGFR在HCC的发展中作用重要.研究证实肝硬化患者血、组织中EGFR水平较高时,更易发展为HCC,且发展速度加快[4].其中,EGFR高水平与EGF基因单核苷酸多聚化,5'端非翻译区核苷酸转化有关.这种单核苷酸多态性可能导致转录子半衰期延长,进而使肝EGF水平升高[5].因此,EGFR信号通路可成为HCC治疗的潜在靶标.
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糖基化终末产物受体在肝脏中的作用
糖基化终末产物受体(Recptor of A dvanced Glycation End Products,RAGE)为糖基化终末产物(AGEs)的特征性受体,属于免疫球蛋白超家族的成员.RAGE由胞外区、跨膜区和胞内区组成.其胞外区包括3个免疫球蛋白样区:1个可变区和2个恒定区.可变区与配体结合相关而胞内区与PRGE介导的细胞内信号相关[1].RAGE是一个结合多个配体的受体,除了AGEs,它也结合淀粉样蛋白和S100/钙粒蛋白家族或两性蛋白(也被称为高迁移性组蛋白B1,HMGB1).
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TLR4胞内区的同源模建
目的为进一步研究新发现的TLR4蛋白在LPS对机体细胞产生作用的机制,分析其Q结构上的功能区域.方法同源模建,通过计算机模拟从理论上对TLR4胞内区的功能区域进行探讨.结果 Pro712His突变体溶液可及表面的亲疏水性质有明显变化, 且相应位置所带的电荷从中性变为正电荷.结论 TLR4胞内区在发生作用时,起主要作用的是疏水性作用,下一个接头蛋白MyD88与TLR4胞内区相互作用的部位应当是一个有较强疏水作用的区域.这样当Pro712His突变体出现时,由于电荷的排斥,疏水作用无法达到点突变以前的强度,2个蛋白的结合不能得以实现,信号无法继续传递.从而出现对LPS的耐受现象.
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TRAIL选择性诱导细胞凋亡的作用机理及意义
TNF为一庞大的家族，到目前为止发现的TNF家族成员主要有：TNFα、TNFβ、LTα、LTβ、CD30L、CD27L、CD40L Fas、OX-40L、4-IBBL，以及TRANCE(TNF-Related Activation-Induced Cytokine)和TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)等。其中TRANCE和TRAIL是新近发现的TNF家族成员。大多数TNF家族成员为II型跨膜蛋白质，即C末端在胞外区，且C末端有一同源三聚体。TNF家族成员具有多种多样的生物学功能，如具有细胞毒性及抗病毒活性，并参与免疫应答和免疫调节等。在这些功能中，有的是通过TNF成员诱导凋亡来实现的，如TNF就是通过诱导B细胞、CD＋４T细胞、CD＋８T细胞的凋亡来发挥其免疫应答和免疫调节作用的。TRAIL是新近几年发现的TNF家族成员之一。它也可以引起细胞凋亡，而且它引起的凋亡具有选择性，主要引起肿瘤细胞的凋亡，而不影响正常体细胞的生长分化。本文拟就其在诱导细胞凋亡中的作用机制和意义作一综述。1 通过受体途径实现其选择性诱导细胞凋亡的作用1.1 TFAIL［1］ TRAIL又称Apo-2L(Apoptosis-2 Ligand)，1996年由Pitti RM等人首先分离和鉴定。它含有281个氨基酸残基，分子量为32.5KD，等电点为7.63，在传染的细胞株中以II型跨膜蛋白的形式表达在细胞的表面，其胞外区(C末端)有一同源三聚体的亚单位结构，可水解形成可溶性TRAIL，可溶性的TRAIL缺少跨膜区和胞内区，N末端无信号肽结构。TRAIL与其它TNF家族成员具有较高的同源性，其同源性为：Fas23%、CD40L 20.8%、TLα 20.2%、LTβ 19.6%、TNF 10%、CD30L、CD27L各15.5%、OX-40L 14.3%、4-IBBL 13.7%)，并在许多正常组织中均有表达。体外实验表明，TRAIL在体外可存在各种来源的细胞株，如婴儿的肝、肾、肺；成人的脾、淋巴结、小肠、结肠、前列腺等。另外在T淋巴细胞、NK细胞等表面都存在着TRAIL。当然，在不同的肿瘤组织中均有TRAIL表达。但为什么TRAIL可以诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞的生长分化却没有影响呢?［2］这与TRAIL的受体分布有关。1.2 TRAILR(TRAIL Receptor) 目前发现的TRAILR共有四种：TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3和TRAILR4。其中TRAILR1和TRAILR2因含有死亡结构域(Death Domain DD)而分别被称为死亡受体4(Death Receptor4)和死亡受体5(Death Receptor5)，目前研究比较清楚的死亡受体还有DR3为一细胞因子受体，分布于富含淋巴细胞的组织和器官中，表现出诱导细胞凋亡和激活转录因子NFkB两种生物活性。TRAILR3又称诱捕受体1(Decoy Receptor1)，TRAILR4又称诱捕受体2(Decoy Receptor2)。 TRAILR1［3］由468个aa组成，其N端具有信号肽结构。胞外区含有两个半胱氨酸丰富的重复区，胞内区含有死亡结构域，这是一个由77个aa组成的功能区，与TNFR1、DR3和FAS的死亡功能区具有较高的同源性。TRAILR1中死亡功能区的氨基酸序列相对保守。它在正常组织如脾，外周血白细胞、小肠、甲状腺、活化的T细胞等以及肿瘤组织中均有表达。TRAILR1可以选择性地结合TRAIL，同时有实验表明，过度表达的TRAILR1能够不依赖相应配体而直接诱导细胞的凋亡。 TRAILR2［4-7］含有411个氨基酸，为I型跨膜糖蛋白结构。与TRAILR1相似，其N端为信号肽，胞外区也存在两个富含半胱氨酸的重复区，胞内为死亡结构域，与TRAIL-R1有很高的同源性，它在MCF7细胞和Hela细胞中过度表达能诱导这些细胞凋亡。其诱导凋亡作用可以被Caspase的抑制剂CrmA和2-VAD-fmk抑制，提示它可能通过激活Caspase家族引起凋亡。 TRAILR3［6］由259个aa组成，其显著的结构特点是没有胞内区即不含有死亡功能区，而只有信号肽、含有两个半胱氨酸丰富的重复区的胞外区以及跨膜区，实验表明它与TRAIL的亲合力与TRAILR1和TRAILR2相近，可溶性的TRAILR3能够抑制TRAIL诱导的凋亡，当其过度表达时则不能在体外诱导细胞的凋亡。该受体在人的正常组织分布广泛，常分布于心脏、肺、肝、肾、骨髓、脾、胎盘中而多数癌细胞上则不存在该受体。 TRAILR4［8，9］由386个氨基酸组成，胞外功能区与其它3个TRAIL受体具有高度同源性，可达58%左右。其C末端的胞内仅含有死亡功能区的1/3，故与TRAIL结合之后不能介导凋亡，而有实验表明其有抑制TRAILR1和TRAILR2介导的凋亡的作用。TRAILR4在许多正常组织具有表达而在许多肿瘤组织中表达缺如。1.3 TNF受体结合蛋白FADD(TNFR1 Associated Death Domain Protein)［10］ FADD又称MORT-1，它含有208个氨基酸残基，分子量23kD，其C端含有一个死亡结构域，它可以通过这一死亡结构域与TRAILR1和TRAIL受体的死亡结构域相互识别和结合。在其N端含有一个特异的结构域，该结构域称为MORT结构域或死亡效应结构域，通过它可以和ICE/CED3蛋白酶家族的新成员——MACH/FLICE(caspase 8)［11-13］结合，从而诱导细胞凋亡。研究表明MORT结构域具有转导细胞凋亡信号的作用。1.4 TRAIL受体途径诱导肿瘤细胞凋亡的机理 TRAIL的生物学效应是通过与结合于细胞膜上的相应受体而产生的。TRAILR与TRAIL结合后常形成形成寡聚体(多为三聚体)，这种寡聚体可使胞浆内的死亡功能区彼此靠近、聚集，从而诱使胞浆内的Caspase级联式反应发生。Walczak henning等人的实验表明：TRAILR是通过FADD来传递信号的，其可能机制是：被激活的TRAILR通过死亡结构域之间的相互识别和作用与FADD结合，FADD再通过它的MORT结构域同MACH/FLICE(caspase8)结合，从而激活caspase8的ICE/CED3蛋白活性，后者再激活其它的ICE/CED3蛋白酶。此外，FADD的表达尚可引起神经酰胺［14］浓度的升高，后者可以作为第二信使传递信号，起到激活CED-3/ICE样蛋白激酶CPP32的作用。 对正常的组织细胞而言，在表达TRAILR1和TRAILR2的同时也表达TRAIL3和TRAILR4，由于RAILR3没有死亡功能区所以不能诱导细胞凋亡；TRAILR4的死亡功能区不完整，所以也不能诱导细胞凋亡，实验表明二者还能抑制TRAILR1和TRAILR2诱导的凋亡，因而TRAIL对正常的组织细胞没有明显的损伤作用。而在肿瘤细胞中，TRAILR3和TRAILR4则常常缺乏表达，所以容易出现凋亡。这种死亡受体和诱捕受体表达上的差异性正是导致肿瘤细胞凋亡，而正常细胞受诱捕受体的保护免遭凋亡的原因。
