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荧光定量PCR检测食品中沙门氏菌研究
实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)实现了PCR从定性到定量的飞跃,可对目标DNA分子起始拷贝数精确定量。因其检测方法精确、灵敏、污染途径少,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法,在食品中安全微生物的鉴定也有重要应用[1]。沙门氏菌是引起食物中毒为常见的致病菌,因此,建立食品中沙门氏菌中荧光定量PCR检测方法有重要的研究意义。材料与方法?1菌株:鼠伤寒沙门氏菌(C77-31)有中科院微生物所提供,肉类、奶制品等产品均购于农产品市场。2主要试剂和设备:DNA提取试剂购买于美国Invitrogen公司;Taq酶和缓冲液购买于日本TaKara;opction2荧光定量PCR购买于美国MJ公司;超速离心机购买于Eppendorf;细菌鉴定仪;所用的常规试剂均为分析纯,购买于国药化学试剂有限公司;方法,将标准菌株在XLD、三糖铁斜面和肉汤培养基上培养,从肉汤培养基中取一定量的菌液装入EP管中,离心,去上清,加入双蒸水,沸水浴、冰水浴,离心,取上清。食品样品采用沙门氏菌国标检测法(GB?4789.4-2010)中BPW前增菌之后的培养液装入EP管中,进行相同的操作。引物探针设计,在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象,然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo验证评估引物。经过筛选进行特异性和灵敏度的实验。
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基层疾控中心细菌性食物中毒检验探索
食物中毒属常见的突发公共卫生事件,而在各种类型的食物中毒中,又以细菌性食物中毒为多见.有条件的实验室已采用PCR仪、全自动细菌鉴定仪、全自动荧光酶标免疫测试系统等先进设备进行检验,具有快速、灵敏、准确的优点[1-3].而根据属地管理原则,食物中毒的检验任务主要由基层疾控中心承担,基层疾控中心大部分由于缺少这些先进设备,对细菌性食物中毒的检验仍靠传统的培养来完成.随着《突发公共卫生事件处理条例》的实施,各级各部门对食物中毒都引起了高度重视,这给基层疾控中心食物中毒检验提出了更高的要求.我们认为对细菌性食物中毒检验,基层疾控中心从建立健全预案、充分的材料准备、加强人员培训、检验人员参与现场调查、注重样品的采集与优势菌观察、选择合适的方法、关注重点样品的第一结果等几方面着手,是克服目前基层疾控中心设备落后,做好食物中毒检验的有效办法.
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肌肉注射引起偶发分枝杆菌局部感染的细菌学鉴定
1998年8月~1999年3月,福建省南平市樟湖镇,先后发生了59例患者因肌肉注射引起的局部细菌感染,且久治不愈,主要表现为感染部位肿痛,无发烧,局部组织病理学检查表现为脓肿及肉芽肿小结节形成的空泡细胞条带。所有患者感染部位渗出液标本经培养均分离出一种分枝杆菌,经鉴定确定为偶发分枝杆菌(M. Fortuitum)。报道如下。 一、材料和方法 1.标本来源:59例因肌肉注射引起局部感染久治不愈而收治入院的患者。临床根据患者情况不定期抽取炎性渗出液作细菌培养及鉴定,先后送检96份标本(每个患者先后送检1~3份标本)。 2.细菌鉴定仪器及试剂盒:Hemoline双相血培养瓶,细菌生化鉴定卡(ATB和API)和药敏卡(Rapid ATB STAPH和ATB G-),细菌鉴定仪均由生物梅里埃公司提供。菌株的生物学及生化反应特性的鉴定参照有关文献[1-3]。药敏纸片由浙江省军区后勤部卫生检定所生产。 3.标本接种及鉴定:将96份感染部位渗出液标本接种Hemoline双相血培养瓶和改良罗氏结核菌培养基,同时接种麦康凯、SS、普通营养琼脂和血琼脂平板等,置28℃需氧培养。所有分离出的菌株接种API、ATB生化鉴定卡作出初步鉴定,对符合分枝杆菌属的菌株再按上述文献中有关分枝杆菌分类方法作进一步的生物学及生化特性鉴定。对确定为偶发分枝杆菌的菌株再接种上述药敏试验卡,37℃孵育36~48 h后用ATB鉴定仪或手工判读药敏结果,同时有部分药物用药敏纸片扩散法作对照检测。 二、结果 1.生物学特性:从患者感染部位采取的96份标本,均检出分枝杆菌,各菌株的生物学特性基本相同。标本接种Hemoline双相血培养瓶培养48 h后,液体明显混浊,有薄层菌膜形成,半固体斜面生长出灰白色菌落,直径1~2 mm。在改良罗氏培养基和血平板上,28℃培养48 h后,菌落形态及大小与上述相似,继续培养后,菌落表面逐渐干燥和粗糙。在SS和麦康凯平板上,生长缓慢,培养3天后,形成1~1.5 mm大小的菌落,呈紫红色。各菌株在pH 4~11.5培养可生长,但以pH 8.0~10.0佳。涂片革兰染色阳性,菌体呈杆状或球杆状,长约1~3μm;抗酸染色阳性或弱阳性。
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霍乱弧菌混合感染1例
2004年我们发现1例特殊的疑难病:霍乱弧菌与嗜水气单胞菌混合感染,现报告如下.1病例报告患者,女,32岁,因进食海鲜于2004年8月23日出现发热、腹痛、腹泻症状,体温高达40℃,腹痛以脐周为重,稀水便,3~4/d,量不大,临床表现不像霍乱,疑似肠炎.查便常规:每低倍视野白细胞10~15,红细胞、吞噬细胞阴性,动力试验阳性,O1群霍乱血清及O139群霍乱血清制动阴性,但12 h后选择性培养基庆大霉素平皿菌落生长良好,为湿润的灰色菌落,挑取菌落与O1群霍乱血清发生凝集,与O139群霍乱血清及生理盐水不凝集,但暗视野显微镜下均不制动,仍不能确诊,再分纯菌落,单个菌落有深灰色边界毛糙的菌落及浅灰色边界光滑的菌落,查动力均阳性,氧化酶均阳性,前者与O1群霍乱血清发生凝集,制动阳性,后者O1群霍乱血清制动阴性.经Vitek-AMS60全自动细菌鉴定仪、生化反应及血清凝集试验诊断为O1群霍乱弧菌及嗜水气单胞菌的混合感染,药敏试验显示对喹诺酮类及头孢菌素类药物均敏感.该患者经积极补液及环丙沙星、黄连素抗感染治疗4 d,痊愈出院.
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大肠埃希菌的耐药性分析
革兰阴性菌已成为近年医院感染的主要细菌,据我院近两年对细菌的监测,革兰阴性杆菌占我院常见菌的49.7%.大肠埃希菌排在我院常见菌的首位,分析其耐药情况,对临床治疗具有一定的指导意义.1 资料与方法我院临床科室送检的各类标本分离出病原菌312株,其中大肠埃希菌64株,占20.5%,1999年分离出细菌326株,其中大肠埃希菌77株,占23.6%.采用美国B-D公司生产的9050型微生物增长分析器和半自动细菌鉴定仪进行.
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细菌鉴定仪在细菌性食物中毒检测中的应用
目的 探讨细菌性食物中毒检测流程结合细菌鉴定仪,在细菌性食物中毒中病原菌检测时的应用,供细菌性食物中毒检测参考.方法 将采集到的食物中毒标本按细菌性食物中毒检测流程进行检测,获得纯菌落,用细菌鉴定仪进行鉴定.结果 应用该方法对11起食物中毒标本进行分离鉴定,7起检出致病菌,检出率为63.6%.结论 应用该检测流程和细菌鉴定仪,对细菌性食物中毒病原菌的检测具有快速、准确、全面、自动化程度高的优点.
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连续四年铜绿假单胞菌临床分布及耐药
目的:通过测定我院铜绿假单胞菌临床分布及耐药分析为临床合理选择抗菌药物提供依据。方法:细菌培养鉴定采用VTTEK细菌鉴定仪。结果:铜绿假单胞菌临床分离2010年居第一位,2011年第2位,2012年第三位,2013年第四位呈下降趋势,虽然P A检出率下降但对多种抗菌药物严重耐药且耐药率逐年上升,2010年耐药率低于30%的抗菌药物有5种:SCF8%、AMK 12%、ATM14%、MEM16%、CAZ 17%。2011年耐药率低于30%的抗菌药物只有1种即AMK12%。IPM、MEM耐药率高达70%和69%。2012年情况有好转耐药率低于30%恢复5种AMK9%、CIP29%,IPM26%, MEM21%、SCF28%。2013年耐药率低于30%的仅剩2种A M K5%、C A Z27%。结论:铜绿假单胞菌临床分离率及耐药率高,并逐年增加,开展对该细菌的耐药性监测,以指导临床选择抗菌药物。
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ATB细菌鉴定仪快速检测食物中毒样品中的麦氏弧菌
麦氏弧菌(V.metschniKovli)是一种致病性弧菌,广泛存在于河流、海湾和下水道中,同时在人群和动物肠道中可分离到.国内关于麦氏弧菌引起食物中毒的报道较少.2000年4月,我市某小学发生集体食物中毒,我们对送检的食物中毒样品进行检测,用ATB细菌鉴定仪检出麦氏弧菌.
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应用Vitek-AMS细菌鉴定仪鉴定三株绿色气球菌
随着现代细菌鉴定技术的飞速发展,临床鉴定与识别罕见细菌的能力有了很大提高.现报道我院1999年2月从临床标本中分离的3株绿色气球菌的情况.
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Vitek药敏试卡检测泰能敏感试验的讨论
我们在用Vitek-32型细菌鉴定仪进行药物敏感试验(试卡法)时,发现革兰阴性杆菌对泰能耐药率较用K-B法上升.为了探讨试卡法检测泰能的可靠性,我们将一年中检出的大部分革兰阴性杆菌用试卡法和琼脂扩散法(K-B法)同时检测对泰能的敏感性,其中部分菌再用肉汤稀释法检测低抑菌浓度(MIC).结果报告如下.
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使用微生物半自动化培养鉴定系统遇到的问题及解决方法
我们现在使用的是ATB Expression半自动细菌鉴定和药敏分析系统,由法国梅里埃集团生产,ATB使API系统(属手工操作系统,已有25年以上历史)自动化和电脑化,除配制、接种菌液为手工外,其他步骤均为自动操作,提供了标准,简单及准确的比浊及加样程序,大大消除了实验过程中的个体差异;此外,传统的微量生化实验,通常是怀疑为某种菌落,再来选择生化实验的种类,而细菌自动鉴定仪只是根据G+或G-、细菌形态、氧化酶及OF反应来决定鉴定板条的选择.ATB Expression半自动细菌鉴定仪工作原理就是利用特定的反应试条,通过阅读器自动阅读试条,根据试条的生化反应数据进行统计分析,根据相似程度(T值)及百分概率(%ID)的组合,作出判断.可鉴定包括全部有临床意义的病原菌.
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布鲁菌常规检测与结果分析
目的探讨简便可靠实用的布鲁菌早期检出方法,为布鲁菌病的及时诊治提供依据。方法应用BACTEC 9120或BACT/ALERT 3D 等系统进行血或骨髓培养,然后取阳性瓶增菌液转种血平板和巧克力等平板,再经VITEK-2-Compact 全自动微生物分析仪或API 20 E 鉴定系统进行菌种鉴定。结果布鲁菌在上述血培养仪的瓶中2~4d 可获得阳性生长物,经 VITEK-2-Compact 仪(或API 20 E 鉴定系统)次日能得到鉴定结果。结论Compact 鉴定仪(或API 20E 鉴定系统)对布鲁菌的鉴定简单、可靠、经济、实用,且不会漏检和误检,是目前常规检测布鲁氏菌的可靠方法。
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从某餐厅备用土豆丝中检出温和气单胞菌
2000年9月,济南市某餐厅发生一起食物中毒,虽因报告不及时,未能采集到中毒剩余食品,但从中毒餐次烹调菜肴所剩的土豆丝中检出有致病力的温和气单胞菌,现报告如下.1 菌株的分离鉴定与动物试验1.1 分离鉴定将采集到的土豆丝,经营养肉汤、SC培养后,在SS平板上分离出较纯的可疑菌落.在对分纯菌落作出氧化酶试验及触酶试验阳性的基础上,将该菌落划线接种于BUG平板,用Biolog细菌鉴定仪(美国)进行鉴定,同时做常规生化反应.
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药敏在细菌鉴定及抗感染治疗中的作用
细菌鉴定一般从标本来源、菌落形态、染色性、菌体形态、生化反应、生物编码或借助细菌鉴定仪等诸方面来鉴别细菌[1].随着抗菌药物在临床上的广泛应用,细菌常会出现耐药性,工作中发现部分细菌的某些药敏谱可有固定模式:呈天然耐药或高度耐药或高度敏感,其在细菌鉴定和抗感染治疗中起较大作用,现分述如下.
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头孢西丁和苯唑西林纸片扩散法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测结果观察
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对β-内酰胺类抗生素及其衍生物表现为耐药.目前,MRSA检测常采用的方法主要有三类:第一类是传统药敏方法如CLSI推荐的药敏纸片法,第二类是自动细菌鉴定仪,第三类是分子生物学方法.
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我院2004~2007年三种常见杆菌的耐药性分析
近期,我们对我院2004~2007年临床分离的三种常见杆菌的耐药性进行了分析,现分析结果.材料与方法:大肠埃希菌1181株,肺炎克雷伯菌698株,阴沟肠杆菌210株(同一患者的重复株不予计入).采用法国生物梅里埃公司VTITEK32细菌鉴定仪进行鉴定.
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痰液中分离出产β-内酰胺酶发光致病杆菌1例报告
患者男,76岁,反复咳、痰、喘40年,每年发作3个月以上,症状加重7天入院.查体:T37.2℃,P95次/min,R21次/min,Bp135/70mmHg.血Rt:WBC6.5×109/L,RBC4.45×1012/L,Hb147g/L,PLT128×109/L;血气分析:pH7.44,PaO273.4mmHg,PaCO2256.4mmHg,HCO-338.6mmol/L,BE12.5mmol/L; CT示慢性支气管炎、两肺气肿征、双肺上叶结核灶.将患者痰液接种于血平板,37℃24小时后,菌落呈中等大小、圆形、灰色光滑,涂片检查证实为G-杆菌.生化反应:氧化酶,靛基质,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、ONPG、V-P、甘露醇、柠檬酸盐、苯丙氨酸、肌醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、木糖、棉子糖、鼠李糖、阿拉伯糖、水杨酸、蔗糖、侧金盏花醇、精氨酸双水解酶阴性.触酶、动力、尿素、明胶液化、丙二酸盐阳性,与相关菌区别:本菌动力阳性,精氨酸双水解酶和鸟氨酸脱羧酶均阴性,可与不动杆菌属相区别,培养三次结果相同.根据以上生长特性及生化反应结果符合发光致病杆菌的特征,且同上海FORTUNE.2000细菌鉴定仪结果相同,其鉴定可信度98.79%.
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应用细菌鉴定仪鉴定弧菌若干问题的探讨
由于计算机的广泛应用促进了微生物自动化的实现,自70年代开始即有多种微生物自动鉴定系统问世.ATB-Ex-pression(以下简称ATB细菌鉴定仪)是法国生物梅里埃公司(bio Merieux)产品,很大程度上代替了数百年来烦琐的手工操作,缩短了鉴定周期,提高了鉴定效率,在中国甚至在世界范围已有较为广泛的应用.
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ATB Expression自动细菌鉴定仪在实际工作中的应用
在现代卫生检验学中,检验工作的仪器化、电脑智能化是其中的一个发展方向,微生物检验也不例外.传统的微生物检验,基本上脱离不了平板分离、微量生化反应、血清学试验几个环节,且均采用手工操作,肉眼判断结果,较易造成检验中存在明显的个体差异.
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中国检验医师的现状及思考
随着医学科学技术的迅速发展,流式细胞仪、化学发光分析仪、细菌鉴定仪以及分子生物学技术的广泛应用.检验科已经是现代医院中一个重要的实验诊断科室[1].现代检验医学不仅要求为临床诊疗提供准确的检验结果,而且更加强调检验与临床之间的结合,为临床提供检验结果的解释和咨询服务[2].当前许多学者都提出了检验医师培养的重要性和迫切性.