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组织培养用于小鼠胚胎AGM区造血发育的研究
本研究通过建立组织培养方法探讨小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾区(AGM)区造血发育规律.选取小鼠胚胎AGM区作为实验对象,体外组织培养2天后,应用集落形成实验观察髓系祖细胞的数量,应用体内移植考察CFU-S1l和造血干细胞的发育.结果表明:组织培养后的AGM区细胞仍然具有形成髓系集落的能力；每个胚胎期10.5天(E10.5) AGM区在致死剂量照射的成年小鼠脾脏中可形成10.8±3.5个CFU-S11.更重要的是,经组织培养的E10.5 - E11.5 AGM区能高比例(85.7％)、高嵌合[(51.12±21.17)％]、长期(＞4个月)重建受致死剂量照射的成年小鼠的造血系统,在受鼠的外周血、骨髓、脾脏、胸腺中均能检测到供体来源的淋系或髓系祖细胞嵌合.结论:应用本研究建立的组织培养体系可对正常或基因突变胚胎AGM区中的多种造血起始细胞(尤其是造血干/祖细胞)进行发育动力学研究.
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11755名中国北方汉族造血干细胞供者HLA-A、B、DRB1基因和单倍型研究
为了研究中国北方汉族造血干细胞供者的人类白细胞抗原(HLA)-A,B,DRB1等位基因、HLA单倍型频率及其连锁不平衡特征,采用PCR-SSP和PCR-SSO流式微磁珠检测方法对中华骨髓库陕西分库内11755名中国北方汉族骨髓供者进行HLA基因低分辨分型,并根据HLA表型群体资料,运用基于大数学预期值算法(Expectation-Maximization,EM)的计算机软件Arleguin计算HLA单倍型频率.结果表明:11755例样本符合Hardy-Weinberg平衡检验,共检出HLA-A、B、DRB1等位基因(按分解抗原统计)分别为18、42、15种,包括很少在汉族人群中检测到的HLA-A25、B42、B53、B73和DR3,未发现HLA-A36,A43,A80,B78,B82和DR18等6种特异性.HLA-A*02,A*11,A*24,A*33,A*30,A*01, A*03,A*13,B62,B*51,B*46,B60, B61,B*35,B*44,DRB1*15,DRB1*09,DRB1*04,DRB1*07,DRB1*12,DRB1*11, DRB1*14,DRB1*08,DRB1*13的频率＞0.05.EM法计算求得频率＞10-6的HLA-A-B-DR单倍型共计2026种,其中HLA-A30-B13-DR7、A2-B46-DR9、A33-B58-DR17等26种单倍型频率＞0.005,A30-B13-DR7是中国北方汉族常见单倍型.计算求得的HLA-A-B、A-DR、B-DR单倍型共计538、227、522种,频率＞10-6者分别有409、195、423种,其中A30-B13,A2-B46,A33-B58等28种单倍型频率＞0.01;A2-DR9,A2-DR15,A30-DR7等26种单倍型频率＞0.01;B13-DR7,B46-DR9,B13-DR12等24种单倍型频率＞0.01.具有统计学意义(P＜0.05)的连锁不平衡HLA-A-B、A-DR和B-DR单倍型分别有296种(72%)、130种(67%)和308种(73%),其中A30-B13、A33-B58、A1-B37、A30-DR7、A33-DR13、A1-DR10、B37-DR10、B8-DR17、B13-DR7、B58-DR17等单倍型表现为显著的正连锁不平衡.结论:本研究使用EM算法获得了目前中国北方汉族样本量大的HLA-A/B/DRB1等位基因多态性、单倍型频率分布及连锁不平衡的特征,这将有助于临床为患者寻找合适供者,为移植免疫、HLA与疾病相关性及本地区群体遗传学等方面的研究提供了重要依据.
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致敏动物模型的建立及其对造血干细胞植入的影响
本研究目的是建立致敏的动物模型,探索致敏动物体内免疫功能的改变,并探讨致敏对造血干细胞植入的影响.经尾静脉分别输注不同数量的C57BL/6脾细胞(1×105、1×106、1×106,连续注射2次,间隔7天)于BALB/c 小鼠,通过补体依赖淋巴细胞毒性实验、混合淋巴细胞反应和ELISA等方法检测致敏模型的免疫功能.致敏BALB/c 模型经8 Gy 60 Coγ-线照射后通过尾静脉或骨髓腔移植1×107 C57BL/6骨髓细胞,观察移植后生存情况.结果表明:致敏BALB/c模型均产生不同强度的供者反应性抗体,1×106 及1×106 连续注射2次,间隔1周的致敏组脾细胞体外增殖均明显高于正常小鼠.各组致敏模型小鼠经尾静脉注射C57BL/6骨髓细胞后,均于移植后第9-15天死亡,1×106 连续注射2次,间隔1周的致敏BALB/c模型经骨髓腔注射骨髓细胞后亦于2周内死亡.结论:通过同种异基因的脾细胞输注建立不同致敏程度的动物模型,该致敏模型小鼠体内免疫功能的变化与致敏程度有关.脾细胞输注致敏使受者对供者造血干细胞产生排斥作用,而骨髓腔注射方法并不能改善植入.
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抗氧化剂在保护造血干细胞生物学功能方面的作用
在外周血造血干细胞移植中,骨髓造血干细胞(bone marrow hematopoietic stem cells,BMHSC)的动员及其在外周血液高氧环境中的循环都增加了活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,这对BMHSC的生物学功能起到了抑制性的作用.本研究在BMHSC的培养中,应用维生素C的衍生物——抗坏血酸磷酸酯盐(ascorbic acid 2-phosphate,AA2P)来抑制ROS产生,并模仿其在外周血造血干细胞移植中的氧环境,通过体外增殖实验、流式分选技术、活性氧测定、CD34+造血干细胞移植等实验来评价上述培养方法对BMHSC生物学功能的保护作用.结果表明:体外培养的BMHSC的ROS水平明显高于新鲜分离的BMHSC;同时,扩增的AC133+ CD34+早期红系细胞集落形成单位(BFU-E)、粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)、粒-单核细胞混合集落形成单位(CFU-GEMM)的数量、细胞迁移率、人重症联合免疫缺陷鼠(SCID)移植重建细胞的数量都要明显高于在不含AA2P的环境中培养的造血干细胞.结论:抗氧化剂的干预是在外周血造血干细胞移植过程中保护HSC生物学功能的一种有效手段,并能够提高外周血造血干细胞移植的治疗效果.
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体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干/祖细胞的研究
本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34+造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落(CFU-E),粒系集落(CFU-G),巨核系集落(CFU-M),粒-巨核系集落(CFU-GM)和混合系集落(CFU-GEMM).结论:iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.
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我国实验血液学研究新进展--记第9届全国实验血液学会议
第9届全国实验血液学会议由中国病理生理学会实验血液学专业委员会主办,上海第二军医大学长海医院全军血液病专科中心承办,2003年11月6日至10日在上海召开.
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当前造血干细胞研究面临的挑战
在新千年到来的时刻,综观一下造血干/祖细胞基础和临床研究当前面临的众多难题,会有益于探讨我国实验和临床血液学如何赶上国际先进水平的.
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活性氧影响鼠骨髓造血干细胞凋亡的机制研究
本研究探讨外周血造血干细胞移植中暴露于较高氧浓度环境下的外周血造血干细胞(PBHSC)内的异常增高的活性氧(reactive oxygen species,ROS)对其生物学功能造成损伤的机制.通过模拟骨髓平均氧浓度(5％O2)、静脉平均氧浓度(12％ O2)、动脉平均氧浓度(20％ O2)来培养骨髓造血干细胞(BMHSC),采用荧光探针检测细胞内ROS水平；流式细胞术分析不同细胞周期的细胞比例；Annexin V/PI双标记法检测细胞的凋亡情况；利用PCR技术检测细胞ATM基因表达；利用Western blot方法检测P21蛋白的表达.结果发现:与5％ O2对照组比较,12％ O2、20％O2组、氧浓度连续变化的5％-12％-20％O2组进入G1期、S期、G2/M期的细胞比例显著增加(P＜0.01)；细胞凋亡率显著增加(P＜0.01)；同步检测的ATM基因表达量明显低于对照组(P＜0.01)；P21蛋白表达量明显高于对照组(P＜0.01).结论:ROS通过ATM基因表达抑制和细胞周期蛋白P21活化,导致BMHSC的凋亡.
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实验血液学架起实验室与临床的桥梁——血液学的希望
本文总结了国际近数十年来的血液学发展,展示了实验血液学如何不断地从临床实践的各种难题中寻找研究方向和新靶点,更新思路,实验室成果又如何不断地反馈和渗透到临床应用,促进了现代血液学的快速形成和发展,这是一个"转换型研究"的好典型.近数十年来,实验血液学研究所取得的累累硕果,深化了我们对自身受精细调控的造血生成的认识,即胚胎与成体造血都是造血干细胞在各种转录因子、细胞因子、表观遗传学调控因素、造血微环境等的协调作用下,进行自我更新与分化,对称性与不对称性分裂并存,维持造血功能的正常.实验血液学研究还揭示了包括血红蛋白病、再生障碍性贫血等红细胞疾病、血友病等凝血障碍性疾病、白血病、骨髓增殖性疾病等血液系恶性肿瘤的分子机理,发现了这些血液病的治疗靶点并开发了靶向治疗方法与协同靶向疗法,大大改善了这些疾病的临床预后,甚至使急性早幼粒细胞性白血病等发生了从高死亡率向高治愈率的转变.现在,实验血液学的研究进入了基因组与系统生物医学的时代,该领域的进展不仅使我们在分子水平上认识自我,还使我们看到了治愈某些恶性血液病的希望.在21世纪,整合资源、团结协作、共同发展,是促使我国实验血液学赶超世界先进水平的力量源泉.
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造血干细胞不能分化为心肌细胞
2001年纽约医学院Anversa领导的实验室Orlic等人在Nature杂志上著文,称造血干细胞直接注射心肌梗死区可转化为心肌细胞[1],有望应用于人的心肌修复,结果激起了国内外临床工作者的广泛关注并进行了临床试验.此报道被称之为是新世纪心肌梗死治挝疗的一阵"旋风".
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干细胞制品临床前药效学及安全评价研究概况
Back 等[1]1968年报道骨髓移植治疗湿疹血小板减少伴免疫缺陷症以来，细胞制品作为一种很有价值的资源一直用于治疗多种疾病。由于干细胞具备自身更新和分化的能力，其衍变而来的临床用生物制品可能具有与其本身不同的生物学特征，故干细胞制品是一种不同于基础细胞的生物制品。目前，对此类干细胞制品的生物学特性及临床应用价值仍处于研究探索阶段，但对不同类别的干细胞制品的研究探索程度不同，例如，间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）/基质干细胞、造血干细胞等已有大量临床前研究和临床使用的报道[2-4]，而人胚胎干细胞（ human embryonic stem cells ， hESCs ）或诱导性多功能干细胞（induced pluripent stem cells，iPSCs）目前还缺乏足够的临床前资料，尚未进入临床使用。虽然许多临床观察结果令人鼓舞，而且新的治疗领域不断扩展，但干细胞的临床应用仍存在一定的安全风险。本文结合近年来干细胞的临床前研究，对干细胞制品的治疗效果和安全风险等进行综述。
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活化单倍相合异基因造血干细胞治疗晚期难治性肿瘤的初步观察
目的 探讨活化单倍相合异基因造血干细胞(allogeneic haploidentieal hematopoietic stem cells,haplo-HSC)治疗各类晚期难治性肿瘤的安全性和临床疗效.方法 42例晚期转移性或化疗抵抗件肿瘤患者入组,均接受一个疗程haplo-HSC治疗,分别通过影像学检查、生活质量评分以及外周血淋巴细胞业群、细胞因子变化情况来评估临床疗效和免疫学反应.结果 ①42例患者中,7例部分缓解(PR),25例疾病稳定(SD),10例疾病进展(PD),有效率(CR+PR)为16.67%,临床获益率(CR+PR+SD)为76.19%.中位随访时间21个月,中位达进展时间(mTTP)为3.7个月,中位生存时间为7.8个月,1年生存率为14%;②治疗后患者的CD3+、CD4+.、CD4+,CD8+、CD3-CDl6+CD56+NK均明显升高(P<0.05),而CD8+、CD4+CD25+Treg明显降低(P<0.05);TNF-α、IFN-γTh1类细胞因子明显升高(P<0.01),而FGF-β明显下降(P<0.05);③除一过性的发热、乏力外,未出现其他不良反应.结论 晚期难治性肿瘤患者,采用活化haplo-HSC治疗可以增强自身免疫功能,提高生存率和牛活质量,并且有良好的耐受性.
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microRNA在造血和造血系统肿瘤中的作用
microRNA(miRNA)是一种内源性、广泛存在于真核生物中的单链小分子RNA,其大小约为21～23个核苷酸,不能编码蛋白质,可以在转录后和翻译水平上影响基因的表达.miRNA在多种生命过程中发挥着作用,miRNA在特定的细胞或组织、时间、发育阶段才会表达,提示它对组织的发育有着潜在的重要作用.近年来发现miRNA在造血的多个方面起着重要的作用:如造血干细胞自我更新、增殖、分化和凋亡,以及免疫细胞的产生、分化和发挥功能[1-2].现将miRNA在造血和造血系统肿瘤中作用综述如下.
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逆转录病毒介导DNA修复蛋白在人骨髓细胞中的表达和抗性研究
目的增强造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因的特性和在造血细胞保护性基因治疗中的作用和意义.方法应用RT-PCR从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,将其克隆于pGEM-T质粒载体并构建了逆转录病毒载体G1Na-MGMT,应用脂质体Lipofect AMINE基因转移法将后者导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,以BCNU加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染K562细胞和人造血细胞.应用PCR,Southern blot,RT-PCR,Western blot及MTT法检测人MGMT基因在细胞中的转移和表达.结果酶切鉴定及DNA测序证实其MGMT cDNA克隆的正确性,脂质体介导方法成功将其导入病毒包装细胞,BCNU加压筛选和乒乓感染法使病毒效价达8.6×106 CFU/ml,逆转录病毒载体介导的MGMT基因在K562细胞及人造血细胞中获得有效转移和表达.结论 MGMT耐药基因的成功克隆并导入骨髓造血细胞且获高效表达对开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础.
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腺相关病毒载体介导造血干细胞基因转导的策略
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)已被广泛用作基因治疗的载体.本文就提高AAV载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下.
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几种细胞因子对人脐血CD34+干细胞在体外诱导扩增为树突状细胞的研究
多种疾病用树突状细胞(dendritic cell, DC)作免疫治疗具有一定的疗效.由于DC在人体组织中含量甚微,限制了DC的研究及临床应用.因此如何获得足够的成熟DC便成为DC广泛应用的关键技术问题.我们比较了不同细胞因子组合对脐血CD34+造血干细胞在体外诱导扩增为DC的效率及功能的影响,提供一种体外获得大量成熟DC的有效途径.
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类风湿性关节炎造血干/祖细胞Wnt5a、β-catenin基因表达的研究
类风湿性关节炎( rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性破坏性关节炎为主要特征的系统性自身免疫病，其发病机制尚不清楚。近年来发现，RA患者造血干细胞/祖细胞( hematopoietic stem/progenitor cell，HSC/HPC)增殖能力受损，Wnt信号途径是调控HSC/HPC增殖的重要信号途径，可能参与其调节。本研究旨在对RA患者中外周血CD34+ HSC/HPC中Wnt5a、β-catenin mRNA的表达进行研究，了解Wnt信号途径分子基因表达的异常，为认识RA发病机制在HSC/HPC中的异常提供依据。
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P-gp对树突状细胞从皮肤迁移至引流淋巴结的影响
细胞膜P-糖蛋白(P-gp,P-glycoprotein)是多药耐药(mdr)基因表达产物,广泛分布在各种排泄器官包括肠道、肝、肾等上皮细胞,脑及胎盘血管内皮细胞、造血干细胞及外周血细胞的细胞膜上.人类mdr1基因,小鼠mdr1a基因表达产物与多药耐药有关.目前,有关P-gp的研究多集中在肿瘤化学治疗的药物抵抗方面,对其在免疫调节中的作用还不清楚.本文用FVB(H-2q)野生型(FVB/N)与FVB mdr1a敲除(mdr1a-/-)突变型小鼠,探讨P-gp对树突状细胞(DC)从皮肤向引流淋巴结迁移的影响.
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中国北方汉族人群强直性脊柱炎与HLA-B27亚型关联性研究
强直性脊柱炎(AS)患者131例,根据患者民族、籍贯挑选出北方汉族群体,临床均符合1984年AS纽约修订诊断标准.男女比例2.68:1,年龄5～69岁,平均25岁;采用微量淋巴细胞毒实验,筛选出118例HLA-B27阳性样本;正常对照组,从4202名中国北方汉族群体,主要包括北京、河北、河南、山东、辽宁、黑龙江、山西、陕西等近10个省市造血干细胞供者中,采用流式反向PCR-SSO(One Lambda RSSOIA,RSSO1B,RSSO2B1)方法检测出150名HLA-B27阳性样本.采用PCR-SSP方法,以中国北方汉族HLA-B27(+)的AS患者为研究对象,150例北方汉族HLA-B27(+)正常健康人为对照,对B27基因亚型与AS关联性进行分析.
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银屑病患者骨髓CD34+细胞Notch受体的表达
Notch信号传导通路广泛参与了包括造血干细胞在内的诸多干细胞的发育分化过程,对干细胞状态的维持和终末分化的方向等起着决定性的作用.在造血细胞的发育过程中,Notch受体1和2不同程度地表达以及被不同的配体活化决定了造血十细胞向淋巴细胞系或髓细胞系分化.为进一步研究Notch信号通路是否参与了银屑病的发病过程,本研究采用半定量RT-PCR法检测了24例寻常型银屑病患者和18例正常对照骨髓CD34+细胞两种Notch受体mBNA的表达情况.
