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痕量小鼠骨髓造血干细胞移植体系的建立
目的:建立痕量小鼠骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植体系.方法:利用ESLAM(CD45+ EPCR+ CD150+ CD48-)组合流式分选成体GFP/CD45.2小鼠骨髓细胞与保护细胞(CD45.2小鼠),共同移植给致死剂量照射的受体小鼠(CD45.2小鼠),分析移植后不同时间点,受体小鼠外周血嵌合以及其重建效率和谱系分化情况,随后处死受体小鼠,获取骨髓、胸腺、脾脏和外周血等组织的细胞,检测各组织嵌合情况.结果:移植后受体小鼠外周血结果显示第4周之后重建效率为100％,GFP+细胞在各系细胞(髓系、红系、B细胞、T细胞、巨核)中不同时间点的比例不同,且各系重建水平的变化趋势不同;6个月之后各组织(外周血、骨髓、脾脏、胸腺)嵌合情况显示外周血红系和巨核细胞中有较高比例GFP+细胞,且在髓系和淋系细胞中无GFP+细胞,而骨髓的髓系细胞含也有较高比例GFP+细胞,脾脏中的B细胞也有较高比例的GFP+细胞,胸腺中的T细胞也含有较高比例GFP+细胞.结论:ESLAM组合能够较高效率的富集具有长期重建能力的HSCs;这群细胞移植后6个月外周血结果提示可能具有红系和巨核分化倾向.
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胚胎期造血干细胞来源及其调控
胚胎干细胞是体内各种组织包括造血组织干细胞的来源,在胚胎干细胞向造血干细胞的分化及造血干细胞自身的发育过程中有着复杂的基因调控.原始造血产生于卵黄囊已被普遍认可,但永久造血产生于何处仍有争论.目前认为,至少有两个独立的部位与永久造血有关,即卵黄囊和胚内的PAS/AGM区.对胚胎期造血及其调控的研究不仅有助于探明某些血液病的发病机制,而且在基因治疗和造血干细胞工程方面也将具有重大作用.
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我国造血干细胞基础研究的新进展兼论干细胞可塑性
1995年以来我国造血干细胞工程与相关的生物学领域的研究发展迅速.有关造血干/祖细胞基因表达的研究,上海国家人类基因组研究中心陈竺、陈赛娟等为正常和急性白血病人骨髓造血干祖细胞cDNA文库的基因表达建立了一套先进的工作体系.他们在许多白血病细胞系的干/祖细胞中发现了300个新的相关基因.中山大学医学院李树浓、黄绍良等从人的桑葚期胚胎干细胞成功地诱导出造血细胞等.北京输血研究所裴雪涛等从成人和胎儿的骨髓分离出成年源干细胞,又进一步诱导分化为骨、软骨、脂肪和神经原细胞等.他们成功地构建了胎儿和成人间充质干细胞cDNA扣除文库,获得了胎儿和成人间充质干细胞的差异表达基因及在胎儿特异表达基因.中国医学科学院天津血液学研究所、国家血液学重点实验室赵春华等证实从胚胎胰腺、骨髓和肝脏中都可以分离出人间充质干细胞,又证明G-CSF可以使输注的间充质干细胞在体内促造血重建.北京基础医学研究所毛宁等的实验不支持间充质干细胞可以"横向分化".近他们发现小鼠胚胎干细胞的体外分化重现了胚胎早期造血发生的生物学程序以及Smad5基因调控在胚胎造血发生中的必要性和多样性,又表明其上游配体TGF-beta家族分子在胚胎发生中的作用和特点.本文针对干细胞可塑性研究作了评论.国际上曾风靡一时的"横向分化"有关的实验都没有用完全纯化的胚层干细胞或组织干细胞来证实.然而,完全纯的胚层或组织定向的干细胞克隆是无法制备的.成年或胎儿全身各类组织中混有一些定向某胚层的或某组织的干细胞,甚至还混有桑葚胚干细胞.它们是胚胎发育过程的每个阶段中停止参与胚胎发育而残留下来的.它们在体内处于静止期,寿命长,长期存留在成人的各种组织中.各胚层和组织干细胞混杂在一起,它们都没有特异的形态、表型和功能,无法分离纯化,甚至和成人组织细胞也很难分开.它们在体外实验适当的条件诱导下可分化为各种组织细胞.在那些想证明组织干细胞"横向分化"的实验中,都无法排除上述可能.本专论指出,只有桑葚胚干细胞是全能的胚胎干细胞,具有向各个胚层分化的潜能,即具有全能分化的可塑性.当它发育成为各个胚层的或各种组织的干细胞时,它的分化潜能只限于本胚层或本组织,不能向其它胚层其它组织分化.本专论又指出间充质干细胞的制备过程很长,经过许多次的换代.等到出现许多分化抗原标志时,已经是后代的各种不同的成熟间充质细胞了.当然,它们的存在可证实初培养的是间充质干细胞.大量扩增后所获得的集落主要是各种成熟的间充质细胞,其中也包含一些未参与分化的间充质干细胞和中胚层干细胞.间充质干细胞和造血干细胞都是来自中胚层.然而它们都是培养中的贴壁细胞,无法区分也无法分离它们.因此在实验中无法排除所制备的间充质干细胞样品中,绝对没有中胚层或其它胚层干细胞的存在.至今,完全纯化的间充质干细胞是不可能制备的.所以,很可能从间充质干细胞体外诱导出各类不同的,甚至内、外胚层的组织细胞,切不可轻率地推论为"横向分化".临床支持造血干/祖细胞移植的,主要是成熟而有调控功能的各种间充质细胞.总之,"横向分化"等的推论缺乏实验证据,在生物自然界和人类疾病史中都找不到佐证.想要推翻经无数科学实践充分证明了的细胞遗传学的基本原理,必须在生物自然界找到非常充足的科学证据.
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造血干细胞研究发展历史引发的思考
本文简要地回顾了世界干细胞研究数十年的历史经过.它的原始研究是为了解决二次大战末在日本两次核爆炸中所见的致死性造血损伤,这也说明世界干细胞研究为什么从造血干细胞开始,而且人们长期不关心非造血干细胞在体内是否存在.20世纪50-60年代一些聪明设计的动物实验有力地暗示造血干细胞在体内的存在,动物研究又证实正常骨髓可以修复已严重破坏的骨髓,于是人们开始相信骨髓移植就是造血干细胞移植.培养造血祖细胞集落的陆续发现证明造血祖细胞的存在.直至上世纪90年代,有了NOD-SCID或羊胎等体内检测造血干细胞的可靠方法之后,才划清了造血干细胞和祖细胞的界限.本文列举了许多实例,说明实验血液学和临床血液学发展的互动性,以及其它生物学和技术的进步,尤其是免疫学和分子生物学的进步,极大地推动了干细胞基础研究和临床干细胞移植的发展.比如HLA、单克隆抗体、DNA分子克隆、基因重组工程技术以及近年发展的生物信息学、基因组学、蛋白质组学、干涉RNA、干细胞工程技术等,使干细胞基础和临床研究进入了21世纪的新时代.免疫治疗、间充质干细胞和干细胞工程的发展,结合用于造血干细胞移植,使细胞治疗多元化成为本世纪发展的新动向.本文着重地介绍了干细胞研究的每一步发展都同时出现认识上的误区,以及给干细胞研究带来了挫折.一个误区的澄清常常历时20甚至40多年之久.例如造血干细胞与祖细胞的区分;造血干细胞体外扩增研究在世界各国注定的失败;移植脐血缺乏的是造血干细胞,还是祖细胞;多数白血病是否起病于造血干细胞;以造血干细胞是否是基因治疗中佳的外源基因载体;又如干细胞工程能否克隆实质脏器等等.在成体组织内存在成体干细胞是21世纪划时代的伟大发现,却也带来了误区和风波.本文重点分析了在成体干细胞发现的同时为什么会出现横向分化、去分化等缺乏科学根据的假说,以及部分同行视线混乱的根源与教训.文章指出误区的发生是由于缺乏实践和认识的片面性造成的,科学实践是检验和纠正认识片面性的唯一途径.整个干细胞研究的发展历史正是一个不断纠正认识误区的过程,也是必由之路.
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成体稳态造血的维持——造血干细胞还是造血祖细胞?
造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC) 一直被认为处于造血级联的顶端,通过维持自身的自我更新并逐级向下分化成熟,为机体源源不断地提供各种成熟的血细胞.基于HSC移植后分化成熟的变化规律为主要技术方法的研究表明,HSC维持着整个造血系统的稳定,并且在分化发育过程中存在多种不同的模型.然而,从根本上来讲这些研究结果反映的是HSC应对外界压力的应激反应,与正常稳态情况下HSC对于整个造血系统的维持作用并不相同.而新的一系列利用不同的实验模型对造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)在造血稳态维持中的作用进行了研究,发现HPC才是造血稳态维持的“主力军”.本文将对目前存在争议的关于HSC和HPC在稳态造血系统维持中作用的新研究进展作一评述.
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细胞周期抑制剂SNS-032对小鼠造血干细胞生物活性的影响研究
本研究旨在探讨SNS-032(C17H24N4O2S2)对小鼠骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)细胞周期、凋亡、分化及自我更新的影响及其可能的相关机制.利用极限稀释实验检测SNS-032作用前后HSC自我更新的变化,用流式细胞术检测SNS-032作用前后小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+ Sca-1+及Lin-c-kit+ Sca-1-袁型细胞的细胞周期及凋亡的变化,用实时定量PCR检测SNS-032作用前后细胞周期相关基因、凋亡相关基因及HSC自我更新相关基因mRNA表达量的水平.结果显示,SNS-032处理后,小鼠骨髓细胞中HSC的自我更新能力没有明显变化；加SNS-032处理后,小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+ Sca-1+表型细胞的细胞周期无统计学意义的变化(P＞0.05),小鼠骨髓Lin-c-kit+ Sca-1-表型细胞的G1期细胞增多(P＜0.05)；小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+ Sca-1+表型细胞和Lin-c-kit+Sca-1-表型细胞的细胞凋亡增多,与对照相比均无显著性差异(P＞0.05).小鼠骨髓细胞经SNS-032处理后,HSC周期相关基因CDK1、CDK2、CDK7、p27的表达量均明显降低(P＜0.05),而CDK4,CDK6,p21,p18,p19,p16的表达与对照组相比没有明显变化(P＞0.05).凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Puma和p53表达量与对照组相比没有明显区别(P＞0.05),与干细胞自我更新相关的基因中Bim,Sall4,Notch1表达量升高,但与对照组相比没有显著性差异(P＞0.05).结论:SNS-032没有明显的抑刺正常造血干细胞自我更新、分化作用,而且SNS-032没有明显的诱导正常造血干、祖细胞的凋亡作用.
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脐血造血干/祖细胞部分归巢受体功能缺陷的研究
本研究旨在了解来源于脐血造血干细胞表面部分归巢受体(homing receptor)的功能缺陷并探讨体外干预的效果和可行性.用流式细胞术对来源于脐血的CD34+造血干/祖细胞表面的P、E选择蛋白配体活性基团表达、CD26的表达及活性进行检测,同时检测骨髓和外周血作为对照.采用岩藻糖基转移酶体外处理脐血CD34+造血干/祖细胞并检测其表面选择蛋白配体活性基团的表达水平.结果表明,CD26在脐血、骨髓及外周血的CD34+造血干/祖细胞表面的表达率分另q为:(7.62±0.63)%,(6.35 ±0.89)%和(6.18±0.91)%(P>0.05),其活性分别为:67.15 U/1 000个细胞(1 U=1 pmol/min),26.85 U/1 000个细胞和20.95 U/1 000个细胞,脐血CD34+造血干/祖细胞表面CD26的活性明显高于其它两者(p<0.001).P选择蛋白配体活性基团在脐血、骨髓和外周血CD34+造血干/祖细胞表面的表达率分别为:(83.46±6.33)%,(15.65±0.89)%和(80.17±6.85)%;E选择蛋白配体活性基团的表达率为:(25.31 ±1.03)%,(26.34±0.89)%和(29.79 ±1.78)%(P>0.05).脐血CD34+细胞体外行岩藻糖基化工程后,E选择蛋白配体活性基团表达率由(25.31±1.03)%提高至(63.23±1.08)%.结论:3种不同来源CD34+造血干/祖细胞表面的CD26分子表达无明显差别,但其活性不一.脐血的CD34+造血干/祖细胞CD26活性高,骨髓的次之,外周血的低.P选择蛋白配体活性基团在脐血及外周血CD34+造血干/祖细胞表面的表达无明显差别,但在骨髓干细胞表面表达偏低.体外经岩藻糖基化工程处理的脐血CD34+造血干/祖细胞可明显上调其表面E选择蛋白配体活性基团的表达.
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不同氧浓度培养对小鼠骨髓造血干细胞生物活性的影响
本研究模拟人外周血造血干细胞(HSC)移植中HSC所经历的氧环境,研究不同氧浓度对小鼠骨髓HSC生物功能的影响及可能机制.采用体外扩增实验、定向分化实验、细胞周期分析、活性氧测定及亚致死量射线照射小鼠骨髓原始Lin - c-kit+ Sca-1+ HSC移植等方法,分别检测了Lin - c-kit+ Sca-1+ HSC的扩增能力,细胞周期,活性氧水平及造血重建能力.结果表明:低于常氧浓度,特别是乏氧的氧环境能降低活性氧的产生,增强原始骨髓HSC体外扩增能力,增加红系集落(BFU-E)、粒单集落(CFU-GM)、红系粒单系巨核系集落(CFU-GEMM)的数量,维持较多的HSC处于G0/G1期,进而明显促进移植后小鼠的脾集落(CFU-S)生长及提高移植小鼠存活数量.而暴露于常氧、不恒定且氧浓度变化剧烈的氧环境中的骨髓HSC能产生较高水平的活性氧,上述功能指标都较低.结论:骨髓HSC的活性氧水平与周围氧环境中氧浓度水平及稳定性密切相关,高水平的活性氧损害骨髓HSC的功能.在恒定的较低浓度的氧环境下培养及应用抗氧化剂对于骨髓HSC移植可能更有益.
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DAPT对小鼠造血干细胞生物活性的影响
本研究探讨DAPT(N-[ N-(3,5-difluorophenacetyl-L:-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester)对小鼠骨髓造血干细胞( HSC)细胞周期、凋亡、分化及扩增的影响及其可能的相关机制.运用实时定量PCR检测DAPT1 μmol/L作用前后细胞周期相关基因p18、p21、p37、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA表达水平及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、mcl-1、Bax、Bim、p53、Puma mR NA表达量的水平；用流式细胞术检测DAPT作用前后小鼠骨髓细胞Lin - c-kit+ Sca-1+及CD34 - Lin - c-kit+ Sca-1+表型细胞的细胞周期及凋亡的变化；用单细胞培养检测DAPT作用前后单个HSC分化的变化；用长周期培养实验检测DAPT作用前后HSC扩增能力的变化.结果显示,Lin- c-kit+Sca-1+表型细胞经DAPT处理5d后,小鼠骨髓细胞中细胞周期相关基因CDK1、CDK2、CDK4、CDK6及27的mRNA表达量较对照组明显升高(P＜0.01 - P＜0.001),p18和p21表达量明显降低(P＜0.01 -P ＜0.001)；凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、p53、Puma表达量较对照组明显升高(P ＜0.01 -P ＜0.001),Bim表达量明显降低(P＜0.001),Mcl-1的表达量无差异.加DAPT处理5d后,小鼠骨髓细胞Lin- c-kit+ Sca-1+表型细胞的细胞周期的变化无统计学意义(P＞0.05),小鼠骨髓细胞CD34 - Lin- c-kit+ Sca-1+表型细胞的G0期的细胞减少,G1期的细胞明显增多(P＜0.05),处于S、G2、M期的细胞数量的变化无统计学意义(P＞0.05)；小鼠骨髓细胞Lin - c-kit+Sca-1+表型细胞和CD34 - Lin - c-kit+ Sca-1+表型细胞的细胞凋亡增多(P＜0.05).单细胞培养10 d实验显示,每板形成的克隆数、每孔平均细胞数的变化及DAPT对单个造血干细胞分化影响的差异均无统计学意义(P＞0.05).DAPT处理3d后,小鼠骨髓细胞中HSC的扩增能力下降.结论:DAPT可加速小鼠骨髓细胞CD34 - Lin - c-kit+Sca-1+表型细胞的耗竭,促进小鼠骨髓细胞Lin - c-kit+ Sca-1+及CD34 Lin c-kit+ Sca-1+表型细胞的凋亡,降低小鼠骨髓细胞中HSC的扩增能力,但对单个CD34 Lin c-kit+Sca-1+表型细胞的增殖及分化无明显影响.
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离体造血干细胞活力维持措施研究
目的:探索离体造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)活力维持的相关措施,为超远距离转运非血缘HSC提供技术支持.方法:外周血造血干细胞(peripheral blood hematopoietic stem cell,PBHSC)采集物按不同分组要求给予相应处理后,于4℃冰箱保存,并分别于0、24、48和72 h检测CD34+细胞比例、相对细胞活性、相对细胞增殖率、相对集落形成率、氧分压以及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS),另设未经处理的PBHSC作为正常对照组.结果:CD34+细胞比例在72 h内未检测到变化.对照组随着保存时间的延长,相对细胞活性、相对细胞增殖率和相对集落形成率均逐渐下降(r=-0.796、r=-0.883和r=-0.815).血浆稀释、抗氧化剂和充氧均能在一定程度上提高相对细胞活性和相对细胞增殖率,但充氧可降低相对集落形成率.2种或3种因素联合显示出更强的保护作用.细胞内ROS水平随着保存时间的延长而逐渐下降,充氧在提高氧分压的同时,也增加细胞内ROS水平,加入抗氧化剂可降低ROS水平.结论:CD34+细胞百分比不能作为细胞活力观察指标.血浆稀释、充氧和抗氧化剂可提高PBHSC存活和活力,但充氧可增加细胞内ROS水平,不利于PBHSC集落形成能力维持.多因素联合可更好地维持细胞活力.
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Notch配体的原核表达与纯化及其对四氯化碳损伤后造血的影响
目的:通过原核表达并纯化靶向内皮细胞的小鼠Notch重组配体mD1R蛋白,观察其对四氯化碳损伤后造血的影响.方法:PCR克隆并构建pET22b(+)-mD1R表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导,镍珠亲合层析纯化,SDS-PAGE确认目的蛋白表达.应用流式细胞术、细胞粘附实验、免疫荧光染色及实时定量RT-PCR检测蛋白的内皮靶向性和Notch激活程度.建立四氯化碳损伤小鼠模型,应用流式细胞术观察mD1R蛋白对造血干细胞(HSC)、髓系和淋系细胞的影响,应用磁珠分选Lin-Scal-1+ c-Kit+细胞并分析细胞周期的变化,RT-PCR检测IL-10的表达.结果:成功克隆并构建原核表达载体,获得高纯度且有生物学活性的mD1R重组蛋白.mD1R能激活四氯化碳损伤小鼠造血干/祖细胞的Notch信号途径,内源性扩增HSC和长期HSC达2.96倍和6.18倍,促进了髓系祖细胞及髓源性抑制细胞的自体扩增,尤其有利于粒/单核细胞进入血液循环,其具体机制可能与Notch信号促进应激损伤后造血干细胞增殖和上调IL-10表达有关.结论:成功构建了连接造血干细胞和造血微环境的新型Notch配体活性蛋白,证实Notch信号途径可能通过促抗炎因子表达,实现应激损伤后自体造血动员.
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EP4受体激动剂可通过激活Wnt/β-catenin信号途径促进人CD34+细胞体外增殖
目的:探讨前列腺素E2特异性受体激动剂4(EP4A)促进人CD34+细胞体外增殖的可能信号途径.方法:收集中山一院血液科20例健康供者经G-CSF动员后的外周血造血干细胞采集物.应用免疫磁珠法分选出人CD34+细胞,应用CCK8法明确EP4A促进人CD34+细胞体外增殖的佳条件(佳浓度和佳作用时间);在此条件下EP4A作用于人CD34+细胞后,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测β-catenin mRNA水平的变化、Westernblot检测β-catenin和P-GSK-3β蛋白表达情况.结果:EP4A 10 μmol/L、在培养72 h能明显促进人CD34+细胞体外增殖,增殖率为对照组的1.36倍(P =0.002).佳条件EP4A作用于人CD34+细胞后,β-catenin mRNA及其蛋白的表达增高,GSK-3β蛋白的磷酸化增加,而这些作用均可被相应的抑制剂(EP4AA)所拮抗.结论:EP4A可通过激活Wnt/β-catenin信号途径促进人CD34+细胞体外增殖.
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Notch信号通路对VEGF促小鼠胚胎干细胞分化成为造血干/祖细胞的作用
目的:探讨Notch信号通路对小鼠胚胎干细胞(ESC)分化为造血干细胞/祖细胞(HSC/HPC)的影响.方法:小鼠胚胎干细胞体外增殖形成拟胚体;拟胚体体外诱导分化,分为EB组、实验对照组、VEGF、DAPT组、VEGF-DAPT组.流式细胞术检测HSC/HPC表型CD 117+CD34+Sca1+;RT-PCR检测相关基因表达.结果:VEGF组诱导形成的HSC/HPC数目较对照组及EB组明显增多(P＜0.05),提示VEGF促进ESC分化为HSC/HPC;DAPT组诱导分化的HSC/HPC数目较对照组及EB组增多(P＜0.05),提示Notch信号通路阻断剂DAPT促进ESC分化为HSC/HPC;VEGF-DAPT组HSC/HPC较VEGF组HSC/HPC和DAPT组增多(P＜0.05),提示DAPT、VEGF对促进ESC分化为HSC/HPC有协同作用.结论:Notch信号通路在VEGF促ESC分化为HSC/HP中起抑制作用.
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Shh协同骨髓间充质干细胞对造血干细胞增殖的影响
目的:探讨Shh协同骨髓间充质干细胞在体外非接触共培养中对造血干细胞增殖的影响及其机制.方法:采用全骨髓贴壁培养法体外培养间充质干细胞,采用miniMACS磁珠分选仪分选人骨髓CD34+细胞,流式细胞术鉴定两种细胞纯度;将CD34+细胞与MSC分别种至Transwell上下室进行非接触共培养,并添加外源性shh蛋白进行干预.收集非接触共培养d7的样本检测HSC及MSC细胞数量、RNA总量、HSC的ki67的mRNA表达量,以了解HSC增殖情况;测量HSC细胞Tie-2 mRNA表达量和MSC的VEGF、Ang-1 mRNA表达量,以了解细胞因子的表达情况.结果:非接触共培养d7,共培养组2种细胞数量、RNA总量以及ki67、Tie-2、VEGF、Ang-1相对表达量增加并呈以下趋势:MSC+HSC组和shh+HSC纽均高于HSC组(P＜0.05),MSC+shh+HSC组高于MSC+HSC组(P＜0.05).结论:shh可协同MSC体外非接触共培养促进HSC增殖,其机制可能与血管生成因子相关.
关键词： 造血干细胞 间充质干细胞 Sonic hedgehog 血管生成因子 -
氧浓度、活性氧和鼠骨髓造血干细胞生物特性三者之间关系的研究
目的:模似人外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)中PBHSC所经历的氧环境,探讨氧浓度和活性氧对骨髓HSC生物特性的影响.方法:采用活性氧(reactive oxygen species,ROS)测定、体外扩增实验、定向分化实验、细胞迁徙实验、亚致死量射线辐照NOD/SCID小鼠CFU-S和归巢黏附分子表达测定以研究氧浓度及活性氧对小鼠骨髓造血干细胞生物学特性的影响及三者之间的关系.结果:氧浓度低于常氧,特别是乏氧的氧环境能降低ROS的产生,扩增更多Lin-c-kit+ Sca-1+ BM HSC,更有利于各系集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix)的生长,更多地表达归巢黏附分子(CXCR4、CD44、VLA4、VLA5、P-selectin),因而更好地维持了HSC的迁徙能力,并明显促进亚致死量射线辐照NOD/SCID小鼠移植后的脾集落(CFU-S)生长;而暴露于常氧、不恒定且氧浓度变化剧烈的氧环境中的BM HSC能产生较高水平的活性氧,上述特征和功能指标都较低.结论:PBSCT中BM HSC的ROS水平与周围氧环境中氧浓度高低及稳定性密切相关,高浓度氧产生高水平的ROS,高水平的ROS不利于BM HSC生物学特性的保持.在PBHSCT移植前后和体外扩中有目的地应用抗氧化剂和在恒定的浓度较低的氧环境下培养可能对BM HSC移植更有益.
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三七皂苷对人骨髓CD34+造血干/祖细胞的增殖分化作用
为了探讨三七皂苷(PNS)对人骨髓CD34+造血干/祖细胞的刺激增殖和诱导分化的作用,用Dynal M-450 CD34+免疫磁珠阳性选择法获取高纯度的人骨髓CD34+细胞,采用多向祖细胞(CFU-Mix)体外集落培养和流式细胞术检测细胞增殖与分化.结果显示:经免疫磁珠阳性选择,从骨髓细胞收获的CD34+细胞获得率为(1.03±0.74)%,流式细胞术分析纯度达到86%-93%.PNS 10 mg/L和25 mg/L能刺激CD34+细胞增殖,使CFU-Mix集落生成增加,25 mg/L的PNS 对CFU-Mix产率提高(34.7±16.0)%(P<0.01),是促进造血的适浓度;PNS 25,50和100 mg/L时,能诱导CD34+细胞向粒系细胞分化,粒系表面标记CD33+和CD15+的细胞百分比均明显高于无PNS的对照组,而红系细胞表面标记CD71+和G-A+细胞百分比则无明显变化.结论:PNS对CD34+造血干/祖细胞不但具有显著的刺激增殖作用,而且能够诱导其向粒系细胞定向分化的效应.
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VLA-4整联蛋白和造血细胞迁移之间的相关关系研究
为了阐明VLA-4(CD49d)和造血细胞迁移方向之间的相关关系,将重组人G-CSF稀释后注射于小鼠皮下,以流式细胞仪检测不同时间后Sca-1+细胞表面CD49d的表达,并分析Sca-1+细胞计数与CD49d表达之间的相关关系.结果表明,注射G-CSF后骨髓和外周血的CD49d的表达都明显下降,同时在第7-9天外周血Sca-1+细胞数达到高峰,骨髓有核细胞数下降.而随着CD49d的表达回升,外周血Sca-1+细胞数下降,骨髓细胞数却又有增多趋势.结论:VLA-4介导造血细胞与骨髓微环境的粘附,调节CD49d的表达可能会导致造血细胞在骨髓和外周血之间相互迁移.
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多西环素诱导表达下IL-3基因转染小鼠骨髓基质细胞促进造血
本研究探讨用多西环素调控IL-3基因表达的小鼠骨髓基质细胞系对小鼠造血干细胞增殖分化的促进作用.构建含小鼠IL-3基因逆转录病毒载体系统,转染小鼠骨髓基质细胞系,获得QXMSC1Tet-on-IL-3;体外加入多西环素诱导IL-3基因表达并检测IL-3表达活性;观察细胞培养条件上清液对造血祖细胞集落形成单位的作用及QXMSC1Tet-on-IL-3与骨髓细胞共培养对造血干细胞增殖分化的影响.结果表明:多西环素提高了QXMSC1Tet-on-IL-3细胞系IL-3的表达,促进骨髓造血祖细胞克隆形成数;与骨髓细胞共培养可促进造血干细胞的增殖分化.结论:应用多西环素诱导外源基因转染的骨髓基质细胞IL-3的表达,可促进造血.
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含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用
为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎千细胞(embryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14 ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Tran-swell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM + FL诱导和AGM + BM诱导共6组.分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析.结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+ c-Kit+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.O1);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组佳(p<0.01).结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 胚胎干细胞 造血干细胞 -
按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究
为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞( HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠El4ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性.再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到J经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+ FL组,③AGM+ FL+ BM组,④照射对照组,⑤正常对照组.观察各组生存率、造血重建和植入状况.结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+ c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)％；NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成；AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8％、66.7％,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因.结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血.
关键词： 主动脉·性腺-中肾区 胚胎干细胞 造血干细胞 造血发育程序
