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实时无标记细胞检测技术在细胞培养质量控制中的应用
目的 以恶性胶质瘤细胞系(U87)为细胞模型研究实时无标记细胞分析技术(real-time cellular analysis,RTCA)在细胞系培养质量控制中的应用.方法 记录三株不同来源U87细胞系72小时实时细胞增殖曲线,并结合显微镜下细胞的形态学特征,判断细胞系是否发生变异.结果 与购自协和的细胞株U87-1相比,U87-2、U87-3显微镜下形态学发生了明显的改变,同时细胞增殖曲线结果也显示出明显的变异.结论 实验室存在细胞系在培养过程中发生变化的现象,若使用发生变化的细胞,将影响后续的实验结果.通过RTCA技术在细胞系培养时进行质量监控非常必要.
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人脑胶质瘤细胞系MGR2和T98G的生物学特性比较
研究显示人脑胶质瘤的放射敏感性差异较大,原因未明。笔者研究人脑胶质瘤细胞系MGR2和T98G的放射敏感性、细胞周期及细胞周期相关蛋白表达差异,并探索他们之间的关系。
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EGFR反义RNA与p53基因联合转导抑制胶质瘤细胞增殖的体外实验研究
肿瘤的发生、发展是一个多基因参与、多步骤演变的复杂过程.单一的基因治疗的效果并不理想.为此有必要将相互间有叠加或协同效应的基因治疗联合应用.我们发现在恶性胶质瘤中血管内皮生长因子受体(EGFR)过表达及p53基因突变往往并存,为此将反义EGFR-RNA及p53同时转染恶性胶质瘤细胞系,研究两者联合基因转导对胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响,为应用联合基因治疗提供实验依据[1,2].
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脑胶质瘤细胞辐射敏感性参数选择对立体定向放射治疗的影响
立体定向放射治疗(stereotactic radiotherapy,SRT)作为三维适形放射治疗(3dimensional conformal radiation therapy,3DCRT)的特殊形式是目前脑胶质瘤的主要放疗方式,其物理学概念是应用立体定向技术,多以6 MV X射线对胶质瘤进行高精度照射,治疗方式已日趋成熟,但是与之相配合的生物基础方面的研究相对薄弱,制约放疗效果.以往胶质瘤细胞系辐射试验大都采用60 Co深部x射线或γ线,剂量率低、照射时间长、易污染[1-2].本研究以人胶质母细胞瘤细胞系U87和鼠C6胶质瘤细胞系为标本,利用直线加速器6 MV X射线进行照射,测定细胞增殖能力,旨在为脑胶质瘤立体定向放射治疗提供生物学依据.
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激活人胶质瘤细胞CXCR4受体对血管内皮生长因子表达的影响
近年的研究发现,趋化因子基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor 1,SDF1)受体CXCR4在胶质瘤细胞中有表达,但其具体作用和机制及其治疗学意义尚不清楚[1].本研究旨在通过检测3种胶质瘤细胞系的CXCR4表达及其介导的胶质瘤细胞趋化运动、胞内游离Ca2+流动和调节血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达,从而探讨CXCR4的功能活性及其在血管生成中的作用.
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U251和U87细胞的Ezrin蛋白生物信息学分析
目的 应用生物信息学方法分析Ezrin蛋白的功能、结构域,探讨胶质瘤细胞U251和U87浸润性生长的机制.方法 Transwell检测U251和U87细胞的迁移侵袭能力.RT-PCR钓取U251和U87细胞Ezrin基因,TA克隆后测序.应用Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast及blastx)分析Ezrin基因与GenBank登录的Ezin的相似性及氨基酸变异,EBI> Tools> Protein,SWISS-MODEL,SWISS-PDB Viewer分析Ezrin蛋白功能、结构域并建模观察其空间结构及变异氨基酸的位置.结果 Transwell检测结果显示穿过膜底面的U87细胞为(35.5±6.89)个,明显高于U251细胞[(13.3±3.01)个](P<0.001).RT-PCR扩增产物为l 700 bp,与Ezrin基因的大小相符,TA克隆后XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切选取阻性质粒测序.分析显示,U251和U87细胞Ezrin基因序列与GenBank登陆序列的相似性为99%,U251细胞Ezrin基因序列中有一个位点突变,U87细胞有5个位点;U251细胞Ezrin蛋白第407位氨基酸变异,U87细胞Ezrin蛋白第66、258、265和577位变异.EBI>Tools> Protein在线分析Ezrin蛋白功能,与U251细胞Ezrin匹配的蛋白有362个,与U87细胞Ezrin匹配的蛋白却有1 503个;Ezrin的结构分析显示,蛋白质结构数据库PDB中U87细胞Ezrin的数量多于U251细胞,而蛋白质结构等级分类显示的结构域的结构分级和分层分级相同;U87细胞Ezrin的结构域有45个,而U251细胞的Ezrin只有5个.SWISS-MODEL分析,U87细胞Ezrin的3D空间结构有8处与U251细胞的不同,QMEAN4评分UJ87细胞Ezrin低于U251细胞.SWISS-PDB Viewer显示U87细胞Ezrin第258、265位氨基酸相对位于空间结构的内侧.结论 胶质瘤细胞U87的迁移浸润能力强于U251.U87细胞和U251细胞Ezrin基因序列与GenBank登录的相似性达99%,U87细胞Ezrin氨基酸变异多于U251细胞,导致其功能、结构域及空间结构不同.Ezrin蛋白影响U87、U251细胞的迁移和浸润.
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反义封闭胶质瘤端粒酶后c-myc活性研究
本实验探讨了端粒酶有效封闭后,在转录水平是否致使癌基因c-myc的活性下降.1 材料与方法1.1 主要材料阳离子脂质体Dosper(罗氏公司);ELISA端粒酶检验试剂盒(罗氏公司);端粒酶RNA反义硫代磷酸寡脱氧核甘酸(ASODN)(其序列为5'-CTCAGTTAGGGTTAGACA-3'互补于人端粒酶RNA第43号~60号核甘酸序列,上海生工生物工程公司合成);两步法RT-PCR试剂盒(Promega);Trizal(华舜生物);U251胶质瘤细胞系(购自中科院上海细胞生物研究所).
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TERT基因启动子区域突变与神经胶质瘤的相关研究进展
肿瘤的一个重要特性就是肿瘤细胞的无限增殖,这一特性可以通过基因变异实现端粒长度的维持,从而解除细胞周期的限制来实现[1-2]. 对黑色素瘤的研究表明,体细胞端粒长度的维持主要有两种机制:端粒酶依赖性机制( 85%)和端粒酶非依赖性机制(15%) [3] ,后者依靠ATRX和DAXX变异介导的端粒替代延长机制( ALT)实现端粒的延长;而对前者,虽然有研究发现TERT基因启动子区域高甲基化可以引起TERT表达上调从而实现端粒酶的活化[4-10] ,但是更多的研究表明这一机制是通过端粒酶逆转录蛋白基因启动子突变( TERTp-mut)引起端粒酶活化及端粒酶表达上调实现的[6-9]. 近大批学者在神经胶质瘤的研究中发现,无论是胶质瘤标本还是胶质瘤细胞系中均存在TERTp-mut,并认为TERTp-mut参与神经胶质瘤的形成和发展过程[9-13].
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RNA干扰技术在胶质瘤治疗中的给药困难问题及解决方法
脑胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤,是脑内常见的原发肿瘤,约占40%,其生物学特性主要表现为浸润性生长.尤其是高级别胶质瘤,其恶性程度高,肿瘤生长快,患者预后差,目前主要采取手术治疗为主,辅以传统的放化疗治疗,疗效难以令人满意[1].大家都急于寻找一种新的治疗方法解决这个难题.近年来借助RNA干扰(RNAi)技术,胶质瘤基因治疗上取得了一定的成绩,例如通过siRNA干扰信号转导和转录激活因子3(STAT3)在人星形胶质细胞瘤中的表达,有效诱导细胞的凋亡,从而抑制星形胶质瘤的生长,而对正常星形胶质细胞则无诱导凋亡的作用[2];另有研究表明在人胶质瘤细胞系中过表达mir-106a通过调节E2F1抑制胶质瘤细胞生长并诱导其凋亡[4];mir-34a可以通过调节MAGE-A增加髓母细胞瘤的化疗敏感性[3].但是如何将药物安全有效的运至靶细胞,延长药物作用时间,同时避免不良反应的发生,仍然存在着很多困难.本文主要讨论目前RNA干扰技术应用于胶质瘤的临床治疗中,给药过程所存在的困难和可能的解决办法.
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过氧化物酶体增生物激活受体激动剂对脑胶质瘤细胞黏附分子表达的抑制作用
过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)属于核激素受体超家族,目前已鉴别出PPARa、PPARb(又称为PPARδ)和PPARg 3种亚型.本研究旨在观察人胶质瘤细胞系U251在缺氧状态下细胞间黏附分子(ICAM-1)、血管细胞黏附分子(VCAM-1)和E-选择蛋白(E-selectin)表达的变化及PPAR-γ天然激动剂15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)、合成激动剂曲格列酮(troglitazone)对其表达的影响.
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p16基因和地塞米松对人胶质瘤细胞的影响
p16基因是一个多种肿瘤抑制基因,也是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4的抑制因子,它参与细胞周期的调控,并在人类多种肿瘤中有缺失和突变.在胶质瘤中仅纯合缺失就高达90%[1].为了研究外源性p16基因对胶质瘤的影响,我们采用聚合酶链反应(PCR)、逆转录-PCR(RT-PCR)和免疫组织化学方法确定了人脑胶质瘤细胞系SHG-44 p16基因缺失并将人p16基因cDNA哺乳动物细胞表达载体转染SHG-44,观察外源性p16基因对胶质瘤细胞的作用,探讨地塞米松对转染p16基因肿瘤细胞有无更为明显的促分化作用.
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GDNF在治疗颌面部痛的应用前景
胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line2derivedne-urotrophic factor,GDNF)是1993年Lin等从大鼠胶质瘤细胞系1349的条件培养液中分离纯化得到的一种新型神经营养因子,化学结构为糖蛋白,是转化生长因子(17GF-β)超家族中的一个亚族,属半胱氨酸蛋白家族,活性形式为同源二聚体.GDNF的广泛表达提示它可能具有广泛的生物学作用.初发现它具有促进多巴胺能神经元存活的功能,近来研究表明其功能远远不仅限于此,尤其引人瞩目的是它对神经元的保护作用,对神经源性痛的抑痛或镇痛方面也显示出神奇的功效,得到越来越多的关注.
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不同p53功能状态的胶质瘤细胞株放射敏感性研究
目的 探讨不同p53功能状态胶质瘤细胞的放射敏感性.方法 采用射线照射野生型p53基因的U87和突变型P53的U251细胞株.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化,成克隆实验测定细胞存活分数,采用单击多靶模型和线性二次函数模型拟合细胞存活曲线,求出放射生物学参数Do、Dq、N和α、β、SF2值.结果 射线处理后U87细胞亚二倍体峰明显高于U251 (P<0.05),而U251细胞明显阻滞于G0/G1期;突变型p53基因的U251和野生型p53基因的U87细胞的Do值分别为1.0450、0.9652Gy; Dq值分别为1.8544、1.2524Gy;a值分别为0.13、0.525Gy -1;SF2值分别为0.722、0.241.野生型p53基因U87细胞Do、Dq和SF2值均减小,α值增大.结论 野生型p53基因U87可以提高胶质瘤细胞的放射敏感性.
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两种级别胶质瘤细胞系代谢基因的差异表达
目的 基因的异常表达和功能调节在胶质瘤的进展过程中扮演着重要的作用.然而,导致胶质瘤由低级向高级进展的基因通路远未阐明.本实验拟从不同级别的胶质瘤细胞系筛选代谢相关的差异表达基因,为进一步研究胶质瘤进展的机制提供实验基础.方法 以两株不同级别的胶质瘤细胞系(CHG-5,WHO Ⅱ级;SHG-44,WHO Ⅳ级)和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)为实验模型,运用cDNA微阵列技术进行研究.通过芯片杂交,分别检测CHG-5以及全反式维甲酸诱导前后SHG-44的基因表达谱,筛选差异表达基因;随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果.结果本实验发现13个与胶质瘤进展密切相关的代谢基因存在差异表达,它们涉及细胞的糖类和核苷酸代谢.其中,TPI1,BPGM,ALDOA,AKR1B1,LDHA,ADSL,RRM1和NP表达上调,而UGT287,ACAT1,IMPDH2,PRPS1和PKM2表达下调.此外,有5个基因(TPI1,BPGM,ALDOA,LDHA和RRM1)在全反式维甲酸诱导的SHG-44细胞中也出现差异表达,提示这些基因不仅存在于不同级别的胶质瘤细胞系之间,而且存在于分化诱导处理的胶质瘤细胞之间.部分差异表达基因为Northern杂交实验所验证.结论 利用cDNA微阵列技术首次发现有13个差异表达基因与胶质瘤细胞的代谢密切相关,它们可能在胶质瘤的恶性转化和进展中扮演着重要的作用.
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人脑胶质瘤细胞系CHG-5的建立及其生物学特性的分析
目的:建立一人脑胶质瘤细胞系并探讨其生物学特性.方法:取胶质瘤新鲜手术标本,经组织块法培养并克隆、建株,采用光镜、电镜、免疫组化、流式细胞术、染色体分析及异种移植瘤实验对细胞株生物学特性进行观察.结果:原位肿瘤、细胞株及移植瘤标本经电镜证实为星形细胞源性,免疫组化呈GFAP、Vimentin及VEGF阳性,异种移植成瘤率高.与SHG-44细胞比较,GFAP表达强,Vimentin表达弱.结论:CHG-5为一恶性胶质瘤细胞系,且其生物学特性可能与SHG-44细胞有所不同.该细胞高表达血管生成因子.
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胶质细胞源性神经营养因子与脊髓再生
前言胶质细胞源性神经营养因子(glial cell tine-derived neurotrophic factor,GDNF)是在1993年由大鼠胶质瘤细胞系B49中分离的糖基化的二硫键结合的同二聚体蛋白质,含有134个氨基酸,分子量为33~35kD.因其具有7个保守的半光氨酸残基,并且它们在分子出现的位置与转化生长因子-β(transforming growth bctor-β,TGF-β)超家族的全体成员均相同,所以GDNF被认为是TCF-β超家族的一员.人和大鼠的GDNF基因业已被克隆,二者的氨基酸序列有93%的同源性[1].GDNF的受体是多成分的复合物,它是由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)被称为GDNFRα和酪氨酸激酶RET蛋白组成.
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VEGF家庭成员
血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)又称血管通透性因子(vascular Permeability factor,VPF)或血管调理素(Vasculotropin),是一组功能强大且能产生多种效应的细胞因子[1].1989年Ferrara等[2]从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先分离纯化出来的一类糖蛋白,随后在鼠垂体前叶肿瘤细胞系AtT20、人单核细胞、豚鼠瘤、鼠神经胶质瘤细胞系等细胞培养液中也纯化出了VEGF蛋白.它具有增加微静脉、小静脉的通透性,促进血管内皮细胞分裂与增殖,使细胞质钙聚集,诱导血管生成,在胚胎发育、创伤愈合、肿瘤生长与转移过程中起重要作用.VEGF是一个家庭,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盘生长因子(Placental growth factor,PGF)等.
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胶质细胞源性神经营养因子
胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),1933年始由大鼠胶质瘤细胞系B49中分离出来,是一种含有134个氨基酸残基的同二聚体蛋白质,分子量为33-35KD,7个保守的半胱氨酸残基在分子中的位置与转化生长因子-β(TGE-β)超家族相同,因而被看作是TGF-β超家族的一员,人和大鼠的GDNFm93%的同源性[1].GDNF在神经系统中有广泛的分布,RT-PCR法显示GDNF的RNA定位于接受多巴胺(DA)能神经之投射的纹状体、苍白球腹侧区、嗅结节、梨状区,在非DA能脑区的小脑原基、出生前脊髓背梭、新生大鼠丘脑、基底前脑的原代培养也见到GDNF的mRNA反应[2],在成体大鼠的纹状体、海马、皮层、小脑、脊髓、卵巢、骨骼肌、肾上腺也出现GDNF的mRNA阳性反应.